甘草提取物對5種植物病原菌的抑菌作用

潘翠翠，郭永霞，王麗艷，荊瑞勇，李薇

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院）

甘草（Glycyrrhiza uralensis）為豆科多年生草本植物。甘草在中國有著非常悠久的藥用歷史，《本草綱目》記載甘草能“協(xié)和群品，有元老之功，普治百邪，得王道之化，贊帝力而人不知，斂神功而已不與，可謂中藥之良相也”，現(xiàn)代醫(yī)學也證明了甘草有抗炎、抗氧化、解毒等多種藥理功能[1-3]。在植物保護方面目前已有多人證明，甘草的提取物對于植物病原菌有明顯的抑菌作用。肖鳳艷等[4]采用生長速率法和倍比稀釋法測定辛夷、丁香、商陸、甘草、北豆、蘿藦、艾蒿、天南星8種中藥提取物對薏苡灰霉病菌抑菌作用，指出丁香、辛夷、商陸提取物對薏苡灰霉病菌抑菌率達100%；其次是北豆、蘿藦、甘草、艾蒿的提取物；天南星提取物對薏苡灰霉病菌沒有抑制作用。周銀麗等[5]用生長速率法，測定甘草、洋蔥、胡椒、番茄莖尖和厚樸葉的95%的乙醇提取液來進行石榴枯萎病病菌的抑菌效果實驗，證明5種植物提取液均對有一定的抑制作用。但是均采用單一溶劑的提取物分析提取物的抑菌作用，并未采用多種極性的溶劑對甘草的活性成分進行提取，結(jié)合甘草的活性成分與溶劑極性對抑菌成分進行分析。采用不同極性提取劑對甘草活性成分進行提取，研究甘草提取物對5種植物病原菌的抑菌作用，為植物源農(nóng)藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘草（Glycyrrhiza uralensis），產(chǎn)地甘肅，將甘草用粉碎機粉碎，于50℃烘干至恒重，過50目篩后保存，備用。

1.2 供試菌種

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum），尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），茄鏈格孢菌（Alternaria solani），禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）由黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院植物病理研究室提供。

1.3 甘草提取物的制備及提取率

稱取制備好的甘草材料6份，每份25 g，提取溶劑分別是丙酮、甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇和蒸餾水6種，按1∶10比例分別加入提取溶劑，在25℃和功率為70%超聲下提取1 h，反復(fù)提取3次，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，稱重，計算提取率。每種溶劑提取重復(fù)3次。

1.4 抑菌活性測定

采用生長速率法[6]測定各溶劑提取物對供試病原菌的抑制作用。

準確稱取各溶劑的提取物0.5 g，用丙酮定容[7]至10 mL，此時各溶劑提取物的濃度為50 mg·mL-1，避光保存于4℃下備用。在無菌條件下吸取各溶劑的提取液1 mL，與49 mL冷卻至45℃～50℃的PDA培養(yǎng)基混合均勻，每個培養(yǎng)皿（直徑90 mm）倒入15 mL培養(yǎng)基，制成含不同溶劑提取液的平板，以加入1 mL丙酮為溶劑對照。用6 mm的打孔器切取生長一致的供試病原菌的菌碟，用挑針挑取菌碟，有菌絲的一面朝下，放于含藥培養(yǎng)基的中央，于27℃下恒溫培養(yǎng)，待丙酮對照菌絲長至培養(yǎng)皿直徑3/4時用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，每個處理重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用EXCEL2003和DPS7.05軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草不同溶劑的提取率

不同極性的溶劑對甘草進行提取結(jié)果表明，不同的提取溶劑對甘草的提取率也不同，從圖1中可以看出提取率大小順序為：甲醇＞蒸餾水＞95%乙醇＞正丁醇＞丙酮＞乙酸乙酯。甲醇、蒸餾水和的提取效果最好，提取率分別為24.95%和21.06%。提取率較低的為丙酮和乙酸乙酯，提取率僅為2.37%和2.25%。

圖1 甘草不同溶劑提取物的提取率Fig.1 Extraction ratio of Glycyrrhiza uralensis of the different solvents extraction yield

2.2 甘草提取物對病原菌菌絲生長的抑制作用

6種溶劑的甘草提取物對供試病原菌的抑制作用結(jié)果見表1。方差分析采用的是多重比較中的最小顯著差法（LSD）。從表1中可以看出不同極性的溶劑提取物對5種病原菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。甘草的丙酮和乙酸乙酯提取物對5種病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌作用，除半裸鐮刀菌外均不呈現(xiàn)顯著差異。對尖孢鐮刀菌的抑菌率分別是83.13%和82.64%，對禾谷鐮刀菌的抑菌率分別是78.19%和77.94%，對立枯絲核菌的抑菌率分別是77.12%和75.14%，對半裸鐮刀菌的抑菌率分別是76.18%和71.96%，對茄鏈格孢菌的抑菌率分別是73.73%和74.03%，均達到了70%以上。正丁醇，甲醇，95%乙醇也表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。抑菌效果最差的是水提物，對禾谷鐮刀菌，半裸鐮刀菌不僅沒有抑菌作用，還會促進菌絲的生長，對其他病原菌的抑菌作用也較差，最高的是對茄鏈格孢菌抑菌率，但是也僅為10.15%，明顯低于其他提取溶劑。

表1 不同溶劑的甘草提取物對5種植物病原菌的抑菌作用Table 1 Inhibition effects of Glycyrrhiza uralensis extract of different solvent to 5 plant pathogenic fungi

3 討論

根據(jù)相似相容的原理，不同極性的溶劑能溶解的活性成分也不同。甘草中以黃酮類化合物、三萜類化合物（主要為甘草酸）和甘草多糖類化合物為主要成分[8]。黃酮類化合物是一類具有C6-C3-C6的基本母核，一般難溶于水，易但溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮等有機溶劑；甘草酸主要以鉀，鈣鹽的形式存在，是甘草的甜味成分，易溶于水；甘草多糖不易溶于丙酮和乙醇等有機溶劑，易溶于水。極性較大的蒸餾水提取物對各病原菌的抑菌率最低，中等極性的溶劑乙酸乙酯和中強極性的溶劑丙酮均有良好的抑菌活性，抑菌率顯著高于甲醇、95%乙醇和蒸餾水的提取物。由此可見，甘草中的抑菌活性物質(zhì)的極性處于中等極性和中強極性，用相應(yīng)極性的溶劑即可提取出活性物質(zhì)，丙酮和乙酸乙酯都是較好的提取溶劑，但是提取率最低，分別是2.34%和2.27%，這是可能與由于易溶于丙酮和乙酸乙酯的甘草黃酮類成分含量較低有關(guān)，甘草中黃酮類成分的質(zhì)量分數(shù)為0.5%～4%[9]，用超聲提取方法提取也不能100%提取，不同種植地區(qū)的甘草黃酮類成分含量也不同，所以提取率低于4%。

通過以上分析可以初步推斷甘草中具有抑菌作用的活性成分可能為甘草黃酮類化合物。何璐等[10]測得甘草黃酮對黃瓜枯萎病病菌、水稻惡苗病病菌、小麥紋枯病病菌、辣椒疫病病菌的抑菌作用明顯。甘草中含有的黃酮類成分較多，在從甘草屬植物中分離出的130多種黃酮類及其衍生物中，甙元70多個，這些黃酮類化合物分別屬于黃酮，異黃酮，二氫黃酮，二氫異黃酮，黃酮醇，黃烷酮等衍生物[11]。但甘草中除上述主要成分外還有多種氨基酸，雌性激素，有機酸[12]以及少量的生物堿香豆素[13-14]和木質(zhì)素等。具體是黃酮類化合物單獨作用還是兩種以上有效成分復(fù)配表現(xiàn)出抑菌活性還需進一步的研究。

研究了甘草提取物對5種植物病原菌的抑菌作用，結(jié)果表明甘草丙酮和乙酸乙酯提取物對5種植物病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌作用，以尖孢鐮刀菌最高，而尖孢鐮刀菌是一種廣泛分布的真菌，是許多重要作物的病原菌[15]，其次是禾谷鐮刀菌，立枯絲核菌和半裸鐮刀菌，最低的是對茄鏈格孢菌的抑菌作用，但也達到70%以上。由此可見，甘草具有開發(fā)植物源殺菌劑的巨大潛力，將有抑菌作用的活性成分分離純化，通過現(xiàn)代技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定，再經(jīng)化學合成的方法模擬合成，最后得到高效，安全，經(jīng)濟的新型農(nóng)用殺菌劑。

［1］ 梁冰，楊愛馥，黃鳳蘭.甘草屬（Glycyrrhiza）化學成分及藥理作用研究進展［J］.東北林業(yè)大學學報，2006，37（1）：115-119.

［2］ 于輝，李春香，宮凌濤.甘草藥用作用概述［J］.現(xiàn)代生物學進展，2006，16（4）：77-79.

［3］ 陳紅.甘草藥理作用概述［J］.海峽藥學，2005，17（4）：37-41.

［4］ 肖鳳艷，高郁芳.8種中藥提取物對薏苡灰霉病菌的抑制作用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2012（5）：1784-1788.

［5］ 周銀麗，王衛(wèi)疆，白建波.5種植物提取液對石榴枯萎病病菌的室內(nèi)抑制作用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（11）：5706-5707.

［6］ 吳文君.植物化學保護實驗技術(shù)導(dǎo)論［M］.西安：陜西科學技術(shù)出版社，1998.

［7］ 于洋飛，馬紅，韓玉軍.飛廉提取物對3種蔬菜病原真菌的抑制作用［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40（7）：15-18.

［8］ 胡金鋒，沈鳳嘉.甘草屬植物化學成分研究概況［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1996，8（3）：77-91.

［9］ 孫艷娟.甘草黃酮的分析與膜分離工藝研究［D］.武漢：湖北工業(yè)大學，2008.

［10］ 何璐，王勇，呂躍東.甘草黃酮的提取分離及抗菌活性研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2008，47（2）：217-219.

［11］ 李明.甘草的研究概況［J］.甘肅中醫(yī)學院學報，2000，17（3）：59-63.

［12］ 惠壽年，董阿玲.國內(nèi)對甘草化學成分的研究進展［J］.中草藥，1999，30（4）：313-315.

［13］ 劉勤，劉永隆.黃甘草化學成分的研究［J］.藥學學報，1989，24（7）：525-531.

［14］ 王彩蘭，張如意，韓水生，等.烏拉爾甘草中新香豆素的化學研究［J］.藥學學報，1991，26（2）：147-151.

［15］ 臺蓮梅，鄭雯，靳學慧，等.不同殺菌劑對尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力測定［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2006，18（5）：10-12.