牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

王嵩，林紅麗，王宇鵬，劉振格，王杰，楊明發(fā)，余麗蕓，侯喜林

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV）引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病[1]。該病是我國(guó)進(jìn)出境動(dòng)物和國(guó)際動(dòng)物貿(mào)易中規(guī)定的重點(diǎn)檢疫對(duì)象[2]。

20世紀(jì)50年代在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)本病并分離到病毒[3]。我國(guó)于20世紀(jì)70年代在進(jìn)口牛群中發(fā)現(xiàn)該病毒，20世紀(jì)80年代分離到病毒。目前我國(guó)一些地區(qū)的牛群中有此病毒感染，且有逐漸上升的趨勢(shì)，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重危害[4]。研究擬根據(jù)GenBank中登陸的IBRV保守基因gB序列[5]，利用本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的IBRV DQ株建立快速、準(zhǔn)確、高效的診斷IBRV的PCR方法，為該病的臨床檢疫工作提供實(shí)用的技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 病毒和細(xì)胞

牛傳染性鼻氣管炎病毒DQ株（IBRV DQ）、牛呼吸道合胞體病毒（BRSV HJ株）和牛副流感病毒3型（BPIV-3 DQ株）由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室分離保存；牛腎細(xì)胞（MDBK）和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑

M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1）、HPR IRNA酶抑制劑（40 U·μL-1）、dNTP（10mmol·μL-1）購(gòu)于Promega公司；TaKaRa Taq酶（5 U·μL-1）、10×PCR Buffer、dNTP（2.5mmol·L-1）、DNA Marker DL2000購(gòu)于TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)于法 國(guó) PAA Laboratories；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于上海華舜生物公司；DEPC水購(gòu)于江蘇省碧云天生物技術(shù)研究所；瓊脂糖購(gòu)于哈爾濱寶泰克生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上發(fā)表的IBRV的gB基因序列（登錄號(hào)：M14106）用Primer5.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物。擴(kuò)增長(zhǎng)度為398 bp。引物由上海生工合成，稀釋成 20μM，-20℃保存。IBRV上游引物：5＇-CGGCGGTCGAGCGGCAAGAG-3＇；下游引物：5＇-AGGCGGGAACACAGCTGGGACAAT-3＇。

1.4 DNA和RNA的提取

采用SDS-蛋白酶K法[6]提取病毒總DNA。沉淀在真空干燥機(jī)中干燥后，用20μL滅菌水溶解DNA沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?。按照Trizol Reagent試劑說(shuō)明提取總RNA，沉淀在真空干燥機(jī)中干燥后加入20μLDEPC處理水重懸RNA沉淀備用。

1.5 反轉(zhuǎn)錄

20μL反轉(zhuǎn)錄體系中，反轉(zhuǎn)錄引物（上游）1μL，模板11μL，70℃作用5 min，冰浴2 min；再加入5× M-MuLV Buffer 4.0μL，10 mmol·L-1dNTP 2.0μL，HPR IRNA酶抑制劑1.0μL，37℃作用5 min；離心后加入M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0μL，充分混勻后離心，42℃溫浴90min，70℃10 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，冰浴2min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR檢測(cè)方法的建立

為了摸索引物對(duì)的反應(yīng)條件，以IBRV的DNA為模板，用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μL，LA Taq buffer 2.5μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）1.0μL，上、下游引物（20μmol·L-1）各1.0μL，DNA模板2.0μL，LA Taq（5 U·μL-1）0.2μL，加ddH2O至25.0μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)（94℃50 s、55℃50 s、72℃50 s），72℃延伸8min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠（EB濃度為 5μg·mL-1）中 200 V電壓下電泳10min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.7 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

將IBRV的DNA作為模板，對(duì)PCR中的引物濃度（3.2、1.6、0.8、0.4、0.2μM）、dNTP濃度（0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01μM）及PCR反應(yīng)的退火溫度（55.1℃、56.0℃、57.2℃、58.5℃、60.1℃、61.6℃、63.3℃、65.1℃和66.2℃）等條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和程序。

1.8 特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)

按照SDS-蛋白酶K法提取IBRV DQ株和MDBK細(xì)胞總DNA；按照Trizol Reagent法分別提取BRSV HJ株，BPIV-3 DQ株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，同時(shí)用滅菌水進(jìn)行空白對(duì)照，采用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系 [反應(yīng)體系為25μL，LA Taq buffer 2.5μL，dNTP（2.5μM）0.5μL，上、下游引物（20μM）各 1.0μL，DNA模板 2.0μL，LA Taq（5 U·μL-1）0.2μL，加ddH2O至25.0μL]和反應(yīng)條件（94℃5min；94℃ 50 s、63℃ 50 s、72℃ 50 s，32個(gè)循環(huán)；72℃8min，4℃保存）進(jìn)行特異性試驗(yàn)。將已知病毒滴度（IBRV 101TCID50·mL-1）的病毒培養(yǎng)物分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后進(jìn)行DNA的提取及PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，以檢測(cè)PCR反應(yīng)的敏感性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)

利用建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)送檢的17份疑似病料進(jìn)行檢測(cè)，17份被檢血清來(lái)自黑龍江省哈爾濱市某牛場(chǎng)。采血時(shí)空腹、頸靜脈采血，采血后成斜面擺放，室溫中待血清析出后收集血清，-20℃保存待檢。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)的優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，最終確定反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94℃5 min；94℃50 s、63℃50 s、72℃50 s，32個(gè)循環(huán)；72℃8 min，4℃保存。以此優(yōu)化條件對(duì)IBRV DNA模板做單重PCR，用10 g·L-1瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，可觀察到398 bp的條帶，大小與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification

2.2 引物濃度及dNTP濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響

分別選擇了引物5個(gè)不同濃度及dNTP 6個(gè)不同濃度來(lái)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明最佳引物終濃度在0.4～1.6μM之間，最佳dNTP濃度在0.01～0.5 mM之間（圖2，圖3）。

圖2 引物濃度的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination of concentration of primer

2.3 退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響

選擇了9個(gè)溫度梯度來(lái)研究退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響，結(jié)果在61.6～66.2℃之間均能擴(kuò)增出明顯的目的帶（圖4）。

2.4 PCR反應(yīng)的特異性

用IBRV的1對(duì)引物分別對(duì)以下病原體檢測(cè)結(jié)果顯示，只有IBRV擴(kuò)增出特異性條帶，而其他對(duì)照組均未擴(kuò)增出明顯條帶（圖5）。

圖3 dNTP濃度的測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determination of concentration of dNTP

圖4 退火溫度的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination of anneal temperature

圖5 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Determination of specificity test

2.5 PCR反應(yīng)的敏感性

取實(shí)驗(yàn)室分離保存的毒株，IBRV DQ株的毒力為101TCID50·mL-1。將病毒培養(yǎng)物進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取稀釋病毒提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該P(yáng)CR反應(yīng)的敏感性為10-3TCID50·mL-1（圖6）。

圖6 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Determination of sensitivity test

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

利用單重PCR對(duì)臨床上的17份疑似病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果IBRV感染有7份為陽(yáng)性，10份IBRV感染為陰性；病毒分離鑒定結(jié)果IBRV感染有5份為陽(yáng)性，12份IBRV感染為陰性，PCR方法靈敏度高于病毒分離方法。

3 討論

PCR方法可以針對(duì)不同的靶序列進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷，在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛應(yīng)用。研究建立的單重PCR方法能在反應(yīng)中對(duì)病料中的IBRV進(jìn)行檢測(cè)，該方法特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便，具有廣泛的應(yīng)用前景。在進(jìn)行PCR反應(yīng)的研究中，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要[6-7]，研究設(shè)計(jì)的引物GC%含量適當(dāng)，這就保證了在恰當(dāng)?shù)耐嘶饻囟认翴BRV的目的片段都能得到有效擴(kuò)增。另外，利用DNAStar對(duì)引物進(jìn)行了同源性和二級(jí)結(jié)構(gòu)等分析，以避免引物之間形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)及引物二聚體而影響擴(kuò)增結(jié)果的判定[8]。引物的濃度在PCR反應(yīng)中十分重要，需要多次試驗(yàn)確定最適濃度[9-10]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)引物濃度減小至0.2μM時(shí)，目的條帶開(kāi)始不清晰；當(dāng)引物濃度增加至1.6μM時(shí)，出現(xiàn)了大量引物二聚體。因此PCR反應(yīng)中引物濃度一定要進(jìn)行優(yōu)化。

在敏感性實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，相關(guān)研究采用測(cè)量DNA濃度來(lái)測(cè)定PCR方法的敏感性，這樣忽略了病毒DNA的提取對(duì)結(jié)果的影響，不足以代表PCR反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)采用測(cè)量陽(yáng)性病毒液TCID50·mL-1的方法，測(cè)定PCR方法的敏感性，可檢測(cè)出IBRV的敏感性為10-3TCID50·mL-1，表明此方法有較高的敏感性。目前ELISA方法常用于IBRV的大批量檢測(cè)，然而所用的試劑盒費(fèi)用高，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，且靈敏度不高[11]。對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該P(yáng)CR方法可從病料中成功檢測(cè)到IBRV，且靈敏度高于病毒分離方法，證明本方法可用于臨床病例的診斷，該方法也可用于IBRV感染的分子流行病學(xué)調(diào)查和疫情監(jiān)控，同時(shí)為研究IBRV感染早期診斷提供了技術(shù)手段，也為診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

［1］殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1997.

［2］張桂紅，童光志，王柳，等.牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR診斷方法的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2000（4）：1-3.

［3］Madin S H.Isolation of infectious bovine rhinotracheitis virus［J］.Science，1956，124：721-722.

［4］李繼昌，童光志，張秀英，等.牛傳染性鼻氣管炎的生物學(xué)診斷與防治［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2001，35（6）：23-27.

［5］王延濤，李國(guó)軍，周玉龍，等.牛傳染性鼻氣管炎病毒分離鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2007，43（5）：30-31.

［6］劉建柱，崔玉東，李鵬，等.多重PCR檢測(cè)豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，23（6）：535.

［7］Henegariu O，Heerema N A，Kumari J，et al.Multiplex PCR：critical parameters and step-by-step protocol［J］.Bio Techniques，1997，23：504-511.

［8］陳雪龍，羅春海，齊長(zhǎng)學(xué)，等.大慶地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離與鑒定［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，25（3）：42-45.

［9］Gilbert SA，Burton K M，Prins SE，et al.Typing of bovine viral diarrhea viruses directly from blood of persistently infected cattle by multiplex PCR［J］.JClin Microbiol，1999，37（6）：2020-2023.

［10］Fulton RW，Doffay JM，Saliki J T，et al.Nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction（RT-PCR）for typing ruminant pestiviruses： bovine viral diarrhea viruses and border disease virus［J］.Can J Vet Res，1999，63（4）：276-281.

［11］徐淑菲，孔繁德，周斌華.牛傳染性鼻氣管炎PC R檢測(cè)方法的建立［J］.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2006（4）：22-23.