響應(yīng)面法優(yōu)化玉米芯中低聚木糖的酶法提取工藝

姚 笛 葉曼曼 李 琳 樊 蕾 孟 超 楊 健

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319）

（浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司2，杭州 310035）

低聚木糖系由2～7個(gè)木糖分子以α-1，4糖苷鍵結(jié)合而成［1］，具有很強(qiáng)的增殖腸道益生菌［2］、改善腸道微生態(tài)環(huán)境等功能［3-4］，它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低，具有抗齲齒作用［5］。低聚木糖作為一種非消化性糖，理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸、耐熱，是一種功能性食品配料［6-7］，被認(rèn)為是目前最有前途、國(guó)內(nèi)外研究最為廣泛的功能性低聚糖之一。

低聚木糖的生產(chǎn)主要是以富含木聚糖的植物（如玉米芯、棉籽殼、麩皮等）為原料，通過(guò)木聚糖水解酶酶解而得的一種低聚糖［8-9］，制備低聚木糖的原料多為木聚糖提取率較高的木質(zhì)纖維素，玉米芯中含有大約35%的半纖維素、35%的纖維素和15%的木質(zhì)素，其中半纖維素的主要組成為木聚糖，它通過(guò)降解可生產(chǎn)低聚木糖［10-11］。目前，我國(guó)對(duì)玉米芯的利用相對(duì)來(lái)說(shuō)還很少，除少量進(jìn)行初加工外，絕大部分作為農(nóng)家燃料被燒掉，既浪費(fèi)了資源又污染環(huán)境，我國(guó)對(duì)低聚木糖的研究起步較晚，與一些發(fā)達(dá)國(guó)家相比，在技術(shù)和工藝上都有一定程度的差距。近年來(lái)，由于低聚木糖市場(chǎng)需求的持續(xù)增長(zhǎng)，對(duì)其生產(chǎn)工藝的技術(shù)要求也不斷提高。因此，以?xún)r(jià)廉易得的玉米芯為原料，研究開(kāi)發(fā)低聚木糖產(chǎn)品具有極大的競(jìng)爭(zhēng)力和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景［12-14］。本研究旨在開(kāi)發(fā)高附加值的低聚木糖，以玉米芯為原料，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)酶法提取低聚木糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為玉米芯資源的有效利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，具有重要的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米芯：大慶市郊區(qū)；木聚糖酶：本實(shí)驗(yàn)室利用球毛殼霉發(fā)酵后分離純化獲得；木聚糖：sigma公司；D-木糖、3，5-二硝基水楊酸、乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 玉米芯木聚糖粗品的制備

采用堿法提取木聚糖粗品，具體流程為：干燥的玉米芯粉→堿法浸提→上清液→過(guò)濾→粗提液→中和→沉淀→離心→水解→醇沉→離心→烘干沉淀→得木聚糖粗品。

1.3 酶解木聚糖制備低聚木糖

取木聚糖粗品，用蒸餾水浸泡12 h制成木聚糖濃縮液，調(diào)pH為5.7，添加木聚糖酶，搖床水浴振蕩酶解，過(guò)濾，重復(fù)3次，取其上清液進(jìn)行還原糖含量的測(cè)定。

1.4 單因素試驗(yàn)

以木聚糖底物濃度、木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)影響玉米芯中低聚木糖含量的因素做單因素試驗(yàn)，確定各因素適宜的范圍。

1.5 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量及其水平。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以還原糖含量為指標(biāo)，選取木聚糖底物濃度、木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，用響應(yīng)面分析（Response surface analysis，RSA）方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，以確定酶處理的最優(yōu)工藝條件。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，取試驗(yàn)結(jié)果的平均值。其中各自變量的因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表

1.6 還原糖含量測(cè)定

還原糖含量采用 DNS法測(cè)定（以木糖計(jì)，g／L）［15］。

1.7 酶解液組分分析

采用高效液相色譜法分析最優(yōu)條件下玉米芯酶解液中低聚木糖的主要成分［16］，色譜條件：色譜柱為Suga KS-802柱；檢測(cè)器為515示差折光檢測(cè)器；流動(dòng)相為超純水；流速0.8 mL／min；進(jìn)樣量5μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 底物濃度對(duì)還原糖含量的影響

由圖1可知，隨著木聚糖底物濃度的增加，酶解液中還原糖含量逐漸增加，酶解后酶解液中還原糖含量在木聚糖底物濃度為1%～5%時(shí)逐漸增加，而在3%～5%時(shí)還原糖含量增加不明顯。因此，為節(jié)省原材料，宜選用木聚糖底物濃度3%。

圖1 底物濃度對(duì)還原糖含量的影響

2.1.2 木聚糖酶添加量對(duì)還原糖含量的影響

由圖2可知，隨著木聚糖酶添加量的增大，酶解液還原糖含量逐漸增加，加酶量為40 mL／g時(shí)還原糖含量最高，所加酶量以40 mL／g較好。

圖2 加酶量對(duì)還原糖含量的影響

2.1.3 酶解溫度對(duì)還原糖含量的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，酶解液的還原糖含量先逐漸增加后有所降低，溫度過(guò)高對(duì)木聚糖酶活力有一定的影響，因此，酶解溫度為60℃時(shí)還原糖含量最高。

圖3 酶解溫度對(duì)還原糖含量的影響

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)酶解液還原糖含量的影響

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶解液的還原糖含量先增加后減少，3～5 h增加明顯，5～7 h有所降低，處理5 h時(shí)酶解液的還原糖含量最高，所以酶解時(shí)間以5 h較好。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化低聚木糖提取工藝參數(shù)分析

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

響應(yīng)面法優(yōu)化低聚木糖提取工藝試驗(yàn)結(jié)果如表2，通過(guò)Design Expert數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行回歸分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。由表3可知，底物濃度的一次項(xiàng)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），加酶量的一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明這2個(gè)因素對(duì)還原糖含量的線性效應(yīng)顯著，所有二次項(xiàng)對(duì)還原糖含量的曲面效應(yīng)極顯著，交互項(xiàng)AB、AD交互效應(yīng)顯著（P＜0.05），表明各影響因素對(duì)還原糖含量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。表3分析結(jié)果可見(jiàn)，整體模型的P值小于0.000 1，該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，并且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明該回歸方程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了較好擬合，二次回歸方程為：R＝3．82＋0．17A＋0．12B＋0．08C-0．07D-0．18AB＋0．02AC-0．26AD-0．06BC-0．04BD-（5．00E＋003）CD-0．95A2-0．43B2-0．25C2-0．41D2

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面以及等高線分析結(jié)果

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值在各試驗(yàn)因子交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個(gè)三維空間曲面。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀。圖5、圖6是對(duì)響應(yīng)值還原糖含量影響較大的兩因素交互作用的響應(yīng)面，其他因素交互作用不顯著。

圖5 底物濃度和加酶量對(duì)還原糖含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

由圖5可知，底物濃度在（3%～4%）范圍內(nèi)，木聚糖酶添加量在（40～50 mL／g）范圍內(nèi)時(shí)，兩者存在著顯著的增效作用，還原糖含量隨著底物濃度和木聚糖酶添加量的增加而增加；而當(dāng)?shù)孜餄舛攘吭冢?%～3%）范圍內(nèi)，木聚糖酶添加量在（30～40 h）范圍內(nèi)時(shí)，還原糖含量隨著兩個(gè)因素的增加而減少。由圖6可知，底物濃度在（3%～4%）范圍內(nèi)，酶解時(shí)間在（5～6 h）范圍內(nèi)時(shí)，兩者存在著顯著的增效作用，還原糖含量隨著底物濃度和酶解時(shí)間的增加而升高；而當(dāng)?shù)孜餄舛仍冢?%～3%）區(qū)間，酶解時(shí)間在（4～5 h）還原糖含量隨著兩個(gè)因素的增加開(kāi)始降低。

圖6 底物濃度和酶解時(shí)間對(duì)還原糖含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

為了確定最佳點(diǎn)的值，對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，以得到高還原糖低聚木糖的最佳制備工藝條件，經(jīng)分析得出最佳制備條件為：底物濃度為3%，加酶量為41 mL／g（底物），51℃時(shí)酶解4.88 h所得的低聚木糖含量最高，3.88 mg／mL。為檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行玉米芯中低聚木糖的提取，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，最佳條件修正底物濃度為3%，加酶量為40 mL／g（底物），50℃時(shí)酶解5 h所得的低聚木糖含量為3.86 mg／mL。與預(yù)測(cè)值比較可知，本試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 優(yōu)化條件下酶解液的組分分析

采用HPLC對(duì)玉米芯酶解液中低聚木糖組分進(jìn)行分析，低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜如圖7所示，從圖7可以看出，1號(hào)峰為木糖，出峰時(shí)間11.426 min，2號(hào)為木二糖（10.324 min），3號(hào)為木三糖（9.875 min），4號(hào)為木四糖（9.216 min），5號(hào)為木五糖（8.571 min）。酶解液中低聚木糖組分的HPLC圖譜如圖8，由積分面積可知低聚木糖（木二～木五）的相對(duì)含量達(dá)68.1%，說(shuō)明此水解條件能夠較好的制備低聚木糖。

圖7 低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

圖8 酶解液中低聚木糖組分的HPLC圖譜

3 結(jié)論

采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，經(jīng)響應(yīng)面分析結(jié)合實(shí)際值確定玉米芯酶法制備低聚木糖的最佳工藝條件為底物濃度3%，加酶量為40 mL／g（底物），50℃時(shí)酶解5 h所得的酶解液中還原糖含量為3.86 mg／mL。能夠使玉米芯中的木聚糖充分水解得到低聚木糖，并通過(guò)HPLC進(jìn)行水解產(chǎn)物的分析，證明水解產(chǎn)物中含有較高的木二糖、木三糖、木四糖及木五糖等低聚木糖組分，低聚木糖（木二～木五）的相對(duì)含量達(dá)68.1%，因此說(shuō)明優(yōu)化的水解條件能夠較好的制備低聚木糖。

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