針刺對(duì)慢性腦缺血腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標(biāo)影響及其機(jī)制*

張文麗詹宇豪沈俊明蔣守芳王寒李旗鄭德松劉國榮李倩

針刺對(duì)慢性腦缺血腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標(biāo)影響及其機(jī)制*

張文麗①詹宇豪②沈俊明②蔣守芳③王寒①李旗②鄭德松②劉國榮②李倩①

目的：明確針刺對(duì)慢性腦缺血的腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標(biāo)影響及其機(jī)制。方法：將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常、慢性腦缺血（IR）和針刺組，對(duì)比觀察各組動(dòng)物慢性腦缺血5周時(shí)腦皮質(zhì)病理變化及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）含量的影響。結(jié)果：IR組SOD 值較正常組顯著降低，針刺組的SOD活性表達(dá)明顯高于IR組，ROS、XOD活性低于IR組，而MDA的活性明顯低于IR組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：針刺對(duì)慢性腦缺血有一定保護(hù)作用，此作用機(jī)制可能是針刺通過清除自由基，降低脂質(zhì)過氧化應(yīng)激而保護(hù)慢性腦缺血的神經(jīng)功能損傷。

針刺； 自由基； 慢性腦缺血

慢性腦缺血表現(xiàn)為頭痛、頭暈、失眠、記憶力減退、健忘等癥狀，是臨床常見病、多發(fā)病之一；近年來呈逐年上升并有年輕化的趨勢，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。在人類對(duì)抗腦血管疾病的歷史進(jìn)程中，針刺發(fā)揮了非常重要作用，為中華民族的醫(yī)療衛(wèi)生做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)，是中國腦血管病防治的特色所在[1-3]?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)針刺能不同程度提高腦耐缺血缺氧能力，而且對(duì)慢性腦缺血多偏重于臨床治療觀察[4-5]，本文從基礎(chǔ)研究入手旨在探討針刺對(duì)慢性腦缺血腦皮質(zhì)區(qū)自由基相關(guān)指標(biāo)影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 30只Wistar 健康雄性大鼠體重250～320 g；購于北京維通利華公司。SOD、ROS、MDA、XOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物分組 動(dòng)物隨機(jī)分成正常組、慢性腦缺血組（IR）、針刺組，每組10只；針刺組于第一次腦缺血后2 h內(nèi)立即針刺，以后每日一次針刺大椎、百會(huì)穴30 min。各組均常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 模型制備 通過兩血管法即雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎建立腦缺血模型，模型大鼠在1周內(nèi)分2次結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（分別在第1天和第7天）。術(shù)前禁食12 h、禁水4 h。仰臥位，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，頸部消毒后正中切開，鈍性分離出一側(cè)迷走神經(jīng)與頸總動(dòng)脈，用4號(hào)絲線雙重結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合時(shí)切口內(nèi)注慶大霉素注射液4萬單位預(yù)防感染。該側(cè)結(jié)扎后間隔7 d行第二次手術(shù)，同法結(jié)扎該側(cè)頸總動(dòng)脈。大鼠術(shù)后放保溫毯上使其肛溫保持在36.5～37.0 ℃至蘇醒。制作模型過程中未有死亡動(dòng)物。

1.4 針刺方法 針刺參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中大鼠的常用針灸穴位定位方法，自制針刺鼠裝置；選取“百會(huì)、大椎”。“百會(huì)”穴在頂骨正中，“大椎”穴在背部正中第7頸椎與第1胸椎間。刺法：以30號(hào)1寸毫針（天協(xié)牌，蘇州天協(xié)針灸器械有限公司生產(chǎn)）向前斜刺入“百會(huì)”5 mm，直刺入“大椎”5 mm。捻轉(zhuǎn)1 min后，留針30 min，每隔5分鐘捻針一次。每天1次，均在上午10點(diǎn)左右進(jìn)行，連續(xù)治療5周。針刺組大鼠于末次進(jìn)針后4 h內(nèi)用10%水合氯醛腹腔麻醉后迅速斷頭取腦。

1.5 腦皮質(zhì)病理變化 取額葉皮質(zhì)多聚甲醛內(nèi)固定，然后進(jìn)行HE染色觀察病理變化。

1.6 腦皮質(zhì)自由基相關(guān)指標(biāo)的測定 取解凍后腦皮質(zhì)，用天平稱重，按照1：9 w/v加入生理鹽水，組織在水浴中勻漿，低溫離心機(jī)中離心10 min取上清液（2000 r/min），采用黃嘌呤氧化酶法測定腦組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力；硫代巴比妥酸法測定腦丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活力含量測定采用比色法。具體操作按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒內(nèi)操作指南進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)病理學(xué)改變 正常組額葉皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊，皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞正常。IR組時(shí)額葉皮層細(xì)胞固縮、壞死，小血管水腫明顯、有的管腔出現(xiàn)閉塞；神經(jīng)元變性壞死，數(shù)量明顯減少，排列稀疏，錐體細(xì)胞層變薄，核變淺，基質(zhì)疏松及空泡形成。針刺組額葉皮層，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，出現(xiàn)少量錐體細(xì)胞脫失，部分錐體細(xì)胞缺血明顯改善，可見膠質(zhì)細(xì)胞和小血管增生。

2.2 各組大鼠腦組織ROS、MDA、XOD、SOD的變化 如表1所示，與正常組比較，慢性腦缺血組SOD值顯著降低（P＜0.05）， 而ROS、XOD、MDA均顯著升高（P＜0.01）。與IR 組比較，針刺組SOD 顯著升高（P＜0.05），ROS、XOD、MDA均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦組織ROS、MDA、XOD、SOD值的比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織ROS、MDA、XOD、SOD值的比較（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01，與IR 組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與正常組比較

SOD （U/mg·prot）正常組 15.30±4.87 59.75±16.13 3.65±0.24 102.05±0.26 IR組 30.24±2.28## 106.12±17.24##7.74±2.27##75.11±0.32#針刺組 20.15±3.22*# 76.07±16.19**# 4.18±0.56*80.12±0.15*組別 ROS （U/mg·prot）MDA （μmol/g·ww）XOD （U/mg·prot）

3 討論

慢性腦缺血是通過各種原因引起長期的腦灌注不足，腦發(fā)生組織病理改變，國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腦梗死和老年癡呆癥的發(fā)病前期都曾有長期慢性腦缺血的存在[6]。本實(shí)驗(yàn)通過1周內(nèi)分2次手術(shù)進(jìn)行永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，制備慢性腦缺血的動(dòng)物模型，這種方法實(shí)質(zhì)上是以慢性低灌注引起腦缺血缺氧，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的功能下降、學(xué)習(xí)記憶功能障礙。此模型能較好地模擬人類因動(dòng)脈管腔狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化等因素導(dǎo)致的血管性腦卒中。有人認(rèn)為大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后2.5 h腦血流量減少25%～90%，1周后仍下降并持續(xù)數(shù)月。且結(jié)扎1周皮層葡萄糖利用下降20%～30%，海馬葡萄糖利用下降15%。雙側(cè)頸總動(dòng)脈術(shù)后3周即為慢性缺血期[7]。氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是引起慢性腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要因素之一。神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧自由基極為敏感，產(chǎn)生一系列自由基連鎖反應(yīng)，攻擊灰質(zhì)的神經(jīng)元等富含脂質(zhì)的腦組織，造成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，并使初始缺血損傷不嚴(yán)重的神經(jīng)元也發(fā)生壞死[8]。

根據(jù)傳統(tǒng)理論，針刺可以疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)和氣血，治療疾病。其治療機(jī)理也越來越成為研究的熱點(diǎn)。Tanaka等[9]發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1 d至6周，SOD活性較對(duì)照組下降明顯；其他實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)電針能降低大鼠腦組織內(nèi)MDA含量， 增強(qiáng)SOD活性[10-11]。這與筆者的部分結(jié)果相一致。在慢性腦缺血過程中，自由基直接攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[8]。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量的變化間接的反應(yīng)了腦組織中氧自由基含量的變化。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，是機(jī)體清除氧自由基、防止生成羥自由基、阻斷自由基病理性連鎖反應(yīng)最重要的防御酶，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。XOD屬需氧脫氫酶類，是體內(nèi)核酸代謝中的重要酶。并且在缺氧過程中其對(duì)自由基的產(chǎn)生起了重要作用。ROS通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。本研究結(jié)果顯示，針刺后腦組織中ROS、MDA 和XOD 水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，說明針刺減輕慢性腦缺血的損傷與其抗氧化作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示針刺可以改善慢性腦缺血大鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞、錐體細(xì)胞變性、壞死，血管水腫等不可逆的病理生理損傷，其一系列變化與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。因此針刺可以挽救瀕死的神經(jīng)元、啟動(dòng)應(yīng)激機(jī)制、防止腦細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、減輕自由基對(duì)機(jī)體的損傷。但較多環(huán)節(jié)較多靶點(diǎn)的參與機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Acupuncture on Indexes Related to Free Radicals in Cortex in Chronic Cerebral Ischemia Rats and Its Mechanism/

ZHANG Wen-li，ZHAN Yu-hao，SHEN Jun-ming，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（15）：031-033

Objective：To explore the effect of acupuncture on indexes related to free radicals in cortex in chronic cerebral ischemia rats and its mechanism.Method：Rats were randomly divided into the control group， the chronic cerebral ischemia （IR） and the acupuncture group. The pathological change and the content of superoxide dismutase （SOD），reactive oxygen species （ROS），malondialdehyde（MDA），xanthine oxidase （XOD） in cortex of rats were detected after five weeks.Result：The expression of SOD in the acupuncture group was significantly higher than that in group IR.The activity of SOD in the acupuncture group was significantly higher than that in IR group，and the content of ROS， MDA and XOD activity was all much lower than that in IR group （P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Acupuncture has protective effect on chronic cerebral ischemia by scavenging free radicals and reducing lipid peroxidation to relieve the neuron damage.

Acupuncture； Free radicals； Chronic cerebral ischemia

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.011

2014-03-04） （本文編輯：陳丹云）

唐山市科技局項(xiàng)目（13130294z）；河北省中醫(yī)藥管理局研究項(xiàng)目（2013072）

①河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心 河北 唐山 063000

②河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院

③河北聯(lián)合大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

劉國榮

First-author’s address：Medical Laboratory Research Center， Hebei United University， Tangshan 063000，China