不同豬種背肌中Cst B基因的表達(dá)研究

王文濤，何鑫淼，張冬杰，彭福剛，吳賽輝，劉 娣

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086)

CystatinB(又稱為stefin B)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族Ⅰ(cystatin)中的一類特異性可逆抑制因子[1]，廣泛分布于多種組織中[2]，被認(rèn)為是最重要的胞內(nèi)組織蛋白酶抑制劑之一[3]，由一條長(zhǎng)度約為100個(gè)氨基酸的多膚鏈構(gòu)成，不含二硫鍵和糖基，分子量約11～12 kD[4]。在豬上，CstB基因已經(jīng)獲得全Cds序列[5]。筆者利用已知外顯子序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR的方法對(duì)大白豬、野豬及野家雜交豬背肌組織中CstB基因表達(dá)情況進(jìn)行研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。大白豬、野豬及野家雜交豬，來自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2主要試劑。Trizol Reagent，購(gòu)自Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯，購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖，購(gòu)自西班牙Agarose公司；胰蛋白胨、酵母抽提物、溴化乙錠、氯化鈉、無水乙醇、氯仿、異丙醇、三羥基氨基甲烷、乙二胺四二酸二鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2RT-PCR技術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)豬采取不同品種豬各3頭，

取背肌組織樣品，采用TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)引物F：5′-AGC ACA TCG CCG ACC AGG-3′；R：5′-GGC TTG TTC TCG TGC GGG-3′。反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，40 s；共30個(gè)循環(huán)。再于72 ℃，10 min，4 ℃保存。采用5 μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并以Quantity-One軟件以光密度吸收測(cè)定法進(jìn)行目的基因表達(dá)的定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1總RNA的檢測(cè)結(jié)果提取的總RNA在2%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)，結(jié)果如圖1，驗(yàn)證RNA提取成功。

圖1 組織總RNA電泳結(jié)果

圖2 PCR循環(huán)數(shù)與產(chǎn)量的關(guān)系

2.2循環(huán)參數(shù)的確定PCR擴(kuò)增背肌組織中CstB基因，起始循環(huán)數(shù)從21開始，模板為1 μl PCR產(chǎn)物，每隔1個(gè)循環(huán)將反應(yīng)管拿出1管，直至30個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)后在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，確定循環(huán)數(shù)未達(dá)到平臺(tái)期。圖2表明，循環(huán)參數(shù)為27。

2.3不同豬種背肌組織中CstB基因的表達(dá)結(jié)果采用RT-PCR方法檢測(cè)1日齡、90日齡、180日齡、270日齡、360日齡大白豬，90日齡、180日齡、270日齡、360日齡、420日齡野家雜種豬以及360日齡野豬的背肌組織中CstB基因的表達(dá)情況。圖3表明，背肌中CstB基因的表達(dá)在90日齡的野家雜種豬表達(dá)量最高，其他個(gè)體相對(duì)較均衡。

圖3 Cst B基因在背肌中的RT-PCR結(jié)果

3 結(jié)論與討論

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatins)能夠降低半胱氨酸蛋白酶的功能[6]，進(jìn)而影響干制火腿的松軟度。試驗(yàn)結(jié)果表明，背肌中CstB基因的表達(dá)在90日齡的野家雜種豬表達(dá)量最高，其他個(gè)體相對(duì)較均衡。故從蛋白酶水解的角度來說，90日齡的野家雜種豬利用背肌制作的火腿品質(zhì)高于大白豬背肌制作的火腿。

[1] BRZIN J，TRSTENJAK M，RITONJA A，et al.Cysteine Proteinases and their Inhibitors[M].W.De Guyter,Berlin,NY,1986:443-453.

[2] PENNACEHIO L A，BOULCY D M，HIGGINS K M,et al.Progressive ataxia，myoclonic epilepsy and cerebellar in cystain B-deficient mice[J].Nat Genet,1998，20(3):251-258.

[3] TURK V，BODE W.The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases[J].FEBS Lett,1991,285 (2):213.

[4] BARRETT A J, FRITZ H, GRUBB A,et al.Nomenclature and classification of the proteins homologous with the cysteine-proteinase inhibitor chicken cystatin[J].Bio Chem J,1986，236(1): 312.

[5] 王文濤.豬CstB基因的克隆、多態(tài)性分析及表達(dá)規(guī)律的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[6] LENARCIC B,KRIZAJ I,ZUNEC P,et al.Difference in specificity for the interactions of stefins A,B and D with cysteine proteinases[J].FEBS Lett,1996,395(2/3):113-118.