酶免疫測(cè)定法檢測(cè)糞便孕酮進(jìn)行母豬早期妊娠診斷的研究

馮建剛，魏全偉，李 巖，石放雄

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095）

養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)中的支柱產(chǎn)業(yè)，在生豬養(yǎng)殖業(yè)中，繁殖效率是決定母豬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素之一。母豬繁殖率的高低取決于發(fā)情鑒定、配種授精、妊娠檢查及接產(chǎn)等多種技術(shù)。

母豬的早期妊娠診斷是提高母豬繁殖效率和畜牧業(yè)生產(chǎn)效益的重要技術(shù)措施，尤其是配種后20d前后的早期妊娠診斷是母豬繁殖技術(shù)中十分重要的內(nèi)容。對(duì)母豬而言，每耽誤5.5個(gè)發(fā)情周期就少產(chǎn)1窩。因此，母豬配種后20d前后的早期妊娠診斷尤為重要。

動(dòng)物體液中孕激素的含量變化主要是由于卵巢黃體發(fā)育和退化的結(jié)果，發(fā)情期孕酮水平最低，黃體期孕酮水平較高，妊娠期孕酮水平則一直維持在較高水平[1-2]。類(lèi)固醇激素可在動(dòng)物血液中迅速被結(jié)合，通過(guò)不同的途徑分泌到尿液和經(jīng)膽汁排到腸道中，通過(guò)與葡萄糖醛酸或硫酸鹽結(jié)合，形成水溶性的無(wú)活性的葡萄糖苷酸或硫酸鹽而被排泄到糞便和尿液中[3]。因此，測(cè)定糞便等樣品中孕酮含量能進(jìn)行卵巢機(jī)能監(jiān)控。目前用于監(jiān)測(cè)孕酮含量的方法主要有以下幾種：放射免疫測(cè)定法，使用放射性物質(zhì)標(biāo)記，具有很高的檢測(cè)靈敏度及穩(wěn)定性，但儀器設(shè)備昂貴，且有放射性污染；酶免疫測(cè)定法，使用酶標(biāo)記，靈敏度僅次于放射免疫測(cè)定法，儀器設(shè)備相對(duì)便宜；乳膠凝集試驗(yàn)測(cè)定法，用了特化的乳膠珠，靈敏度和重復(fù)性均不如前兩種方法。目前雖有使用獸用B型超聲波診斷的，一般也需在輸精后35d以上才能進(jìn)行。

在國(guó)內(nèi)母豬養(yǎng)殖中，監(jiān)測(cè)糞樣孕酮含量以提高母豬繁殖效率的技術(shù)，還未能在基層養(yǎng)殖場(chǎng)及養(yǎng)殖農(nóng)戶(hù)推廣應(yīng)用。本文建立了簡(jiǎn)便實(shí)用的母豬糞樣孕酮含量的酶免疫測(cè)定法，并用于母豬早期妊娠診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品及試劑

孕酮多克隆抗體、酶標(biāo)抗原與ELISA試劑盒均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物繁殖研究室自行制備[4]，常規(guī)試劑均為分析純購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-TEK產(chǎn)品、型號(hào)為ELX800；振蕩器、精密電子天平、加樣器、烘箱、96孔酶標(biāo)板（購(gòu)于Geriner公司），WED-2000AV型獸用掌上B型超聲診斷儀等常規(guī)儀器。

1.3 糞樣采集及測(cè)定

1.3.1 糞樣采集

母豬來(lái)源于灌云縣畜旺生豬養(yǎng)殖場(chǎng),所有母豬均在相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)管理，采集配種后21～25d母豬（共164頭）的糞便作為檢測(cè)對(duì)象。

1.3.2 糞樣處理

收集母豬糞便并稱(chēng)0.5g溶于20mL蒸餾水中，離心（3000r/min，10min），取上清液，置于4℃冰箱待測(cè)。

1.3.3 樣品測(cè)定

包括如下8項(xiàng)程序：

①包被抗體:用包被緩沖稀釋液將孕酮抗血清稀釋成包被工作液，在已編號(hào)的載體板各孔內(nèi)(第12列E、F、G、H排的4孔除外)加抗血清稀釋液200μL加蓋4℃冰箱中靜置24～48h；

②封閉：舍去內(nèi)容物，封閉液封閉包被孔，每孔280μL，37℃放置2h；

③洗滌：取出反應(yīng)板甩掉封閉液，用洗滌液洗滌3次，吸水紙吸干；

④加樣：在包被板A排第1～12列和F排第1～11列各孔內(nèi)依次加稀釋后的待測(cè)樣本100μL，B和C排重復(fù)A排加樣,G和H排重復(fù)F排加樣，D和E排按照濃度低至高的順序依次加標(biāo)準(zhǔn)抗原，每個(gè)梯度重復(fù)3次；

⑤加酶標(biāo)物：加樣后將板置于4℃冰箱中，配制酶標(biāo)物，取出載體板，在各孔內(nèi)加酶標(biāo)物100μL,置37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)2h；

⑥洗滌：取出反應(yīng)板，甩掉反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，吸水紙吸干；

⑦加底物液：配制底物液，在各孔內(nèi)加底物液200μL，室溫避光反應(yīng)0.5h，此時(shí)反應(yīng)液呈橙黃色；

⑧加終止液：各孔加終止液50μL，此時(shí)反應(yīng)液呈棕黃色；讀取OD492nm值，將OD492nm值換算為孕酮濃度。

1.3.4 母豬早期妊娠診斷

配種后母豬糞樣中孕酮的含量超過(guò)150ng/g時(shí)，就可確認(rèn)其妊娠；小于150ng/g時(shí)，可初步確認(rèn)其空懷。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[4]

選擇合適的抗體濃度包被、合適的酶標(biāo)抗原工作濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線以系列稀釋濃度的孕酮標(biāo)準(zhǔn)液建立測(cè)定梯度,并以各濃度(包括0ng/ mL)的OD492nm值轉(zhuǎn)換成E/E0值，其中無(wú)孕酮標(biāo)準(zhǔn)時(shí)的OD492nm值為E0，各相應(yīng)濃度的孕酮標(biāo)準(zhǔn)時(shí)的OD492nm值為E，E/E0×100%=Alnx+B(x為樣本中孕酮濃度)。因?yàn)镋/E0值與lnx成線性回歸關(guān)系,從而可以計(jì)算回歸曲線的方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5 獸用B超診斷母豬早期妊娠

1.5.1 操作方法

在限飼欄內(nèi)，母豬側(cè)臥、趴臥或站立姿勢(shì)均可以操作，不需保定。用濕毛巾擦凈腹部污物。母豬側(cè)臥與趴臥時(shí)在探查部位涂布耦合劑，而站立時(shí)則在探頭上涂布耦合劑。將探頭與體軸平行，靠近股內(nèi)側(cè)或倒數(shù)第2～3對(duì)乳頭，查到膀胱后，向膀胱上部或側(cè)面掃查。妊娠早期，探頭朝向恥骨前緣，骨盆腔入口方向，或以45°角斜向?qū)?cè)上方，探頭緊貼皮膚一點(diǎn)，進(jìn)行前后和上下的定點(diǎn)扇形掃查。隨妊娠日齡的增加，探查部位逐漸前移，最后可達(dá)肋骨后端。

1.5.2 結(jié)果判定

如顯示孕囊或胚胎的斷層像診斷為懷孕；顯示兩側(cè)未孕子宮的斷層像為空懷。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Execl軟件和x2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定糞樣P4酶免法的建立

將定量的P4標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行梯度稀釋,建立的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

在一般操作情況下,結(jié)合率(E/ E0)與孕酮濃度的自然對(duì)數(shù)lnx之間的典型直線回歸方程式為:E/E0=-10.7 1lnx+62.751(r=-0.9947)。

2.2 方法學(xué)鑒定[4]

對(duì)建立的方法進(jìn)行方法學(xué)鑒定，結(jié)果如下：靈敏度8ng/g,回收率為95.78%；重復(fù)性，重復(fù)測(cè)定高、中、低水平樣本中的孕酮含量,板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為6.8%(n=9)和11.23%(n=8)，穩(wěn)定性好；特異性，用50%置換法測(cè)得孕酮抗體與雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反應(yīng)率均小于0.01%，與睪酮交叉反應(yīng)率為0.35%。

2.3 獸用B超診斷母豬早期妊娠

2.3.1 空懷的聲像圖特征

空懷母豬膀胱前方的子宮區(qū)域顯示回聲均勻的子宮角影像，對(duì)超聲的反射弱，呈各種不規(guī)則的圓形弱反射區(qū)，子宮內(nèi)檢測(cè)不到孕囊或孕體，如圖2所示。

2.3.2 妊娠的聲像圖特征

在配種35d后，妊娠母豬子宮內(nèi)能非常清楚地看到孕囊，大小隨著妊娠期的延長(zhǎng)而增大，甚至能發(fā)現(xiàn)胎體，直徑6～10cm。胎兒骨骼反射增強(qiáng)，出現(xiàn)一閃一閃的胎動(dòng)，增強(qiáng)的骨骼出現(xiàn)聲影，如圖3所示。

圖1 孕酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 空懷母豬B超聲像圖

圖3 35 d妊娠診斷的聲像圖

2.4 母豬早期妊娠診斷的結(jié)果

對(duì)灌云縣畜旺豬場(chǎng)的164頭初產(chǎn)母豬進(jìn)行了糞便孕酮含量的測(cè)定，用母豬糞便孕酮酶免疫法測(cè)定配種后21～25d母豬糞樣中孕酮濃度，測(cè)定結(jié)果分布如圖2所示。配種后母豬糞樣中孕酮的含量超過(guò)150ng/g時(shí)，確認(rèn)其妊娠；小于150ng/g時(shí)，確認(rèn)其空懷。由所測(cè)結(jié)果得知，除了配種后21、24d時(shí)各檢測(cè)出1頭，25d時(shí)檢測(cè)出4頭為空懷（合計(jì)6頭）外，其他的均為妊娠，與后來(lái)的診斷結(jié)果完全一致。

通過(guò)母豬糞便孕酮酶免疫法檢測(cè)配種后21～25d糞樣孕酮濃度進(jìn)行早期妊娠診斷和獸用B超對(duì)配種35d后妊娠診斷的準(zhǔn)確率如表1所示，基于糞樣孕酮水平的妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn)，配種后21d的準(zhǔn)確率為96.1%，22d的為100%，23d的為100%，24d的為96.3%，25d的為84%，妊娠診斷準(zhǔn)確率95.9%(140/142)；空懷診斷的準(zhǔn)確率為72%(13/18)；獸用B超對(duì)配種35d后母豬妊娠診斷的準(zhǔn)確率為97.3%。如果連續(xù)2d進(jìn)行妊娠診斷，其診斷準(zhǔn)確率有顯著的提高。

圖4 配種后21～25 d母豬糞樣孕酮濃度（實(shí)心黑點(diǎn)為妊娠，空心點(diǎn)為空懷）

3 討論與結(jié)論

已有很多文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)檢測(cè)血液中的孕酮并根據(jù)孕酮水平變化信息來(lái)進(jìn)行母豬的發(fā)情鑒定、妊娠鑒別及卵巢疾病診斷，但采集血液會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生一定的應(yīng)激并且煩瑣[6]。本文用母豬糞便孕酮酶免疫法以糞樣為檢測(cè)樣品，對(duì)母豬做早期的妊娠診斷。研究結(jié)果表明，母豬糞樣孕酮酶免疫法是一種實(shí)用、安全可靠和高效的早期妊娠診斷方法。

Hultén等人監(jiān)測(cè)了在同一個(gè)發(fā)情周期中母豬糞便和血液中孕酮濃度的變化，結(jié)果表明，除了糞樣中孕酮的變化比血液中約推遲了2d外，糞便中孕酮濃度的變化與血液孕酮濃度的變化趨勢(shì)基本相似。有報(bào)道在同一個(gè)發(fā)情周期中糞樣雌激素的變化也比血液中的變化推遲2d左右[7]。進(jìn)一步說(shuō)明血液中的類(lèi)固醇激素經(jīng)由肝臟代謝，以葡萄糖苷酸或硫酸鹽通過(guò)消化道最終糞便的方式排出體外，此過(guò)程約需要2d的時(shí)間。在臨床應(yīng)用中，測(cè)量糞便中類(lèi)固醇激素濃度時(shí)必須考慮這一點(diǎn)。配種后血液中孕酮濃度約19～23d達(dá)到很高水平，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)糞樣孕酮酶免疫法進(jìn)行早期妊娠診斷，需要檢測(cè)配種后第21～25天的糞樣孕酮濃度。以糞樣中孕激素濃度150ng/g為妊娠診斷的臨界點(diǎn)，是根據(jù)母豬妊娠或空懷測(cè)定糞樣孕激素濃度的平均數(shù)加減2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為基準(zhǔn)而確定的，該結(jié)果與Masaharu等(2010)的研究結(jié)果基本相似。通過(guò)母豬糞便孕酮酶免疫法對(duì)母豬進(jìn)行的早孕診斷的準(zhǔn)確率為95.9%；空懷診斷的準(zhǔn)確率為72%；如果連續(xù)2d進(jìn)行診斷，其診斷準(zhǔn)確率有顯著的提高。獸用B超對(duì)配種35d后母豬妊娠診斷的準(zhǔn)確率為97.3%。雖然獸用B超妊娠診斷的準(zhǔn)確率較糞便孕酮酶免疫法高，但一般也需在輸精后35d以上才能進(jìn)行，而使用酶免疫激素測(cè)定技術(shù)就可在輸精后1個(gè)情期（21～25d）進(jìn)行準(zhǔn)確的妊娠診斷。因此，應(yīng)用此方法能盡早作出妊娠診斷，這對(duì)于保胎，減少空懷，縮短產(chǎn)仔間隔，提高繁殖率和經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

表1 配種后21～25d母豬早期妊娠診斷的準(zhǔn)確率

總之，用母豬糞便孕酮酶免疫法進(jìn)行早期妊娠診斷，快速，準(zhǔn)確，收集樣本方便，此外，并不需要任何特殊的設(shè)備或技術(shù)。因此，母豬糞便孕酮酶免疫法進(jìn)行早期妊娠診斷有較高的臨床適用性，更有利于在養(yǎng)豬場(chǎng)（戶(hù)）中推廣和應(yīng)用。

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