研究環(huán)孢菌素A對(duì)再障病患骨髓細(xì)胞Fas表達(dá)及凋亡率的影響

劉珂

研究環(huán)孢菌素A對(duì)再障病患骨髓細(xì)胞Fas表達(dá)及凋亡率的影響

劉珂①

目的：研究環(huán)孢菌素A（CsA）對(duì)再生障礙病患骨髓細(xì)胞Fas表達(dá)及凋亡率的影響。方法：從2010年2月-2013年2月，本院共計(jì)48例病患被確診為再障。以數(shù)字法隨機(jī)分成觀察組24例和對(duì)照組24例，對(duì)照組以注射用丹參治療，觀察組在此基礎(chǔ)上另以CsA治療。對(duì)比兩組療效，分析CsA對(duì)于再障病患骨髓Fas表達(dá)情況和對(duì)MNC有關(guān)凋亡率影響。結(jié)果：觀察組總有效率為83.33%（20/24），顯著高于對(duì)照組的37.50% （9/24），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組在治療前后CD34+Fas+的細(xì)胞百分率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組病患骨髓CD34-細(xì)胞的Fas表達(dá)和對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組治療后MNC有關(guān)凋亡率為（2.27±0.74）%，顯著低于治療前的（6.58±2.33）%，以及對(duì)照組治療后的（2.92±1.20）%，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：細(xì)胞Fas異常表達(dá)和再障發(fā)病情況有一定聯(lián)系，以CsA治療再障病患，可明顯降低其骨髓MNC凋亡率，療效顯著，值得臨床推薦。

環(huán)孢菌素A； 再障； 骨髓細(xì)胞； Fas表達(dá)； 凋亡率

再生障礙性貧血是一種骨髓造血干細(xì)胞和/或造血微環(huán)境損傷性血液病。其免疫機(jī)制發(fā)生紊亂損傷，及造血干細(xì)胞和骨髓的微環(huán)境發(fā)生損害等因素均為該病主要機(jī)制[1]。因此在治療該病時(shí)，免疫抑制療法可作為一類(lèi)主要手段。同時(shí)，近年來(lái)有報(bào)道表明，F(xiàn)as/ FasL系統(tǒng)可有效誘導(dǎo)凋亡，其不僅和正常造血相關(guān)，亦和造血病理及生理狀態(tài)相關(guān)，此系統(tǒng)和再障病患免疫發(fā)病有關(guān)機(jī)制有著一定聯(lián)系，有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡的增加是再障疾病重要性病理和生理機(jī)制，但此方面報(bào)道較少[2]。鑒于此，本文通過(guò)以環(huán)孢菌素A（CsA）藥物治療再障病患，分析其對(duì)病患骨髓細(xì)胞Fas的表達(dá)和凋亡率情況影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2010年2月-2013年2月，本院共計(jì)有48例病患被確診為再障。其中男26例，女22例。年齡17～64歲，平均（37.2±2.8）歲。含慢性再障（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為CAA）者24例；重型再障（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為SAA）Ⅰ型者15例，Ⅱ型者9例。以數(shù)字法隨機(jī)分成觀察組24例和對(duì)照組24例。觀察組男13例，女11例，年齡17～63歲，平均（37.1±2.7）歲，CAA者12例，SAAⅠ型者7例，Ⅱ型者5例。對(duì)照組男13例，女11例，年齡18～64歲，平均（37.5±1.7）歲，CAA者12例，SAAⅠ型者6例，Ⅱ型者6例。兩組性別，年齡以及疾病類(lèi)型等方面對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 對(duì)照組以注射用丹參（哈藥集團(tuán)）治療，規(guī)格為2 mL/支，一次用4 mL，治療3個(gè)月。觀察組在此基礎(chǔ)上加用環(huán)孢菌素A（新山地明，瑞士的SADONA公司，規(guī)格為25 mg/粒）。初始劑量是每天2.5 mg/kg，服用3個(gè)月。兩組病患在治療期間需定期檢測(cè)血常規(guī)，以及肝﹑腎功能等。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)張之南主編有關(guān)血液病診療標(biāo)準(zhǔn)判定[3]，分為明顯緩解﹑進(jìn)步和無(wú)效，總有效率=（明顯緩解+進(jìn)步）/總例數(shù)×100%。

1.4 觀察指標(biāo) 分別在治療前以及治療3個(gè)月后采集病患新鮮的骨髓標(biāo)本計(jì)2～4 mL，而肝素抗凝以淋巴細(xì)胞有關(guān)分離液將單個(gè)核細(xì)胞（即MNC）進(jìn)行分離，將細(xì)胞濃度予以調(diào)整到1×107mL，以分析凋亡率和Fas檢測(cè)。CD34和Fas標(biāo)記以直接免疫法進(jìn)行，抗體是抗CD34-PE，及抗Fas-FITC（產(chǎn)于Pharmingen公司）。以流式細(xì)胞儀（FACS Vantage BD公司生產(chǎn)）進(jìn)行測(cè)定。而細(xì)胞凋亡率測(cè)定以Boehringer Mannheim公司所產(chǎn)的原位末端標(biāo)記（即TUNEL）法進(jìn)行。根據(jù)有關(guān)說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行測(cè)定操作，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組療效比較 觀察組總有效率為83.33% （20/24），顯著高于對(duì)照組37.50%（9/24），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.541，P＜0.05）。觀察組明顯緩解4例，占比16.67%，對(duì)照組明顯緩解2例，占比8.33%。

2.2 CsA對(duì)于再障病患骨髓細(xì)胞Fas表達(dá)情況影響兩組治療前后CD34+Fas+的細(xì)胞百分率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，觀察組病患骨髓CD34-細(xì)胞的Fas表達(dá)和對(duì)照組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 CsA對(duì)再障病患骨髓細(xì)胞Fas表達(dá)情況影響（±s） %

表1 CsA對(duì)再障病患骨髓細(xì)胞Fas表達(dá)情況影響（±s） %

+Fas+CD34-Fas+組別 CD34治療前 治療后 治療前 治療后觀察組（n=24） 40.53±7.33 37.92±4.52 51.42±13.44 52.65±10.67對(duì)照組（n=24） 39.08±6.86 38.83±7.89 50.82±14.35 47.83±13.86 t值 0.078 0.490 0.150 1.350 P值 0.483 0.626 0.882 0.184

2.3 CsA對(duì)于再障病患骨髓MNC有關(guān)凋亡率影響 觀察組治療前后MNC有關(guān)凋亡率分別為（6.58±2.33）%﹑（2.27±0.74）%，對(duì)照組分別為（6.46±2.17）%﹑（2.92±1.20）%，觀察組治療后MNC有關(guān)凋亡率顯著低于治療之前和對(duì)照組治療后，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

異常免疫造血抑制是再障最常見(jiàn)的病理生理機(jī)制[4-5]。通常而言，CsA的化學(xué)結(jié)構(gòu)為環(huán)寡肽，由一種真菌產(chǎn)生的具有生理活性的代謝產(chǎn)物，是一種特異性較強(qiáng)的免疫抑制劑[6]。可通過(guò)封閉T淋巴細(xì)胞表面受體，阻斷T移植細(xì)胞活化和增殖反應(yīng)等機(jī)制發(fā)揮作用[7]。CsA作為一類(lèi)免疫抑制劑，其特異性比較高，經(jīng)十一個(gè)氨基酸構(gòu)成環(huán)形多肽[8]。其對(duì)于治療再障而言是一種有效藥物。據(jù)有關(guān)報(bào)道表明，1995年第37屆美國(guó)的血液學(xué)年會(huì)指出，以CsA對(duì)再障進(jìn)行治療，有效率為50%～60%，且病患在血液學(xué)指標(biāo)的改善上通常開(kāi)始于用藥之后3個(gè)月中[9]。故本文選擇在治療前以及治療3個(gè)月時(shí)對(duì)有關(guān)指標(biāo)實(shí)施測(cè)定。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，觀察組總有效率為83.33%，顯著高于對(duì)照組的37.50%。同時(shí)治療后觀察組明顯緩解4例，占比16.67%，對(duì)照組明顯緩解2例，占比8.33%，表明觀察組CsA治療方案療效更佳。符合Xiao等[10]報(bào)道結(jié)果。這可能和CsA可通過(guò)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行抑制，從而促使T細(xì)胞亞群比例產(chǎn)生變化而恢復(fù)造血有關(guān)[11]。

此外，兩組在治療前后CD34+Fas+的細(xì)胞百分率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，觀察組病患骨髓CD34-細(xì)胞的Fas表達(dá)和對(duì)照組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示以GsA治療后，并不影響Fas抗原的表達(dá)。但筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，再障病情的不同，F(xiàn)as表達(dá)結(jié)果亦不盡相同，SAA病患相應(yīng)CD34+Fas+的細(xì)胞百分率會(huì)高于CAA病患，而根據(jù)本院正常體檢者有關(guān)資料，無(wú)論是SAA還是CAA病患，其CD34+Fas+的細(xì)胞百分率均高于健康人群，這也從側(cè)面反映了Fas和再障免疫發(fā)病機(jī)制有一定關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步研究表明，CD34+Fas+的細(xì)胞百分率和骨髓細(xì)胞的凋亡率可呈現(xiàn)正相關(guān)聯(lián)系（SAA病患r=0.624，P＜0.05；而CAA病患r=0.631，P＜0.05）。

筆者在研究中還發(fā)現(xiàn)，觀察組治療后MNC有關(guān)凋亡率為（2.27±0.74）%，顯著低于治療前的（6.58±2.33）%，以及對(duì)照組治療后的（2.92±1.20）%。與朱琳超等[12]報(bào)道一致，表明以CsA治療方案治療再障，可明顯減少骨髓MNC凋亡。這可能是因?yàn)樵僬蠟楣撬璧脑煅δ馨l(fā)生衰竭引發(fā)全血細(xì)胞數(shù)量減少，無(wú)論其初始病因怎樣變化，造血干細(xì)胞的數(shù)量減少即為其基本特征。目前不但已經(jīng)觀察到再障患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群分布異常﹑腫瘤壞死因子和白介素-2等負(fù)調(diào)控因子活性增高等免疫紊亂現(xiàn)象，而且能夠從患者骨髓內(nèi)分離出攻擊CD34+細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞克隆[13]。而CsA能夠降低某些因促凋亡因素而減少損傷骨髓，抑制活化T細(xì)胞有關(guān)功能，減少對(duì)Fas高表達(dá)的CD34+細(xì)胞攻擊，最終對(duì)其有關(guān)造血功能有明顯改善[14-15]。筆者在研究過(guò)程中，以TUNEL方法進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)再障病患MNC的凋亡率整體而言處于增高趨勢(shì)，在治療之后又下降，這證實(shí)細(xì)胞凋亡于再障疾病中的影響作用。需要指出的是，由于研究樣本量較少，所得結(jié)果仍需大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證，進(jìn)而尋找深入因素，為徹底對(duì)再障疾病進(jìn)行治愈而努力奮斗。

綜上所述，細(xì)胞Fas異常表達(dá)和再障發(fā)病情況有一定聯(lián)系，以CsA治療再障病患，可明顯降低其骨髓MNC凋亡率，療效顯著，值得臨床推薦。

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Research on the Influence of Cyclosporin A to Patients with Aplastic Anemia’s Marrow Cells Fas Expression and Apoptosis Rate

/LIU Ke.//Medical Innovation of China，2014，11（16）：063-065

Objective：To study the influence of Cyclosporin A （CsA） to patients with aplastic anemia’s marrow cells Fas expression and apoptosis rate.Method：From February 2010 to February 2013， in our hospital a total of 48 patients were diagnosed with aplastic anemia， who were digital randomly divided into observation group （24 cases） and control group （24 cases）. The control group was treated with salvia injection， the observation group on the basis of it was treated with CsA. To compare the curative effect of the two groups， and analyze the influence of CsA to patients with aplastic anemia’s marrow cells Fas expression and apoptosis rate.Result：The total effective rate of the observation group was 83.33% （20/24）， which was significantly higher than that of the control group 37.50% （9/24）， and difference was statistically significant （P＜0.05）. To compare both the two groups before and after treatment of CD34+Fas+cell percentage， the difference was not statistically significant. To compare the observation group’s Fas expression of bone marrow CD34-cells with the control group， the difference was not statistically significant. The observation group after treatment’s MNC apoptosis rate was （2.27±0.74）%， which was significantly lower than （6.58±2.33）% before treatment， and （2.92±1.20）% of the control group after treatment， the differences were statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：The abnormal expression of Fas has some contact with the incidence of aplastic anemia. Using CsA to treat patients with aplastic anemia can significantly reduce the bone marrow MNC apoptosis rate. It has a significant effect and is worthy of recommendation.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.16.020

2014-04-08） （本文編輯：王宇）

①河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南 洛陽(yáng) 471003

劉珂

【Key words】Cyclosporin A； Aplastic anemia； Bone marrow cells； Fas expression； Apoptosis rate

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of He’nan University of Science and Technology，Luoyang 471003， China