長(zhǎng)江流域片國(guó)家區(qū)試大豆品種分子ID構(gòu)建及遺傳多樣性分析

何琳，何艷琴，劉業(yè)麗，楊中路，欒懷海，韓雪，蔣洪蔚，劉春燕，胡國(guó)華

（1.黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心，哈爾濱 150090；2.全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所）

大豆在人們生活中占有重要的地位，是我國(guó)四大油料作物之一，也是蛋白質(zhì)的重要來(lái)源[1]。我國(guó)長(zhǎng)江流域地區(qū)大豆栽培歷史悠久，由于自然地理、氣候條件及輪作復(fù)種制度復(fù)雜多樣，形成了豐富的大豆種質(zhì)資源[2-3]，但對(duì)參加長(zhǎng)江流域地區(qū)國(guó)家區(qū)域試驗(yàn)大豆品種的純度、分子ID及遺傳多樣性分析研究報(bào)道較少，不利于大豆種質(zhì)資源的保存利用、大豆新品種的審定、保護(hù)和選育等研究工作的開(kāi)展。

SSR分子標(biāo)記隨機(jī)、均勻、廣泛地分布于大豆整個(gè)基因組中，且符合作物品種鑒別的4個(gè)基本準(zhǔn)則：環(huán)境的穩(wěn)定性、品種間變異的可識(shí)別性、最小的品種內(nèi)變異和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[4]。高運(yùn)來(lái)等[5]應(yīng)用SSR標(biāo)記構(gòu)建黑龍江13個(gè)育種單位6個(gè)積溫帶的83份大豆品種的分子ID，很多科研工作者對(duì)黃淮夏大豆[6]、河北[4]、湖北[7]、吉林[8]、山東[9]和黑龍江[10]等多個(gè)地區(qū)的大豆品種進(jìn)行了遺傳分析，說(shuō)明SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于大豆品種鑒別、遺傳多樣性分析等方面。

研究用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江流域片國(guó)家區(qū)域試驗(yàn)大豆品種進(jìn)行分子ID的建立及品種間的遺傳多樣性分析，能快速準(zhǔn)確鑒定參試大豆品種，了解該地區(qū)參試大豆品種的遺傳背景，指導(dǎo)大豆品種的選育工作，對(duì)長(zhǎng)江流域地區(qū)大豆種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、審定大豆品種和種質(zhì)資源遺傳評(píng)價(jià)等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用材料為參加2012年長(zhǎng)江流域片國(guó)家區(qū)域試驗(yàn)大豆品種45份（見(jiàn)表1）。由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供，每個(gè)大豆品種取50粒種子，于2012年在黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與SSR分析

參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)大豆品種純度鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法[11]。

1.2.2 SSR引物

根據(jù)大豆公共遺傳圖譜，對(duì)20個(gè)連鎖群上均勻分布的100對(duì)引物進(jìn)行篩選，選擇了8個(gè)連鎖群上擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性高的13對(duì)SSR引物用于PCR擴(kuò)增，根據(jù)SoyBase提供的SSR引物序列（見(jiàn)表2），上海生物工程有限公司合成。

表2 用于PCR擴(kuò)增的13對(duì)引物詳情Table 2 Primers details of PCR amplification

續(xù)表2 用于PCR擴(kuò)增的13對(duì)引物詳情Continued table 2 Primers details of PCR amplification

1.2.3 構(gòu)建大豆參試品種分子ID的數(shù)據(jù)分析

根據(jù)擴(kuò)增片段的大小，對(duì)應(yīng)的分子量從大到小從阿拉伯?dāng)?shù)字的1開(kāi)始記錄，依次為2、3、4……N統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。0表示零等位基因（即該泳道由于基因片段丟失而無(wú)帶），-1表示該品種數(shù)據(jù)由于實(shí)驗(yàn)操作造成缺失，-2表示該泳道出現(xiàn)雜合帶型。采用黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心自行開(kāi)發(fā)的資源特征分析軟件（IDAnalysis 1.0，軟件登記號(hào)：2007SR11870）構(gòu)建大豆品種分子ID。將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為文本文檔后，可直接用該軟件進(jìn)行分析，其實(shí)現(xiàn)結(jié)果的過(guò)程為淘汰缺失位點(diǎn)過(guò)多和引物之間相似系數(shù)過(guò)高的引物后以最少的引物來(lái)區(qū)分品種[6]。

1.2.4 大豆參試品種遺傳多樣性的數(shù)據(jù)分析

按照Nei和Li（1979）的公式：GS=2Nxy/（Nx+Ny）計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)。式中，GS為品種間的遺傳相似系數(shù)，Nxy為2個(gè)品種共有的等位基因，Nx和Ny分別為品種x和y的等位基因數(shù)。遺傳距離（GD）= 1-GS[11]。采用黑龍江省農(nóng)墾科研育種中心自行開(kāi)發(fā)的應(yīng)用遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件（Genetics Statistics 3.0，軟件登記號(hào)為2007SR11872）分析大豆參試品種間的相似系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆參試品種分子ID的建立

品種分子ID分為兩類，一類是利用引物的特異等位基因區(qū)分品種；由于含有特異等位基因的品種較少，很多品種只能用另一類即用多個(gè)引物的等位基因組合來(lái)區(qū)分品種。圖1為引物Satt536對(duì)參試大豆品種擴(kuò)增的電泳結(jié)果，共有4個(gè)等位基因。

圖1 引物Satt536等位基因特征Fig.1 Alleles feature of primer Satt536

利用13個(gè)SSR引物中的6個(gè)引物：Satt138、Satt514、Satt231、Satt380、Satt442和Satt369就可以將全部45個(gè)大豆品種區(qū)分，并獲得唯一的分子ID。其中引物Satt138在材料31中顯示特異條帶1；引物Satt138在材料39中顯示特異條帶7；引物Satt138在材料2中顯示特異條帶12；引物Satt138在材料20中顯示特異條帶13；引物Satt231在材料18中顯示特異條帶1；引物Satt231在材料30中顯示特異條帶4；引物Satt380在材料10中顯示特異條帶1；引物 Satt442在材料 31中顯示特異條帶 6；引物Satt514在材料10中顯示特異條帶4。

依據(jù)引物順序Satt138、Satt514、Satt231、Satt380、Satt442和Satt369，建立了45份大豆品種的分子ID（表3）。

表3 45份大豆參試品種的分子IDTable 3 Molecule ID of 45 tested soybean varieties

2.2 大豆參試品種遺傳關(guān)系分析

利用應(yīng)用遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件Genetics Statistics V3.0計(jì)算45個(gè)大豆參試品種間的遺傳相似系數(shù)，發(fā)現(xiàn)這45個(gè)大豆品種間遺傳相似系數(shù)介于0～1.00，平均相似系數(shù)為0.442 4。結(jié)果表明，長(zhǎng)江流域片2012年國(guó)家區(qū)試大豆品種間遺傳同源性較小，差異性較大。在45個(gè)大豆參試品種中有10組（12份）品種間的相似性高于80%（表4），其中第10組材料臨豆九號(hào)和泗豆209品種間的遺傳關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為1，需要繼續(xù)增加引物加以區(qū)分。

表4 遺傳相似性高于80%的大豆品種及遺傳距離Table 4 Soybean varieties and genetic distance above 80%

續(xù)表4 遺傳相似性高于80%的大豆品種及遺傳距離Continued table 4 Soybean varieties and genetic distance above 80%

3 結(jié)論與討論

分子ID（即分子身份證）是把品種的特征數(shù)字化，即每個(gè)品種都有屬于自己的一套字符串形式的代碼，從而可以簡(jiǎn)單明了的區(qū)分品種。高運(yùn)來(lái)等[5]利用43對(duì)SSR引物對(duì)黑龍江省6個(gè)積溫帶的83個(gè)大豆品種構(gòu)建了分子身份證；李偉忠等[12]利用64對(duì)SSR引物對(duì)257份玉米自交系建立了分子身份證；辜大川[13]和陸徐忠[14]分別用SSR標(biāo)記構(gòu)建了水稻品種的分子身份證，說(shuō)明利用SSR標(biāo)記構(gòu)建作物品種的分子身份證有較強(qiáng)的可靠性，可作為區(qū)分品種的一個(gè)有效的方法。試驗(yàn)中僅用13對(duì)SSR引物中的6對(duì)SSR引物就將45個(gè)參試大豆品種區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明利用SSR標(biāo)記區(qū)分鑒定參試大豆品種是非?？尚械模矠榇蠖蛊贩N審定和申請(qǐng)品種保護(hù)提供理論依據(jù)。

研究應(yīng)用遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件Genetics Statistics V3.0對(duì)長(zhǎng)江流域片國(guó)家區(qū)試大豆品種的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江流域地區(qū)國(guó)家區(qū)試大豆品種間遺傳背景差異較高。在45份參試大豆品種中有12個(gè)大豆品種彼此的遺傳相似性高于80%，可能是由于長(zhǎng)江流域地區(qū)各個(gè)省份自然條件比較相近，相互間的異地引種比較頻繁使得這12個(gè)參試大豆品種遺傳同源性較大。SSR標(biāo)記分析大豆品種的遺傳多樣性可直接反映品種間在基因型上的差異，了解品種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，從而可以快速準(zhǔn)確合理地選擇親本材料，以指導(dǎo)配制雜交組合，進(jìn)而有效的指導(dǎo)長(zhǎng)江流域地區(qū)大豆的育種和生產(chǎn)工作。

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