煙蚜繭蜂毒蛋白對(duì)寄主生長發(fā)育的影響

李艷紅

(吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 四平 136001)

煙蚜繭蜂(Aphidius gifuensis)是寄生蔬菜、果樹、棉花和大田作物上蚜蟲的一種寄生蜂。作為一種害蟲生物防治的重要因子，在溫室以及大田中，煙蚜繭蜂都起到了很重要的作用[1]。有關(guān)內(nèi)寄生蜂對(duì)鱗翅目寄主的作用國內(nèi)外有大量報(bào)道，但在半翅目蚜蟲上還很少，主要表現(xiàn)在寄主的免疫抑制與發(fā)育受阻上[2]，如寄主降低生長速度、延遲發(fā)育[3]，減少脫皮素的產(chǎn)量[4]，減少血淋巴細(xì)胞數(shù)目、轉(zhuǎn)化及改變行為[5]。寄生蜂產(chǎn)生的毒蛋白如毒液、萼液和畸形細(xì)胞均能產(chǎn)生這樣的生理作用[6]，但是，三者對(duì)寄主的作用又因種類而存在差異，如菜蛾盤絨繭蜂(Cotesia plutellae)寄生小菜蛾后，寄主不能正?；迹?種寄生因子均發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，單獨(dú)注射PDV或畸形細(xì)胞和毒液均能抑制寄主化蛹[7]。甲腹繭蜂(Cotesia inanitus)寄生寄主后，寄主不能正?；?，畸形細(xì)胞只在寄生寄主的初期出現(xiàn)，在這過程中，PDV和毒液起到了主要的作用。

本試驗(yàn)以寄生蜂產(chǎn)生的毒蛋白對(duì)寄主的生長和發(fā)育的影響為研究模式體系[8]，為了克服萼液、毒液和幼蜂作用的干擾以及作用劑量的不同，采用假寄生、過寄生和顯微注射畸形細(xì)胞的方法，來研究3種毒蛋白對(duì)寄主蚜蟲生長發(fā)育的影響[9]?？山沂炯纳渥饔糜诩闹鞯膬?nèi)部奧秘，并對(duì)指導(dǎo)寄生蜂的人工培養(yǎng)利用和害蟲綜合治理以及探索應(yīng)用生物科技控制害蟲等方面具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在遼寧省昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，通過蘿卜(Raphanus sativus L.)[(溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度70%～90%，每日光照周期L/D∶14/10(L夜間，D白天)，光照強(qiáng)度3000 Lx的人工氣候培養(yǎng)箱中)]連代擴(kuò)繁煙蚜繭蜂，羽化出蜂，經(jīng)鑒定確認(rèn)后，按雌雄蜂1∶1配對(duì)，交配后接種于預(yù)先繁殖有200～300頭煙蚜的盆栽蘿卜植株上，進(jìn)行擴(kuò)繁[10]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 被寄生寄主的獲得

將交配過的煙蚜繭蜂20頭移入指形管(Φ=1.5 cm，h=5 cm)內(nèi)，分別接入 2 齡末、3 齡、4齡初及4齡末若蚜20頭，一次寄生行為發(fā)生后，換以未接觸過蜂的同齡若蚜，控制每蜂寄生8～10頭；寄生頭數(shù)達(dá)到試驗(yàn)所需，記錄寄生時(shí)間；將寄生后的若蚜接入人工氣候箱內(nèi)隔離的鮮嫩蘿卜葉片上，供試?yán)ハx在上述條件下飼養(yǎng)。

1.2.2 雌蜂的處理

在無菌操作臺(tái)上，用紫外燈光照射交配過的雌蜂100頭3 h(在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，分別對(duì)交配過的雌蜂50頭用紫外燈照射0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h 和 4.0 h，然后，分別寄生50頭3～4齡若蚜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射3h的雌蜂寄生的蚜蟲的卵孵化率僅為3.6%)，隨后按上述方法讓其寄生2齡末、3齡、4齡初若蚜，每日解剖20頭被寄生各齡期寄主，觀察各處理寄生蜂卵孵化情況。以未經(jīng)照射處理的正常雌蜂寄生的同齡若蚜做比較，觀察假寄生對(duì)寄主若蚜發(fā)育的影響，同時(shí)以未寄生的同齡若蚜作對(duì)照。

1.2.3 畸形細(xì)胞的收集

在4℃無菌生理鹽水中解剖寄生5 d已消毒的僵蚜，用毛細(xì)吸管將吸入的畸形細(xì)胞，置于凹玻片上，經(jīng)生理鹽水多次沖洗去除寄主血細(xì)胞和組織后，再吸入到冰浴中的離心管內(nèi)，沉淀一定時(shí)間后，將上半部分棄去，將沉淀再用生理鹽水沖洗，直至無寄主血細(xì)胞及其他組織的殘留，在冰浴中保存立即用作顯微注射。畸形細(xì)胞注射前的活性由0.1%中性紅吸收和0.4%臺(tái)盼藍(lán)排斥進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 畸形細(xì)胞的注射

將100頭4齡的若蚜或假寄生后第7d的4齡若蚜用乙醚麻醉，用顯微注射器將吸入的畸形細(xì)胞從蚜蟲腹部注射，每頭蟲注射約1μL，同時(shí)注射等量的無菌生理鹽水作為對(duì)照。注射后，每日觀察蚜蟲的發(fā)育，100頭假寄生寄主被注射后，每日稱量注射后寄主的體重(0.0001 g)，并同時(shí)設(shè)注射生理鹽水和未經(jīng)注射的假寄生寄主的體重作為對(duì)照。

1.2.5 過寄生與假寄生的獲得

對(duì)3齡寄主進(jìn)行多次 (2～4次)寄生與假寄生，正常寄生1次與多次(2～4次)寄生，每日定時(shí)稱量寄主體重，均設(shè)同期未寄生寄主的體重變化為對(duì)照。以50頭供試若蚜為1個(gè)處理，設(shè)3次重復(fù)；觀察記錄寄主在不同寄生狀態(tài)下的生長發(fā)育情況，并測(cè)量最大寄主的體長和稱取體重。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒液與萼液和畸形細(xì)胞對(duì)寄主生長發(fā)育的影響

未寄生寄主的發(fā)育均快于假寄生和正常寄生寄主，寄生2 d后，正常寄生寄主達(dá)到顯著差異水平，到第5 d達(dá)到極顯著水平，說明寄生能引起寄主發(fā)育的抑制；但從寄生后第7 d起，未寄生寄主已發(fā)育成成蚜，假寄生寄主繼續(xù)取食發(fā)育，最大寄主體重可達(dá)0.93 mg，略超過對(duì)照未寄生寄主達(dá)到成蚜?xí)r的最大寄主體重0.91 mg(表1)。若蟲期延長，說明毒蛋白具有抑制若蟲發(fā)育的作用；正常寄生后，97.1%的被寄生雌蚜不能進(jìn)行孤雌生殖，這說明寄生蜂產(chǎn)生的畸形細(xì)胞具有抑制生殖的作用；但從假寄生寄主體重的增長趨勢(shì)來看，它與正常寄生不同，正常寄生后，寄主體重增長緩慢，這說明是畸形細(xì)胞起作用的結(jié)果。

表1 寄生對(duì)寄主體重的影響

2.2 不同劑量的毒液與萼液對(duì)寄主生長發(fā)育的影響

對(duì)被寄生寄主進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，在寄主體內(nèi)存在蜂卵，說明經(jīng)紫外燈處理的雌蜂仍能進(jìn)行產(chǎn)卵寄生，隨著對(duì)整個(gè)生育期的連續(xù)解剖，(96.4±2.8)%的蜂卵不能進(jìn)行孵化，并且絕大多數(shù)的蜂卵未能被寄主的免疫系統(tǒng)所識(shí)別而進(jìn)行血細(xì)胞包囊。假寄生的2齡末、3齡和4齡初寄主若蟲期延長，對(duì)一次假寄生的寄主而言，毒液與萼液劑量較低，若蟲期延長8～12 d，而多次假寄生的寄主，其劑量成2～4倍增加，當(dāng)發(fā)育到第11 d后，轉(zhuǎn)化成僵蚜，說明劑量增加對(duì)寄生生長和發(fā)育有明顯抑制作用。從圖中還可以看到，多次寄生寄主的體重均低于單次寄生寄主的體重，這也說明隨著毒液和萼液劑量的增加，對(duì)寄主體重有顯著的影響。

2.3 不同劑量的畸形細(xì)胞對(duì)寄主生長發(fā)育的影響

從圖2中可以看出，多次正常寄生寄主的體重低于單次寄生寄主的體重，說明隨著劑量增加，畸形細(xì)胞對(duì)寄主抑制作用增強(qiáng),同時(shí)也低于多次假寄生的寄主的體重，說明3種毒蛋白共同作用的結(jié)果超過了毒液與萼液的影響。當(dāng)寄主被寄生2d后，正常寄生的蜂卵即將孵化，同時(shí)畸形細(xì)胞體積逐漸增大，對(duì)寄主的生長抑制更為明顯，而假寄生寄主不存在這種情況。

圖2 四種寄生情況對(duì)寄主的影響

2.4 注射活體畸形細(xì)胞對(duì)寄主生長發(fā)育的影響

表2、3所示，注射畸形細(xì)胞與注射生理鹽水相比，寄主的體重降低，與未寄生寄主相比，體重增加緩慢，達(dá)到的最大體重也低于正常發(fā)育的寄主的體重，并從表中能夠看出，因?yàn)檠料x蟲體較小，注射器傷口造成的寄主死亡率較高。因此，產(chǎn)生寄主體重低的原因可能是畸形細(xì)胞和傷口共同造成的。

表2 注射畸形細(xì)胞對(duì)蚜蟲的生長發(fā)育的影響

表3 注射畸形細(xì)胞后對(duì)寄主體重的影響

3 結(jié)論與討論

雌蜂經(jīng)紫外燈處理后，雖能正常產(chǎn)卵，但產(chǎn)卵不能孵化，采用這種方法造成的假寄生能夠排除蜂卵孵化時(shí)釋放的畸形細(xì)胞的作用，單獨(dú)分析寄生蜂在產(chǎn)卵時(shí)注入體內(nèi)毒液和萼液對(duì)寄生蜂的作用。毒液和萼液使寄主蚜蟲取食期延長，發(fā)育歷期較未寄生寄主的也長。俞瑞鮮等(2006)[11]提出萼液對(duì)寄主的作用是通過毒液而實(shí)現(xiàn)的。而正常寄生后，在幼蜂即將結(jié)繭化蛹前，寄主停止取食，寄主轉(zhuǎn)化成僵蚜，這說明有畸形細(xì)胞和幼蜂的存在能明顯改變寄主的行為。從該研究結(jié)果分析認(rèn)為，幼蜂的存在是保證畸形細(xì)胞發(fā)揮作用的前提，首先是保證畸形細(xì)胞不被寄主血細(xì)胞包囊，之后各因素的協(xié)同效應(yīng)共同抑制寄主的發(fā)育，以確定保證幼蜂的發(fā)育。曹婷婷[12]得出了用0.05VRE濃度的毒液或0.05FE/μL濃度的毒液和萼液混合物處理離體條件下小菜蛾血細(xì)胞就失去了包囊作用。這說明蜂產(chǎn)卵初期由于毒液和萼液的作用，也抑制了寄主免疫系統(tǒng)的作用，使蜂卵進(jìn)行生長發(fā)育，伴隨著蜂卵的生長，產(chǎn)生的畸形細(xì)胞開始起到反包囊作用，進(jìn)而抑制或破壞寄主的免疫系統(tǒng)。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，單純注射畸形細(xì)胞后，寄主體重也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但下降的趨勢(shì)不如正常寄生中3種毒蛋白的影響顯著。

本試驗(yàn)采用的假寄生較注射的方式有其獨(dú)特的優(yōu)異性，首先它反映的是自然寄生時(shí)寄生因子生理劑量的效應(yīng)，避免了顯微注射人為的機(jī)械損傷以及劑量難以控制、生物活性的喪失等因素的干擾，能真正反映寄生因子的生理作用。但對(duì)于畸形細(xì)胞的研究我們通過與假寄生相結(jié)合的方式，一定程度上也能反映正常寄生情況下各種因子的作用。

從我們的研究來看，3種毒蛋白能影響寄主的生長發(fā)育，表現(xiàn)在體重降低，若蟲期延長等。有報(bào)道稱，多分DNA病毒也對(duì)特別是在寄生前期，但到寄生后期，則需畸形細(xì)胞的協(xié)同作用，共同抑制寄主的生長，以保證幼蟲在完成發(fā)育后順利從寄主中羽化出[13]。關(guān)于煙蚜繭蜂3種毒蛋白對(duì)寄主免疫系統(tǒng)和各種酶的影響將在未來的研究中進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)[14]。

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