p53在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)及與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的關(guān)系研究*

張志宇許珂王靜許鵬

p53在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)及與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的關(guān)系研究*

張志宇①許珂②王靜①許鵬②

目的：研究p53在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中的表達(dá)及與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的關(guān)系。方法：對20例骨關(guān)節(jié)炎患者（OA組）及10例正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織（對照組），用實時定量PCR（real-time PCR）、免疫組化等方法檢測p53及Beclin1在膝關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)與分布，并對兩者進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：p53在OA組的表達(dá)明顯高于正常對照組（P＜0.05），OA組關(guān)節(jié)軟骨組織中Beclin1的表達(dá)量明顯低于正常對照組（P＜0.01），p53 與Beclin1在軟骨組織中表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)（r=-0.629，P＜0.05）。結(jié)論：骨關(guān)節(jié)炎中p53的高表達(dá)能夠抑制軟骨細(xì)胞自噬，從而減弱軟骨細(xì)胞對凋亡抵抗能力，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。

骨關(guān)節(jié)炎； 自噬； p53； Beclin1

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性退行性關(guān)節(jié)病，其主要病理改變是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的減少和軟骨基質(zhì)的降解，是致殘致畸的主要原因之一[1]。OA軟骨細(xì)胞的減少主要由于軟骨細(xì)胞過度凋亡引起，引起OA軟骨細(xì)胞過度凋亡的原因一直是近年來的研究熱點。隨著自噬現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其與凋亡關(guān)系研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自噬在OA軟骨細(xì)胞中減弱，從而促進(jìn)凋亡，但OA軟骨細(xì)胞自噬減弱的原因并不清楚[2]。最新研究認(rèn)為，抑癌基因p53是調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬的重要因子[3]。因此，本研究通過檢測p53及自噬調(diào)節(jié)因子Beclin1在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，探索OA軟骨細(xì)胞自噬減弱的原因，為OA的基礎(chǔ)及臨床研究提供新的方向及思路，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2012年11月-2013年4月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院住院預(yù)接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療患者中，根據(jù)根據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）2008年修訂的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過病史、臨床檢查和X線平片等確診OA患者共20例作為OA組。其中男6例，女14例，平均年齡（71.3±8.9）歲。同時收集無關(guān)節(jié)疾病史及肉眼病變的因外傷截肢、交叉韌帶斷裂、半月板損傷等行手術(shù)治療的膝關(guān)節(jié)患者共10例作為對照組，其中男8例，女2例，平均年齡（42.4±6.7）歲，經(jīng)病理學(xué)診斷關(guān)節(jié)病變，作為正常對照組。受試者均知情同意參加本實驗并經(jīng)過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。兩組受試者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及方法

1.2.1 主要試劑 p53及Beclin1引物由南京金斯瑞公司合成，引物信息見表1；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司；SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ購自日本Takara公司；p53及Beclin1多克隆抗體購自中國臺灣Abnova公司，即用SP免疫組化兩步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

表1 引物信息

1.2.2 方法 30例新鮮標(biāo)分為兩部分：一部分立即放入4%多聚甲醛中固定，10%EDTA脫鈣6、7周，常規(guī)脫水，石蠟包埋，以4～5 μm厚度連續(xù)切片。行常規(guī)HE染色外，按試劑盒內(nèi)說明分別行p53及Beclin1免疫組織化學(xué)染色，用已知的陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，經(jīng)染色后，陽性信號呈黃褐色。每張切片隨機選取5個高倍視野（×200），計算陽性染色細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比；另一部分放入1‰DEPC水處理過的凍存管中浸液氮24 h后，轉(zhuǎn)移到-80 ℃凍存，Trizol法提取軟骨組織總RNA，經(jīng)微量核酸/蛋白定量儀鑒定并定量后，根據(jù)Fermentas公司提供說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴增，反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行熔解曲線分析，用于判定PCR反應(yīng)的特異性，是否有非特異性擴增產(chǎn)物；瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物條帶是否單一；內(nèi)參照為β-actin，基因表達(dá)量采用ΔΔCt法進(jìn)行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性及正態(tài)性檢驗后，根據(jù)情況，兩組間均數(shù)的比較用Mann-Whitney U檢驗或t檢驗；OA軟骨細(xì)胞中p53與Beclin1基因水平表達(dá)量用Pearson或Spearman檢驗進(jìn)行相關(guān)性分析以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 20例OA組與10例對照組的膝關(guān)節(jié)軟骨組織經(jīng)HE染色后比較軟骨組織的厚度、形態(tài)及軟骨細(xì)胞的數(shù)量可見：OA軟骨變薄、缺損，軟骨表面毛糙，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，呈簇狀生長（見圖1A、B）。OA關(guān)節(jié)軟骨中p53陽性細(xì)胞主要分布于表層和中層，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核均有表達(dá)；對照組關(guān)節(jié)軟骨陽性細(xì)胞分布部位與OA相似，但數(shù)量少，陽性細(xì)胞數(shù)低，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1C、D、圖2。OA關(guān)節(jié)軟骨四層結(jié)構(gòu)中均可見到Beclin1陽性細(xì)胞分布，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；對照組關(guān)節(jié)軟骨陽性細(xì)胞分布部位與OA相似，但數(shù)量較多，陽性細(xì)胞數(shù)高，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1E、F、圖2。

圖1 p53與Beclin1蛋白在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的免疫組織化學(xué)染色

圖2 p53與Beclin1蛋白在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)量分析

2.2 real time PCR結(jié)果 用realtime qPCR的方法檢測p53及Beclin1的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參照。結(jié)果顯示p53在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)顯著高于對照組（P＜0.01），而Beclin1在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)顯著低于對照組（P＜0.01），見圖3。

圖3 p53與Beclin1基因在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)量分析

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果 OA患者20例關(guān)節(jié)軟骨組織中p53及Beclin1基因的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，得出r=-0.629（P＜0.05），故認(rèn)為OA組織中p53及Beclin1基因的表達(dá)之間具有相關(guān)性，且呈負(fù)相關(guān)，見圖4。

圖4 p53與Beclin1基因表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

OA軟骨細(xì)胞的減少主要由于軟骨細(xì)胞過度凋亡引起[4]。Gobbi等[5]發(fā)現(xiàn)在OA膝關(guān)節(jié)軟骨的表層和中層有過度的細(xì)胞凋亡。應(yīng)用TUNEL法和熒光標(biāo)記的鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白V法檢測正常組和OA組的髖關(guān)節(jié)軟骨發(fā)現(xiàn)，在OA的關(guān)節(jié)軟骨中有18%～21%的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的特征，而只有2%～5%有凋亡特征的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)在正常組關(guān)節(jié)軟骨中[6]。

OA軟骨細(xì)胞過度凋亡與凋亡基因過度表達(dá)有關(guān)[7]。p53是重要的抑癌基因，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下調(diào)凋亡抑制基因如Bcl-2的表達(dá)[8]。細(xì)胞質(zhì)中的p53使 Bax誘導(dǎo)的MOMP增加[9]。NO表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解可以增加軟骨細(xì)胞中p53的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[10]。本研究也證實OA中p53無論在基因水平及蛋白表達(dá)水平均高于正常對照組，且主要分布在表層和中層，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均有表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與了OA軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。自噬通過降解蛋白及殘余細(xì)胞器為細(xì)胞節(jié)約并提供能量，清除某些有害的蛋白來防止或減少由這些聚集蛋白所引起的細(xì)胞毒性，中和細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)[11]。Beclin1是重要的自噬調(diào)節(jié)基因，它與Vps34形成的復(fù)合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位，進(jìn)而介導(dǎo)自噬體的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ與Caspase3表達(dá)分布相反[13]。在OA患者的軟骨組織中研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加Beclin1介導(dǎo)的自吞噬途徑逐漸減弱，且與軟骨細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)[2]。自噬是保證關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞獲取ATP、中和應(yīng)激的重要手段，因此自噬被抑制使得軟骨細(xì)胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究發(fā)現(xiàn)，p53不僅可以促進(jìn)凋亡，也能調(diào)節(jié)自噬。腫瘤自噬的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的p53可抑制Beclin1介導(dǎo)的自噬，因此當(dāng)物質(zhì)和能量缺乏時，雖然p53表達(dá)降低，但細(xì)胞為維持ATP水平自噬不僅沒有減弱反而增強[3]。本研究在OA軟骨細(xì)胞中也證實p53與Beclin1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明關(guān)節(jié)軟骨中p53可能抑制了Beclin1介導(dǎo)的自噬反應(yīng)，進(jìn)而使得OA軟骨細(xì)胞更易發(fā)生凋亡。

綜上所述，由于OA中由于NO表達(dá)增加、細(xì)胞外基質(zhì)降解等損傷因子增加，導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞p53表達(dá)增加，除了直接誘導(dǎo)凋亡外，還可使Beclin1介導(dǎo)的自噬水平降低，從而削弱自噬對軟骨細(xì)胞保護(hù)作用（如提供ATP、中和應(yīng)激反應(yīng)等），進(jìn)一步加劇OA軟骨細(xì)胞的凋亡。中止或者減弱這一過程，可能對減少OA細(xì)胞凋亡，甚至延緩OA軟骨退變的進(jìn)展，具有一定積極的意義。但OA軟骨細(xì)胞中p53抑制Beclin1的具體機制還須進(jìn)一步在細(xì)胞水平及分子水平進(jìn)行研究。

[1]許珂，許鵬.骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞死亡機制研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2011，15（4）：271-274.

[2] Caramés B，Taniguchi N，Otsuki S，et al.Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage，and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2010，62（3）：791-801.

[3] Tasdemir E，Maiuri M C，Galluzzi L，et al.Regulation of autophagy by cytoplasmic p53[J].Nat Cell Biol，2008，10（6）：676-687.

[4] Abramson S B，Attur M.Developments in the scientific understanding of osteoarthritis[J].Arthritis Res Ther，2009，11（3）：227.

[5] Gobbi A，Kon E，Berruto M，et al.Patellofemoral full-thickness chondral defects treated with hyalograft-C：a clinical，arthroscopic，and histologic review[J].Am J Sports Med，2006，34（11）：1763-1773.

[6] Heraud F，Heraud A，Harmand M F.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage[J].Ann Rheum Dis，2000，59 （12）：959-965.

[7] Kim J，Xu M，Xo R，et al.Mitochondrial DNA damage is involved in apoptosis caused by pro-inflammatory cytokines in human OA chondrocytes[J].Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（3）：424-432.

[8] Follis A V，Chipuk J E，F(xiàn)isher J C，et al.PUMA binding induces partial unfolding within BCL-xL to disrupt p53 binding and promote apoptosis[J].Nat Chem Biol，2013，9（3）：163-168.

[9] Montero J，Dutta C，van Bodegom D，et al.p53 regulates a nonapoptotic death induced by ROS[J].Cell Death Differ，2013，20（11）：1465-1474.

[10]Lundgreen K，Lian ?，Scott A，et al.Increased levels of apoptosis and p53 in partial-thickness supraspinatus tendon tears[J].Knee Surgery，Sports Traumatology，Arthroscopy，2013，21（7）：1636-1641.

[11] Dalby K N，Tekedereli I，Lopez-Berestein G，et al.Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeuticstrategies in cancer[J].Autophagy，2010，6（3）：322-329.

[12] Vergne I，Deretic V.The role of PI3P phosphatases in the regulation of autophagy[J].Febs Lett，2010，584（7）：1313-1318.

[13] Almonte-Becerril M，Navarro-Garcia F，Gonzalez-Robles A，et al.Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of osteoarthritis within an experimental model[J].Apoptosis，2010，15（5）：631-638.

The Expression of p53 in Osteoarthritis Cartilage Tissue and the Research of Relationship with the Articular Cartilage Cell Autophagy

/ZHANG Zhi-yu，XU Ke，WANG Jing，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（15）：001-004

Objective：To investigate the expression of p53 in osteoarthritis and the correlation with autophagy of articular chondrocytes.Method：Real time PCR and Immunohistochemical methods were used to determine the expression of p53 and Beclin1 of articular chondroeytes of osteoarthritis from 20 patients with the osteoarthritis group and 10 patients with the normal control group and the correlation between them was analyzed.Result：Expression of p53 in the OA group was significantly higher than the normal control group（P＜0.05）.Expression of Beclin1 in the OA group was significantly lower than the normal control group（P＜0.01）.It had negative correlation between the p53 and Beclin1 in OA articular chondrocytes（r=-0.629，P＜0.05）.Conclusion：The high expression of p53 in osteoarthritis can inhibit autophagy cartilage cells，weaken the cartilage cell resistance to apoptosis，and promote the apoptosis of cartilage cells.

Osteoarthritis； Autophagy； p53； Beclin1

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.15.001

2014-03-17） （本文編輯：歐麗）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81171742、81271948）

①西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 陜西 西安 710061

②西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院

許鵬

First-author’s address：Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710061，China