耐STI571的K562細胞株的建立及生物學(xué)特性考察

張瓊王莉莉楊利紅

耐STI571的K562細胞株的建立及生物學(xué)特性考察

張瓊①王莉莉②楊利紅①

目的：建立1株耐STI571的K562細胞，并對其生物學(xué)特性進行研究分析，探討耐藥機理。方法：通過遞增STI571藥物濃度的方法，成功建立1株耐STI571人白血病細胞株K562/R，并采用RT-PCR﹑Western-blot﹑免疫組化﹑基因測序等生物學(xué)手段對其進行耐藥機理進行分析。結(jié)果：K562/R細胞株在STI571濃度高達1 μmol/L水平，仍能穩(wěn)定生長，繁殖旺盛。K562/R細胞株耐STI57程度較親代K562細胞多達235倍，該耐藥細胞株對HHT﹑VCR﹑DNR具有不同程度的交叉耐藥性，與親代K562細胞比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與親代敏感株K562細胞相比，其BCR-ABL基因表達上調(diào)，BCR-ABL蛋白及其激酶過度表達。結(jié)論：成功建立耐STI571人白血病細胞株K562/R，并對其生物學(xué)特性的研究，為STI571耐藥機制的進一步深入研究和抗耐藥抑制劑的篩選提供了有效的平臺。

K562； STI571； 耐藥； BCR-ABL

白血?。╨eukemia），俗稱的血癌，是由多種病因誘發(fā)的一類造血干細胞克隆性惡性疾病，國內(nèi)的發(fā)病率約為10萬分之2.76，為兒童和35歲以下成人死亡的主要病因[1-2]。慢性髓性白血?。–ML）是一種起源于造血干細胞的惡性增生性疾病，臨床上分期有慢性期﹑加速期和急變期[3]。該疾病，主要是由于BCRABL基因的變異致使BCR-ABL融合蛋白的異常表達，進而使得細胞分裂的方式不再受正?？刂疲偈拱准毎漠惓Ｔ鲋尺M而導(dǎo)致該疾病的發(fā)生[4-5]。CML在國內(nèi)占各類白血病的15%～20%，占各種慢性病的95%，病程一般持續(xù)4年左右，隨著疾病進展對治療的逐漸不敏感，因此該疾病對我國人口健康造成了很大的危害[6]。

STI571，商品名為格列衛(wèi)（Glivec或Gleevec）為近年來開發(fā)的基因靶向治療藥物，根據(jù)CML的分子發(fā)病機制，以BCR-ABL蛋白激酶的ATP結(jié)合位點結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過計算機輔助設(shè)計，人工合成了ABL激酶的ATP結(jié)合位點競爭性抑制劑，是針對CML特異的分子異常進行的一種靶向分子藥物。盡管大多數(shù)CML患者對STI571具有明顯的血液和細胞遺傳學(xué)反應(yīng)，但相當一部分患者，尤其是加速期和急變期患者對STI571產(chǎn)生了原發(fā)或獲得性耐藥，在臨床上嚴重影響了該藥的治療效果，從而約束了STI571的應(yīng)用[7-8]。因此，本實驗通過建立耐STI571的K562細胞株，對其生物學(xué)特性進行考察，研究其致病機理。研究FDB聯(lián)合STI571誘導(dǎo)K562細胞耐藥性的差異，并對其治療效果進行研究分析，探討耐藥機理，為抗耐藥的治療途徑及開發(fā)新的治療藥物提供一些參考和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗用細胞 人白血病細胞株K562（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞中心）。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐STI571細胞株建立 取對數(shù)生長期的K562細胞，通過逐漸遞增STI571的濃度，誘導(dǎo)在1 μmol/L STI571的條件下，穩(wěn)定生長，快速增殖的細胞株命名為K562/R細胞株。

1.2.2 MTT法測定K562/R細胞對STI571及常見化療藥物的IC50 取脫離STI571培養(yǎng)2周的K562/ R細胞和敏感株K562細胞接種于96孔板，加入以RPMI1640培養(yǎng)稀釋的不同濃度的STI571，以相同體積的培養(yǎng)液為空白對照，通過MTT法測定藥物的抑制率，并計算其對STI571的IC50。

1.2.3 RT-PCR檢測K562/R細胞BCR-ABL基因的表達及序列分析 提取K562/R細胞總RNA并對其量和純度進行鑒定，反轉(zhuǎn)錄擴增BCR-ABL基因，對BCR-ABL擴增產(chǎn)物回收并測序。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）測定K562/R細胞BCR-ABL蛋白及其酪氨酸激酶的表達 提取K562/R細胞總蛋白，采用Lowry法測定蛋白濃度，將轉(zhuǎn)移至膜的BCR-ABL蛋白用ALPHA INNOTECH化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行光密度掃描，以各組目的蛋白條帶光密度值對內(nèi)參蛋白光密度值計算相對比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K562/R細胞的獲得 通過遞增STI571的濃度，經(jīng)13個月，誘導(dǎo)出在1 μmol/L STI571的條件下穩(wěn)定生長的K562/R細胞株。1 μmol/L STI571作用48 h后的K562敏感細胞株形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞膜皺縮，胞漿顆粒增多，增殖減慢；而相同濃度STI571作用下的K562/R細胞，其輪廓清晰，胞體圓形透明，生長旺盛，見圖1。

2.2 MTT法測定K562/R細胞對STI571及常見化療藥物的IC50 為了明確K562/R細胞對STI571的耐藥倍數(shù)，應(yīng)用MTT法觀察了K562和K562/R細胞對STI571的IC50值，分別為（0.01±0.005）μmol/L﹑（2.35±0.01）μmol/L。K562/R細胞耐藥倍數(shù)為K562細胞的235倍，K562/R與其親本細胞K562在抵抗STI571的作用上比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而K562/R細胞亦對HHT﹑VCR﹑DNR表現(xiàn)出不同的交叉耐藥性，與K562比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖1 K562/R細胞株和敏感細胞株光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)形態(tài)

表1 K562/R細胞株和敏感細胞株交叉耐藥性

2.3 RT-PCR檢測K562/R細胞BCR-ABL基因的表達 RT-PCR檢測K562細胞與不同耐藥程度K562細胞（0.3 μmol/L﹑0.6 μmol/L﹑0.9 μmol/L﹑1 μmol/L）的BCR-ABL cDNA，可見熒光條帶，針對BCR-ABL融合基因的引物擴增出862 bp大小的片段，顯示各組細胞均為BCR-ABL融合基因陽性。電泳檢測RT-PCR擴增產(chǎn)物，以200 bp的GAPDH為內(nèi)參。半定量PCR灰度掃描不同耐藥程度K562細胞的光密度與其內(nèi)參的比值分別為（1.97±0.05）﹑（2.14±0.09）﹑（3.21±0.21）﹑（4.05±0.19）﹑（4.77±0.18），BCR-ABL的 mRNA水平隨耐藥程度的增加而增加，K562/R細胞的BCRABL基因表達上調(diào)，見圖2。

圖2 K562/R細胞BCR-ABL基因的表達

2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）測定K562/R細胞BCR-ABL蛋白的表達 采用Western blot方法檢測K562細胞與不同耐藥程度K562/R細胞的BCR-ABL融合蛋白，灰度掃描BCR-ABL融合蛋白與β-actin蛋白比值為（0.043±0.020）﹑（0.045±0.010）﹑（0.26±0.04）﹑（0.937±0.020）﹑（0.97±0.01），K562敏感細胞與不同耐藥程度的K562/R細胞的BCR-ABL蛋白表達量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），K562/R細胞BCRABL蛋白過度表達，見圖3；進一步用Tyr抗體對BCR-ABL激酶表達的檢測結(jié)果為（0.0370±0.0061）﹑（0.0390±0.0045）﹑（0.230±0.047）﹑（0.350±0.053）﹑（0.410±0.026），K562/R細胞BCR-ABL激酶過度表達，激酶表達隨耐藥程度的增加而增加。

圖3 Western blot測定K562/R細胞BCR-ABL蛋白的表達

3 討論

CML患者有90%以上存在特征性的pH染色體及BCR-ABL融合基因，其治療關(guān)鍵是在慢性期能否夠獲得分子水平的緩解。STI571是一種針對CML的靶向藥物，該類酪氨酸激酶抑制劑，為CML的治療帶來了希望[9]。然而，CML患者對酪氨酸激酶抑制劑的治療反應(yīng)與個體BCR-ABL基因變異密切相關(guān)，另外在CML的治療過程中，研究人員和醫(yī)療人員發(fā)現(xiàn)，使用STI571治療數(shù)周或者數(shù)月內(nèi)，多數(shù)患者出現(xiàn)了不同程度的耐藥性，同時臨床上STI571的使用頻率不斷增加，目前STI571引起的耐藥性問題越來越嚴重[10-11]。在耐藥和復(fù)發(fā)性CML患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100種BCR-ABL基因的突變[12]。這些變異干擾激酶抑制劑的親和力，同時也改變了BCR-ABL的生物學(xué)功能，其中有些變異具有廣泛耐藥行性，是目前臨床上最難以克服的一種基因突變[13-15]。

本實驗通過逐步增加STI571濃度的作法，最終得到了與敏感細胞相比耐藥倍數(shù)為235倍的K562/R細胞株，該細胞在STI571作用下，細胞形態(tài)無明顯改變，生長穩(wěn)定，增殖迅速；繪制細胞的生長曲線發(fā)現(xiàn)，K562/R細胞生長趨勢與正常K562細胞沒有太大差異。通過RT-PCR檢測到K562/R細胞BCR-ABL基因mRNA水平升高，其編碼的BCR-ABL蛋白過度表達，致使BCR-ABL激酶重新活化，過度增殖，表明BCRABL基因及其表達產(chǎn)物與CML的STI571耐藥密切相關(guān)。在對耐藥細胞交叉耐藥性的檢測，表明耐藥細胞對HHT﹑VCR﹑DNR具有不同程度的交叉耐藥性，與敏感細胞株相比具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），BCR-ABL基因和表達產(chǎn)物與其他藥物的耐藥性可能存在相關(guān)性，相應(yīng)結(jié)果和結(jié)論還有待于進一步探討和驗證[16-20]。

綜上所述，本研究成功建立的K562/R細胞株，為STI571耐藥機制的研究和抗耐藥抑制劑的體外篩選提供了有效的實踐平臺。初步分析了BCR-ABL基因及其表達產(chǎn)物與CML的STI571耐藥和交叉耐藥性的相關(guān)性。雖然STI571產(chǎn)生了耐藥，但相信隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展以及輔助設(shè)計的深入，耐藥機制謎團的進一步解釋，在CML治療過程中患者對酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性最終會得到解決。同時由于STI571的出現(xiàn)開創(chuàng)了靶標藥物的新時代，結(jié)合高通量篩選﹑分子模擬和各種生物技術(shù)在藥物研究中的聯(lián)合應(yīng)用，目前已有許多類似新藥帶來令人振奮的效果，其中AMN107和BMS-354825兩種化合物有望彌補STI571耐藥的缺陷。

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Establishment and Characterization Study of STI571-resistant K562 Cell Line

/ZHANG Qiong，WANG Lili，YANG Li-hong.//Medical Innovation of China，2014，11（16）：001-004

Objective：To establish a STI571-resistant K562 cell line and investigate its biological characteristics and resistance pathogenesis.Method：By incrementing STI571 concentration， a human leukemia cell line K562/R was established successfully， which had strain resistant to STI571， and investigated its biological characteristics and resistance pathogenesis used RT-PCR， Western-blot， immunohistochemistry and gene sequencing.Result：The K562/R cell line was steady growth and exuberant reproduction at the circumstance contained 1 μmol/L STI571. Compared to parental K562 cells， its resistance level to STI57 up to 235 times， at the same time it had varying degrees cross-resistance to HHT，DNR and VCR， compared with K562 cells， the difference was statistically significant （P＜0.05）. Compared with the parental sensitive K562 cells， BCR-ABL gene expression level was raised， BCR-ABL protein and its kinase expression excessive.Conclusion：Successfully establish a STI571-resistant human leukemia cell line K562/R， and investigate its biological characteristics and resistance pathogenesis， those provided an effective platform for further research of STI571 drug resistance mechanism and screening for anti-drug inhibitor.

K562； STI571； Resistance； BCR-ABL

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.16.001

2014-03-28） （本文編輯：蔡元元）

①黑龍江食品藥品檢驗檢測所 黑龍江 哈爾濱 150001

②軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所

楊利紅

First-author’s address：Heilongjiang Institute of Inspection for Food and Drug，Harbin 150001，China