響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取蒲公英多糖工藝的研究

郭希娟，馬萍，劉遠(yuǎn)洋

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

蒲公英，別名蒲公草、黃花地丁、黃花三七、婆婆丁等，為菊科屬多年生草本植物。它原產(chǎn)歐洲和北亞，我國(guó)南北各地均有分布[1]。它是中醫(yī)臨床常用的中草藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋、健胃消炎、保肝利膽等功效。蒲公英主要含有多糖、三萜、植物甾醇、綠原酸和黃酮等[2]。目前，研究較多的為蒲公英根部的蒲公英多糖，其具有抗病原微生物、保肝、利膽、抗胃潰瘍、免疫功能等作用[3]。試驗(yàn)以蒲公英為研究對(duì)象，利用微波萃取技術(shù)進(jìn)行蒲公英多糖的提取，探討微波提取的最佳提取工藝，以期提高蒲公英多糖的提取效率。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蒲公英，無(wú)水乙醇，氯仿，正丁醇，蒸餾水等。

1.2 主要設(shè)備與儀器

循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限公司；離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；恒溫水浴箱，蘇州威爾試驗(yàn)用品有限公司；分析天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；微波爐，美的集團(tuán)。

1.3 工藝流程

蒲公英→烘干→粉碎→微波提取→真空濃縮→Sevag法脫蛋白→醇沉→蒲公英多糖

操作要點(diǎn)：

（1）蒲公英粉的制作[5]：洗去干蒲公英的塵土和泥沙，60℃烘干至恒重，用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩備用[4]。

（2）真空濃縮機(jī)的使用：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的溫度控制在50℃，溫度過(guò)低濃縮時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高易劇烈沸騰，增大誤差，每次放在濃縮瓶中的待濃縮液要適量。

（3）Sevag法脫蛋白[6]：向提取液中加入1/4倍體積的氯仿─正丁醇（氯仿：正丁醇=5∶1）溶液，混合20 min，3 500 min·r-1離心5 min，中層白色絮狀沉淀為蛋白質(zhì)，故取上清。

1.4 蒲公英多糖的測(cè)定方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[7-8]：取葡萄糖對(duì)照品100 mg至100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，取該溶液5 mL，至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度。取上述溶液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，至試管中，加適量水使成2 mL，加5%苯酚1 mL，濃硫酸7 mL，50℃水浴15 min，流水冷卻，486 nm測(cè)吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，多糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出回歸方程。A=55.338C+0.059，R2=0.992 0。葡萄糖對(duì)照品濃度在0.002～0.014 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得各樣品的含量，計(jì)算公式如下：

提取物中多糖含量（%）=（樣品中多糖濃度×稀釋倍數(shù)/稱量樣品重量）×100%

1.5 蒲公英多糖提取的單因素試驗(yàn)研究

1.5.1 料液比對(duì)提取效果的影響

取預(yù)處理好的蒲公英粉末3.0 g，放入到錐形瓶中，以料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）5個(gè)水平加入蒸餾水，放入微波爐中，微波功率 300 W，提取15 min，重復(fù)試驗(yàn)3次，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至20 mL，然后進(jìn)行脫蛋白，脫蛋白結(jié)束后加入乙醇，使醇濃度達(dá)到60%，靜止24 h，過(guò)濾，干燥稱重，并繪制料液比對(duì)提取效果的影響曲線圖。

1.5.2 微波提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

取預(yù)處理好的蒲公英粉末3.0 g，放入到錐形瓶中，以料液比為1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，放入微波爐中，微波功率300 W，提取時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min等5個(gè)水平，重復(fù)試驗(yàn)3次，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至20 mL，然后進(jìn)行脫蛋白，脫蛋白結(jié)束后加入乙醇使醇濃度達(dá)到60%，靜止24 h，過(guò)濾，干燥稱重計(jì)算提取率，并繪制微波提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響曲線圖。

1.5.3 微波提取次數(shù)比對(duì)提取效果的影響

取預(yù)處理好的蒲公英粉末3.0 g，放入到錐形瓶中，以料液比為1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，然后放入微波爐中，微波功率300 W，提取15 min，分別重復(fù)試驗(yàn)1、2、3、4、5次，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至20 mL，然后進(jìn)行脫蛋白，脫蛋白結(jié)束后加入乙醇使醇濃度達(dá)到60%，靜止24 h，過(guò)濾，干燥稱重計(jì)算提取率，并繪制微波提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響曲線圖。

1.5.4 醇沉濃度對(duì)提取效果的影響

取預(yù)處理好的蒲公英粉末3.0 g，放入到錐形瓶中，以料液比為1∶10（g∶mL）加入蒸餾水，然后放入微波爐中，微波功率300 W，提取時(shí)間15 min，重復(fù)試驗(yàn)3次，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至20 mL，然后進(jìn)行脫蛋白，脫蛋白結(jié)束后加入乙醇，乙醇濃度分別為55%、60%、65%、70%、75%5個(gè)水平，靜止24 h，過(guò)濾，干燥稱重計(jì)算提取率，并繪制乙醇濃度對(duì)提取效果的影響曲線圖。

1.6 微波提取蒲公英多糖的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用二次回歸通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，以料液比、提取時(shí)間、醇沉濃度為試驗(yàn)因素，分別以X1、X2、X3表示，以多糖回收率y為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化微波輔助蒲公英多糖提取的最佳工藝，其因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼表Table 1 Factors and code levels

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

圖1 料液比對(duì)多糖提取效率的影響Fig.1 Effect of ratio between water and dandelion on the polysaccharide

由圖1可以看出，在一定相同條件下，提取蒲公英多糖質(zhì)量開(kāi)始時(shí)隨著料液比的增大而增加，在料液比為1∶15（g∶mL）時(shí)最高，之后隨著料液比的增加而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)榱弦罕任催_(dá)到1∶15（g∶mL）時(shí)，蒲公英多糖不能完全溶于水中，多糖的濃度隨著料液比的增加逐漸降低。

2.1.2 微波提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

圖2 微波時(shí)間對(duì)多糖提取效率的影響Fig.2 Effect of ultrasound treatment time on the polysaccharide

由圖2可以看出，多糖提取質(zhì)量隨微波時(shí)間的變化規(guī)律，呈現(xiàn)先上升而后逐漸下降的趨勢(shì)，微波作用時(shí)間為15 min時(shí)達(dá)到最大值，提取時(shí)間過(guò)短，多糖溶解不充分，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又容易引起多糖結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而使提取率降低。

2.1.3 微波提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

蒲公英提取多糖質(zhì)量在提取3次時(shí)達(dá)到最大值，之后略有下降，但幅度不明顯。剛開(kāi)始上升可能是因?yàn)殡S著提取次數(shù)的增加多糖的溶解逐漸增加，在提取3次時(shí)多糖基本溶解，以后隨著提取次數(shù)的增加，多糖的提取率不變，同時(shí)次數(shù)太多也會(huì)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)有輕微改變，因此在多因素試驗(yàn)中提取次數(shù)確定為3次。

圖3 微波提取次數(shù)對(duì)多糖提取效率的影響Fig.3 Effect of ultrasound treatment times on the polysaccharide

2.1.4 醇沉濃度對(duì)多糖提取率的影響

圖4 乙醇濃度對(duì)多糖提取效率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the polysaccharide

由圖4可以看出，當(dāng)醇沉濃度為60%時(shí)多糖提取率達(dá)到最大值，以后隨著醇沉濃度的升高多糖提取質(zhì)量逐漸減少?？赡苁歉邼舛鹊囊掖际沟枚嗵堑慕Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變?cè)斐啥嗵腔厥章实南陆怠?/p>

2.2 微波提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

試驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表2，對(duì)表2的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到蒲公英多糖得率與微波處理各因素編碼值的二次方程模型：

其中模型的決定系數(shù)R2=0.922 6，校正的R2= 0.853 0。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experiment design matrix and results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

從表3可以看出所建立的回歸方程是極顯著的（P＜0.01），失擬檢驗(yàn)是不顯著的（P=0.057 5），X1，X3因素的一次項(xiàng)均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），交互項(xiàng)X1X3，X2X3均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），各因素的二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。這表明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，所建立的模型是合適的，可以用此模型對(duì)紅小豆煮制工藝條件進(jìn)行分析測(cè)定。從F值可以看出因素的主次順序?yàn)椋捍汲翝舛龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面分析

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面和等高線，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，從中分析料液比、提取時(shí)間和醇沉濃度對(duì)蒲公英多糖提取率的影響，結(jié)果如圖5、圖6所示。

由圖5、圖6可以看出，料液比和醇沉濃度、醇沉濃度和提取時(shí)間的響應(yīng)曲面均為開(kāi)口向下的凸形曲面，隨著因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。由圖5可以看出當(dāng)提取時(shí)間為15 min時(shí)，蒲公英多糖提取率隨著醇沉濃度和料液比的加大而急劇增加，表現(xiàn)為等高線更為陡峭，且醇沉濃度對(duì)多糖提取率的影響大比料液比略強(qiáng)。當(dāng)醇沉濃度大于63%，液料比大于12.5∶1時(shí)，多糖提取率增加變緩，等高線形狀逐漸向橢圓型發(fā)展，這說(shuō)明醇沉濃度和料液比之間有較強(qiáng)的交互作用。從圖6可以看到，等高線呈現(xiàn)明顯的橢圓形，這表明在固定料液比為1∶15時(shí)，多糖提取率隨著醇沉濃度和提取時(shí)間的加大而急劇增加，但當(dāng)多糖提取率達(dá)到最高值后仍有下降趨勢(shì)，這充分表明了醇沉濃度和提取時(shí)間兩個(gè)因素有一定的交互作用。通過(guò)響應(yīng)曲面的交互效應(yīng)分析，可發(fā)現(xiàn)各因素之間的交互作用對(duì)蒲公英多糖提取率有重要影響。

圖5 微波醇沉濃度和料液比交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.5 Surface and contour plots of the mutual-influence of ethanol concentration and material liquid ratio

圖6 微波醇沉濃度和時(shí)間交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.6 Surface and contour plots of the mutual-influence of ethanol concentration and time

2.2.3 提取工藝條件的驗(yàn)證

為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)，在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化，得到的微波提取蒲公英多糖最佳方案為：料液比1∶17、微波時(shí)間14 min，醇沉濃度64%，提取率75.47%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，以上述條件進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證，重復(fù)3次，實(shí)際測(cè)得的平均提取率為74.34%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為1.49%。

3 結(jié)論

采用微波技術(shù)對(duì)蒲公英中多糖進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)微波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出微波提取蒲公英多糖的較優(yōu)工藝條件為：料液比1∶17、超聲時(shí)間14 min，醇沉濃度64%，提取率74.34%。所得多糖提取率與微波處理各因素變量的二次方程模型回歸極顯著，對(duì)試驗(yàn)擬合較好，有一定應(yīng)用價(jià)值。

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