豬腸道杯狀病毒研究進(jìn)展

劉小琬，周遠(yuǎn)成，黃 山，顧 凡，周桐楓，徐志文，朱 玲（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川 雅安；.四川省雅安市石棉縣畜牧局，四川 雅安）

1980年，美國(guó)和英國(guó)的科學(xué)家使用電子顯微鏡檢測(cè)腹瀉的哺乳仔豬糞便樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種新的病毒，后來根據(jù)其病毒形態(tài)將其命名為豬腸道杯狀病毒（Porcineentericcaliciviruses,PE CV)。雖然PECV從發(fā)現(xiàn)至今已有近30年，但由于缺乏系統(tǒng)的病理學(xué)研究，到目前為止還不清楚它們?cè)谧匀话l(fā)生的豬病中所起的作用。PECV毒株在形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)和編碼蛋白上與人杯狀病毒（Humancaliciviru,HuCV）極其相近[1]，因此不同杯狀病毒有可能存在潛在的跨物種交叉?zhèn)鞑?，以及豬可能是HuCV的儲(chǔ)存宿主而把病毒傳染給人，導(dǎo)致該病毒的流行。HuCV是引起人急性胃腸炎（Acutgastroenteritis,AGE）的主要病原之一，通過水、食物等途徑引起AGE暴發(fā)和散發(fā)[2]，尤其是嬰兒和幼兒的病毒性腹瀉，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。目前還沒有明確的證據(jù)表明現(xiàn)已知的PECV直接威脅到人類的健康。但對(duì)PECV抗原性和基因重組變化的檢測(cè)，以及與Hucv進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析能更好的評(píng)估其患病率和人畜共患的潛力[3]。

1 病原學(xué)

杯狀病毒科（Caliciviridae）的病毒粒子無囊膜，呈球形，在負(fù)染色電子顯微鏡下直徑大約27～40nm，基因組為單股正鏈的RNA，大小約7000～8000nt[4]。病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白由病毒基因組的5’端編碼，而結(jié)構(gòu)蛋白位于病毒基因組的3’端[5]。最新的病毒學(xué)分類將杯狀病毒分為五個(gè)屬，分別是諾如病毒屬（Norovirus,NoV）、札幌病毒屬（Sapovirus,SaV）、水皰疹病毒屬（Vesivirus）、兔病毒屬（Lagovirus）和Nebovirus屬。在通常情況下，杯狀病毒在環(huán)境中較為穩(wěn)定，病毒在高溫下和某些化學(xué)物質(zhì)（乙醚、氯仿等）作用下失活，PECV在pH 4.5～5的酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。能夠感染豬并引起豬發(fā)病的PECV主要是NoV和SaV，豬NoV只感染成年豬，且無臨床癥狀；而豬SaV感染各年齡的豬尤其斷奶仔豬，并可引起仔豬腹瀉。

在1998年，NoVRNA在日本的成年豬盲腸樣品中被檢測(cè)到，隨后在歐洲和美國(guó)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Noroviruses被分為5個(gè)基因型（GI-GV），其中GI有8個(gè) 亞 型，GII有19個(gè)，GIII有2個(gè)，GIV和GV各1個(gè)，其中GII各亞型中除11、18、19為豬的，其余均為感染人的亞型[6]。NoV直徑為27～32nm，基因組長(zhǎng)度為7.3～7.7kb，不包含聚腺核酸尾（poly（A））在3’端。它是由3個(gè)開放閱讀框（openreadingframes，ORF） 編碼的多聚蛋白，3個(gè)ORF之間有重疊，ORF3的下游是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為42～78nt非翻譯結(jié)構(gòu)和一個(gè)長(zhǎng)度不同的poly(A)連接在3’[7]。3個(gè)ORF分別用于編碼非結(jié)構(gòu)性多聚蛋白，主要衣殼蛋白（VP1）和次要衣殼蛋白（VP2）。VP1折疊形成表面光滑較為穩(wěn)定的衣殼區(qū)（S區(qū)）和突出衣殼高度可變的拱形區(qū)（P區(qū)）。P區(qū)又包含P1和P2兩個(gè)亞基凸域，通過序列比較，P2區(qū)的280～400氨基酸是高變區(qū)域，因此NoV是具有高度遺傳變異特性的病毒。

SaV根據(jù)衣殼基因和蛋白質(zhì)序列不同，分為5個(gè)基因型（GI-GV），每個(gè)基因群又有很多亞型，2011年Reuter等人又提出5個(gè)新的基因群即GVI-GX，人SaV基因組屬于GI、GII、GIV和GV；感 染 豬的SaV基因組則歸屬于GIII、GVI、GVII、GVIII、GIX和GX，不同種屬之間的基因重組也發(fā)生在豬SaV之間，且較人SaV而言進(jìn)化時(shí)間更為長(zhǎng)久[8]。世界首例PEC(Sw/SV/Cow den/80/US)于1980年在美國(guó)報(bào)道，分子生物學(xué)分析表明該毒株在遺傳上與人SaV相近，氨基酸高度雷同，作同種系發(fā)生分組，PEC/Cow den被列為一個(gè)獨(dú)立的SaV基因群，即基因組Ⅲ，而人SaV病毒屬基因組Ⅱ。SaV病毒粒子在電子顯微鏡下具有典型的杯狀病毒衣殼和形態(tài)清晰的杯狀凹陷狀，直徑約為30～35nm，基因組長(zhǎng)度在7.1～7.5kb。它只有2個(gè)ORF，這是SaV和NoV的主要差別，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)多聚蛋白和衣殼蛋白，ORF2編碼功能尚不清楚的小片段蛋白。豬扎幌病毒PEC/Cow den可在豬腎原代細(xì)胞和豬腎傳代細(xì)胞系(LLC—PK)上培養(yǎng)，這是迄今為止唯一能培養(yǎng)的腸道杯狀病毒。由于只對(duì)一分離物進(jìn)行了詳細(xì)研究，因而不清楚豬扎幌病毒間基因或抗原的變異。

2 流行病學(xué)

在美國(guó)、英國(guó)、荷蘭、匈牙利和日本的豬群均報(bào)道有豬PECV的感染。美國(guó)存在SaV病毒，在荷蘭和日本則有NoV病毒的流行，在英國(guó)和匈牙利未作基因分型。而根據(jù)美國(guó)、荷蘭等國(guó)家的研究都顯示了各年齡段的豬群SaV的感染率和血清陽性率均明顯高于NoV，說明其流行更為普遍[9]。

豬NoV已經(jīng)先后在日本、荷蘭、美國(guó)、匈牙利、比利時(shí)、中國(guó)、韓國(guó)等國(guó)家檢測(cè)出來[10]。值得一提的是，發(fā)生重組的人NoV的類病毒顆粒在豬胃腸組織的上皮細(xì)胞中發(fā)生了組織血型抗原結(jié)合，但此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)并沒有更多的數(shù)據(jù)來確定人、豬的NoV之間抗原性是否具有關(guān)聯(lián)性。在日本(1977)26個(gè)豬群的1117頭健豬盲腸內(nèi)容物樣本中，有4個(gè)樣品RT-PCR檢測(cè)為陽性。從荷蘭(1998—1999)100個(gè)豬場(chǎng)的育肥豬中采集100個(gè)糞便混合樣本，有2個(gè)為RT-PCR陽性。在美國(guó)（2007）采集到的275個(gè)成年豬豬糞便，有6個(gè)RT-PCR檢測(cè)為陽性。同時(shí)也有人指出，檢測(cè)豬NoV的PCR引物是根據(jù)人NoV而設(shè)計(jì)的，其靈敏性和特異性不高，在選擇樣品上也不夠全面，未參考斷奶前后的腹瀉仔豬，因此對(duì)豬NoV的流行情況和發(fā)病率可能比實(shí)際情況更高。

豬SaV廣泛分布于世界各地，近些年在美國(guó)、日本、荷蘭等國(guó)豬群中分離到豬SaV[11]，且在不同國(guó)家的感染率不同，但通常是2～8周齡仔豬感染率最高。在美國(guó)的3個(gè)州的7個(gè)豬場(chǎng)的流行情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同豬場(chǎng)的流行率差異很大，在斷奶后豬腸道杯狀病毒腹瀉的豬群中，收集30頭母豬血清樣本，有83%PEC/ Cow den抗體陽性[12]；同時(shí)保育豬及斷奶仔豬未能檢測(cè)到NoV。這與人類感染NoV情況類似，可能是由于幼齡仔豬對(duì)NoV不易感，也有可能是檢測(cè)方法的靈敏度不高有關(guān)，還待進(jìn)一步確定。在歐洲6個(gè)國(guó)家（丹麥、芬蘭、匈牙利、意大利、斯洛文尼亞和西班牙）（2004-2007）88個(gè)豬場(chǎng)收集到1050個(gè)豬糞便通過RT-PCR確定其存在，其中有39個(gè)豬場(chǎng)檢測(cè)到80個(gè)樣品結(jié)果呈陽性，陽性率為48.75%（39/80）[13]。在我國(guó)黃澤彬等人對(duì)豬SaV的流行病學(xué)抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陽性率為12.70%（24/189）[14]。關(guān)于豬腸道杯狀病毒與自然發(fā)病所知甚少，最近一項(xiàng)研究稱，在西班牙對(duì)腹瀉與未腹瀉的斷奶和未斷奶豬，用電鏡檢查豬杯狀病毒感染率并沒有明顯區(qū)別。在國(guó)內(nèi)，有關(guān)豬SaV感染有少量報(bào)道，但對(duì)于豬NoV和SaV仍處于起步階段。從目前已做過的非菌性胃腸炎暴發(fā)的調(diào)查中知道,許多都與被污染的食物或水有關(guān),因此糞-口傳播途徑可能是該病的傳播方式。

3 致病性研究進(jìn)展

NoV還沒有在體外培養(yǎng)成功，因此不能確定其理化和生物學(xué)特性。用人NoV的GⅡ人工感染無菌仔豬，74%（48/65）的仔豬出現(xiàn)輕度腹瀉，病理組織學(xué)檢查也顯示在豬的小腸端出現(xiàn)輕度病變，超過58.06%（18/31）的抽樣顯示在腸上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了病毒復(fù)制。SaV人工感染豬實(shí)驗(yàn)表明該病毒具有一定的致病性和潛在危害，經(jīng)口服和靜脈注射均能造成感染，主要的病理變化通常在十二指腸和空腸。在組織學(xué)上可導(dǎo)致小腸絨毛萎縮、變鈍、融合或缺失，隱窩細(xì)胞增生，并伴隨細(xì)胞漿空泡形成及單細(xì)胞浸潤(rùn)。在臨床上出現(xiàn)溫和到嚴(yán)重的腹瀉，參考對(duì)照組織培養(yǎng)液的豬均未出現(xiàn)癥狀?？赏ㄟ^抗血清免疫熒光試驗(yàn)證明病毒在腸細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并造成病毒血癥的發(fā)生[15]，其感染機(jī)制并沒有得到確認(rèn)。

4 診斷方法

NoV和SaV的病原和抗體檢測(cè)方法均有報(bào)道。通過電鏡（EM）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），能分別檢測(cè)出完整的病毒顆粒和病毒抗原；RTPCR和熒光定量RT-PCR能檢測(cè)出病毒RNA；重組病毒樣顆粒則被廣泛用作抗體ELISA檢測(cè)血清抗體的抗原。使用電子顯微鏡進(jìn)行病原檢測(cè)靈敏度較低，且NoV沒有特殊的杯狀病毒形態(tài)，因此從形態(tài)學(xué)上很難將杯狀病毒和其他腸道病毒如星狀病毒、小核糖核酸病毒相鑒別。而使用IEM雖然可提高其靈敏度，但由于需要高度熟練的技術(shù)和昂貴的設(shè)備及耗費(fèi)大量時(shí)間檢測(cè)單個(gè)樣品，因此電鏡觀察并不適用于做大量樣品的分析。目前，最高效的檢測(cè)方法是RT-PCR，它將病毒特定的核酸片段反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。因?yàn)樾蛄幸锏脑O(shè)計(jì)具有較高特異性，該方法節(jié)約時(shí)間和成本，可用于多種病毒檢測(cè)，因而成為常用的檢測(cè)方法。但是由于NoV和SaV的高度遺傳變異特性和多樣性及樣品的質(zhì)量和特異性擴(kuò)增的條件和方法的限制，目前還沒有一種方法能完全準(zhǔn)確地檢測(cè)到所有型別的PECV。

5 預(yù)防、控制和治療

目前對(duì)本病尚無特效治療藥物，主要靠加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生措施進(jìn)行預(yù)防。由于可能存在隱形排毒和母豬通過初乳母源抗體限制新生仔豬感染和發(fā)病，環(huán)境中長(zhǎng)期存在病原，病豬應(yīng)隔離到清潔、干燥和溫暖的豬舍，加強(qiáng)護(hù)理，盡量減少應(yīng)激因素，對(duì)受污染的豬舍進(jìn)行定期徹底的消毒，對(duì)發(fā)病和疑似患病豬糞便進(jìn)行無害化處理?？山o發(fā)病豬口服葡萄糖鹽水或復(fù)方葡萄糖溶液進(jìn)行對(duì)癥治療。

6 存在的問題

由于病毒的亞型眾多，及在自然狀態(tài)下發(fā)生重組現(xiàn)象，該病毒無法進(jìn)行培養(yǎng),不能建立動(dòng)物模型，也沒有簡(jiǎn)單敏感的診斷方法，都使得對(duì)該病毒的研究相對(duì)滯后，從而不能確定其流行范圍和危害程度。對(duì)PECV在體內(nèi)的復(fù)制、病毒和動(dòng)物機(jī)體的相互作用、致病機(jī)理、免疫應(yīng)答情況和相關(guān)疫苗都研究都甚少。因此對(duì)有效控制該病毒的傳播造成很大困難。

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