內(nèi)消瘰疬丸(濃縮丸)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

魏立曉，趙建邦，劉蘭生

內(nèi)消瘰癘丸(濃縮丸)，由夏枯草、玄參、大青鹽、海藻、浙貝母、薄荷、天花粉、哈殼(煅)、白蘞、連翹、熟大黃、甘草、地黃、桔梗、枳殼、當(dāng)歸、玄明粉制成。原標(biāo)準(zhǔn)鑒別項收載有熊果酸對照品、玄參對照藥材、大黃對照藥材、甘草對照藥材、當(dāng)歸對照藥材、橙皮苷對照品的薄層色譜鑒別，含量測定項采用薄層掃描法測定夏枯草中熊果酸的含量。為了更有效地控制該藥的質(zhì)量，本實驗對薄荷、連翹進行鑒別，采用高效液相色譜法測定夏枯草中迷迭香酸的含量和玄參中哈巴俄苷的含量。

1 儀器與試藥

日本島津LC-2010A高效液相色譜儀，DikmaC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

哈巴俄苷對照品(批號111173-200604)、薄荷對照藥材(批號120916-200508)、薄荷腦對照品(批號110729-200506)、連翹對照藥材(批號120908-200613)、連翹苷對照品(批號110821-200711)均購自中國藥品生物制品檢定所。迷迭香酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號111871-201202)。內(nèi)消瘰癘丸(濃縮丸)采用2家企業(yè)的6批樣品(蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號12C9-1、12C9-2、12C9-3;蘭州太寶制藥有限公司，批號73110510、73110524、73110603)實驗。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 薄荷的薄層鑒別 取本品粉末10 g，加石油醚(60～90℃)20 mL，密塞，振搖數(shù)分鐘，放置30 min，濾過，藥渣備用，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液［1］。另取薄荷對照藥材0.5 g，加石油醚(60～90℃)5 mL，同法制成對照藥材溶液。再取薄荷腦對照品，加石油醚(60～90℃)制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例及制備工藝，配制不含薄荷的陰性對照品，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法［2010版《中華人民共和國藥典》(一部)附錄ⅥB］實驗，吸取對照品溶液5 μL及對照藥材溶液、供試品溶液、陰性對照液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液-乙醇(1∶4)的混合溶液，在100℃加熱至斑點顯色清晰［2］。見圖1。

圖1 薄荷的薄層鑒別(日光下)

2.1.2 連翹的薄層鑒別 取本品粉末10 g，加石油醚(60～90℃)20 mL，密塞，振搖數(shù)分鐘，放置30 min，濾過;藥渣揮盡石油醚后加甲醇20 mL，密塞，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。再取連翹對照藥材1 g，同法處理，作為對照藥材溶液。另取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例及制備工藝，配制不含連翹的陰性對照品，并照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法［2010版《中華人民共和國藥典》(一部)附錄ⅥB］實驗，吸取對照品溶液10 μL、對照藥材溶液10 μL、供試品溶液 5 μL、陰性對照液各 5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(8∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰［3-4］。供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 連翹的薄層鑒別(日光下)

2.2 含量測定

2.2.1 夏枯草的含量測定

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱DikmaC18(4.6 mm×250 mm，5 μm);以甲醇-0.1%磷酸(35∶65)為流動相，峰形及保留時間均比較理想;檢測波長330 nm;柱溫 30 ℃;流速 1 mL/min;進樣量各 10 μL［5-7］。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 取本品，研細，取約1 g，精密稱定，精密加稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量;超聲處理(功率180 W、頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量;用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得［8］。

2.2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸對照品適量，精密加入稀乙醇，制成含迷迭香酸19.67 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含夏枯草的陰性對照樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.1.5 專屬性實驗 取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液，分別按上述色譜條件進行測定，樣品與對照品在同一保留時間有相同的波峰出現(xiàn)，而空白溶液則無相應(yīng)的波峰(圖3)。

圖3 內(nèi)消瘰癘丸中迷迭香酸高效液相色譜圖

2.2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取上述迷迭香酸對照品溶液 2、4、6、8、10、12、14 μL，按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，以對照品的進樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計算回歸方程:Y=3.560 922 9×10－7X－0.000 376 297，r=0.999 98，迷迭香酸在0.039 34～0.275 38 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.1.7 精密度實驗 分別精密吸取迷迭香酸對照品溶液10 μL，按上述色譜條件測定，各進樣6次，測定峰面積積分平均值為548 398.4，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.49%。表明精密度良好。

2.2.1.8 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液(批號12C9-1)，分別在 0、2、4、6、8 h，按上述色譜條件各進樣1次，每次10 μL，測定峰面積積分平均值為280 451.2，RSD為0.77%。

2.2.1.9 重復(fù)性實驗 精取同一批供試品(批號12C9-1)6份，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件重復(fù)實驗測定，迷迭香酸含量平均值為0.451 88 mg/g，RSD為0.78%。

2.2.1.10 加樣回收率實驗 精取6份(批號12C9-1)已知含量的供試品，精加迷迭香酸對照品，按上述供試品溶液制備和色譜條件測定含量，平均回收率98.33%，RSD為2.27%(表1)。

表1 迷迭香酸加樣回收率實驗

2.2.1.1 1樣品測定 精取6批不同廠家的樣品，按上述供試品溶液制備和色譜條件測定含量，6批樣品 12C9-1、12C9-2、12C9-3、73110510、73110524、73110603 迷迭香酸含量分別為0.450 4、0.456 6、0.466 4、0.422 7、0.360 5、0.375 4 mg/g，均值為0.422 0 mg/g。

2.2.2 玄參的含量測定

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱DikmaC18(4.6 mm×250 mm，5 μm);以乙腈-水(25∶75)為流動相，峰形及保留時間均比較理想;檢測波長280 nm;柱溫30℃;流速 1 mL/min;進樣量各 10 μL［9-12］

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸漬30 min;超聲處理(功率180 W、頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量;用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得［10-12］。

2.2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取哈巴俄苷對照品適量，精密加入80%甲醇，制成含哈巴俄苷15.04 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含玄參的陰性對照樣品，并按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.2.5 專屬性實驗 取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液，分別按上述色譜條件進行測定，樣品與對照品在同一保留時間有相同的波峰出現(xiàn)，而空白溶液則無相應(yīng)的波峰。樣品、對照品、陰性對照高效液相色譜圖見圖4。

圖4 內(nèi)消瘰癘丸中哈巴俄苷高效液相色譜圖

2.2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取上述哈巴俄苷對照品溶液 4、6、8、10、12、14、16 μL，按上述色譜條件分別注入液相色譜儀，以對照品的進樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計算回歸方程:Y=4.384 076×10－7X－0.000 522 333 4，r=0.999 87，哈巴俄苷在0.060 16～0.240 64 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.2.7 精密度實驗 分別精密吸取哈巴俄苷酸對照品溶液10 μL，按上述色譜條件測定，各進樣6次，測定峰面積積分平均值為342 483，RSD為0.42%。

2.2.2.8 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液(批號12C9-1)，分別在 0、2、4、6、8 h，按上述色譜條件各進樣1次，每次10 μL，測定峰面積積分平均值為243 265，RSD為1.44%。

2.2.2.9 重復(fù)性實驗 取同一批供試品6份(批號12C9-1)，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件重復(fù)實驗測定，哈巴俄苷含量平均值為0.266 82 mg/g，RSD為1.43%。

2.2.2.10 加樣回收率實驗 精取6份(批號12C9-1)已知含量的供試品，精加哈巴俄苷對照品，按上述供試品溶液制備和色譜條件測定含量，平均回收率98.26%，RSD為2.17%(表2)。

表2 哈巴俄苷加樣回收率實驗

2.2.2.11 樣品測定 精取6批不同廠家的樣品，按上述供試品溶液制備和色譜條件測定含量，6批樣品 12C9-1、12C9-2、12C9-3、73110510、73110524、73110603 哈巴俄苷含量分別為0.266 3、0.272 5、0.278 1、0.169 8、0.169 5、0.157 7 mg/g，均值為0.219 0 mg/g。

3 討論

薄荷薄層色譜法鑒別參照2010版《中華人民共和國藥典》(一部)薄荷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別(3)項下實驗［1］263，結(jié)合本品的特性擬定如上述方法。

連翹薄層色譜法鑒別參照2010版《中華人民共和國藥典》(一部)連翹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鑒別(2)項下實驗［1］159，以石油醚(30～60 ℃)提取，提取效果不佳，斑點不明顯，結(jié)合本品的特性采用石油醚(60～90℃)，薄層色譜斑點清晰。

實驗前對本品夏枯草中迷迭香酸成分的提取方法進行研究，分別考察了提取時間、提取溶劑和提取方式(超聲提取和加熱回流提取)，最終確定用稀乙醇超聲30 min效果最好。對本品玄參中哈巴俄苷的提取方法也進行了同樣的研究，最終確定80%甲醇浸漬30 min后超聲30 min效果最佳。

原標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項采用薄層掃描法測定夏枯草中熊果酸的含量，中藥材如山楂、熊果、車前、女貞子等藥材都含有該成分［13］，含量檢測專屬性差，故建立新的方法檢測夏枯草中迷迭香酸的含量。玄參是內(nèi)消瘰疬丸(濃縮丸)中的重要藥味之一，玄參中已分離出化學(xué)成分有50多種，主要含有環(huán)烯醚萜、苯丙素苷、有機酸及揮發(fā)油等［14］。本研究采用高效液相色譜法測定環(huán)烯醚萜類成分中的哈巴俄苷，有利于提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

現(xiàn)僅參考對6批實際樣品測定的結(jié)果，并考慮不同夏枯草原料中迷迭香酸含量的差異、大生產(chǎn)過程的損失、制劑中提取轉(zhuǎn)移的因素及實際操作過程的誤差，將其下浮至70%。限度暫定為本品每1 g含迷迭香酸(C18H16O8)不得少于0.30 mg?？紤]不同玄參原料中哈巴俄苷含量的差異、大生產(chǎn)過程的損失、制劑中提取轉(zhuǎn)移的因素及實際操作過程的誤差，將其下浮至70%。限度暫定為本品每1 g含哈巴俄苷(C24H30O11)不得少于0.15 mg。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［2］馬俊奇，春陽.薄荷薄荷桉油片(Ⅰ)中薄荷腦薄層色譜鑒別方法的改進［J］.北方藥學(xué)，2014，11(2):7.

［3］ 陳雪，董軍偉，丁錘，等.芩翹通竅膠囊薄層鑒別［J］.河北中醫(yī)，2012，34(9):1399-1400.

［4］張麗，王凡，劉航.消痤膠囊的質(zhì)量控制［J］.陜西中醫(yī)，2007，28(10):1406-1407.

［5］李錦淼，吳洪文.HPLC法測定腫節(jié)風(fēng)中綠原酸、異嗪皮啶和迷迭香酸的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2014，29(2):125-127.

［6］花汝鳳，姚江雄，黎志堅，等.HPLC同時測定夏桑菊顆粒中迷迭香酸與異迷迭香酸苷的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(24):75-77.

［7］張鳳霞，張宗寶.祛痤膠囊的制備及其哈巴苷和迷迭香酸含量測定［J］.中國藥業(yè)，2014，23(6):31-33.

［8］張?zhí)m珍，秦雯，張小華，等.夏枯草不同部位中咖啡酸和迷迭香酸的含量測定方法研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，30(5):343-345.

［9］陳華國，周欣，趙超，等.HPLC測定養(yǎng)陰清肺顆粒中哈巴俄苷的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16(7):44-46.

［10］魏慶華，王勤.HPLC測定增液承氣口服液中哈巴苷和哈巴俄苷含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(7):81-83.

［11］王建華，謝麗華，劉洪宇，等.玄參不同加工品中哈巴俄苷與肉桂酸的HPLC含量測定［J］.中國藥學(xué)雜志，2000，35(6):375-378.

［12］焦豪妍，楊燕軍，徐吉銀，等.HPLC法同時測定玄參破壁粉粒中哈巴俄苷和肉桂酸的含量［J］.海峽藥學(xué)，2011，23(10):71-72.

［13］ 孟艷秋，陳瑜，王趲，等.熊果酸的研究進展［J］.中國新藥雜志，2007，16(1):25-27.

［14］蔡少青，謝麗華，王建華，等.中藥玄參中哈巴俄苷和肉桂酸的高效液相色譜法測定［J］.藥物分析雜志，2000，20(3):191-194.