玉米胚芽蛋白的堿法提取工藝及特性研究

任秀艷，曹 戈，王孟云，馬科佳，陳峰青，徐文秀，李旭燦

（廊坊師范學院生命科學學院，河北廊坊065000）

玉米胚芽是玉米淀粉工業(yè)和酒精工業(yè)的副產品，除含有營養(yǎng)價值極高的油脂外，還含有18%～22%的優(yōu)質蛋白質[1]。玉米胚芽蛋白的生物價高于大米和精制面粉，蛋白質功效比值（PER）與大豆蛋白、酪蛋白相當；玉米胚芽蛋白的氨基酸評分（AAS）在常用谷物中最高，氨基酸組成和雞蛋白非常相似，與FAO/WHO推薦的人類蛋白質標準具有較好的一致性，是一種優(yōu)質的蛋白質資源[2]。然而，目前國內對玉米胚芽主要偏重于油脂方面的研究，對玉米胚芽蛋白的研究報道較少，尤其對玉米胚芽蛋白功能性質的研究報道更為少見。我國是玉米種植大國，有豐富的玉米胚芽資源，為了很好地開發(fā)這一資源，對玉米胚芽蛋白功能性質的研究極為重要。

蛋白質的提取方法主要有物理法、堿法和酶法三種。物理法提取蛋白質，回收率較低，僅可作為玉米胚芽蛋白提取的輔助手段；酶法提取條件溫和、蛋白提取率較高，但該法技術性強、相對成本高，目前僅處于實驗階段[3]；堿法是經(jīng)典的蛋白質提取方式，特別是在果實、種子等作物的蛋白質提取中應用廣泛，雖然在提取過程中會部分改變蛋白理化及營養(yǎng)特性，但該方法得率高、成本低、適合工業(yè)化生產，仍被認為是一種蛋白提取的有效方法[4]。

目前對玉米胚芽蛋白提取的研究中，多強調蛋白提取率，忽視了對蛋白特性的研究，進而影響了它在食品加工領域的應用。本實驗以玉米胚芽粕為原料，采用堿法提取蛋白，主要目的是通過對影響玉米胚芽蛋白提取因素的考察，得出玉米胚芽粕蛋白的最佳提取條件，同時對所得到的玉米胚芽蛋白的特性進行研究，為玉米胚芽蛋白的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米胚芽粕 經(jīng)高溫榨取提油后，粉碎過100目篩；大豆油 金龍魚牌，購自廊坊元辰超市；其他試劑 均為分析純。

78-1型恒速攪拌器 常州國華電器有限公司；ZSBB-712型數(shù)控恒溫水浴鍋 上海智誠分析儀器制造有限公司；FA1004型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ESB-500型擺式高速粉碎機 上海易勒機電有限公司；Anke TDL-40B型臺式高速大容量冷凍離心機 上海安平科學儀器廠；ZRD-5210型全自動新型鼓風干燥箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；PHSJ-4A型pH計 上海精密科學儀器有限公司；FS-1型分散器 金壇市精達儀器制造廠；UV2100型紫外可見分光光度計 貴州賽蘭博科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米胚芽蛋白提取工藝 稱取50g玉米胚芽粕置于三角瓶中，加45mL蒸餾水，用1mol/L NaOH調pH8.5，于30℃恒溫振蕩提取2h，4000r/min離心20min，上清液用0.1mol/L HCl調節(jié)pH至等電點，靜置沉淀，4000r/min離心20min，沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，得到玉米胚芽蛋白。

1.2.2 蛋白質含量和提取率測定 蛋白質含量采用微量凱氏定氮法（換算系數(shù)6.25）測定。

式中，W1—提取物中蛋白質的質量（g）；W0—玉米胚芽粕中蛋白質的質量（g）。

1.2.3 氨基酸分析 采用RP-HPLC在254nm檢測波長下測定玉米胚芽蛋白的氨基酸組成，處理好的樣品采用PICO.TAG氨基酸柱分析，測定溫度為38℃，流速1mL/min。

1.2.4 蛋白溶解度測定 稱取0.5g玉米胚芽蛋白，加10mL不同pH的溶液，經(jīng)磁力攪拌器攪拌30min后，4000r/min離心15min，用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質的質量。

式中，C1—上清液中蛋白質的質量（g）；C0—樣品中蛋白質的質量（g）。

1.2.5 蛋白乳化性測定 取5%的蛋白溶液50mL，加入50mL大豆油，用高速分散器在12000r/min下分散2min，1500r/min離心5min，測量液體總高度和乳化層高度。

式中，H1—乳化層高度（cm）；H0—離心管液體總高度（cm）。

1.2.6 蛋白持水性測定 稱取1.5g玉米胚芽蛋白置于（聚碳酸酯）離心管中，稱重m1。加10mL蒸餾水，振蕩搖勻，使樣品分散于水中。然后將裝有玉米胚芽蛋白質溶液的離心管放在60℃恒溫水浴鍋中保溫30min，后在冷水中冷卻30min，再4000r/min離心30min，倒上清液，稱重離心管和沉淀的重量m2，并計算每克玉米胚芽蛋白的持水力（WHC），計算公式如下：

式中，m1—玉米胚芽粕和離心管的重量（g）；m2—蛋白沉淀和離心管的重量（g）。

1.2.7 蛋白持油性測定 稱取1.5g玉米胚芽蛋白置于離心管中，稱重m1，加入10mL大豆油，調節(jié)pH為7.0，混合均勻，在80℃恒溫水浴鍋中保溫30min，后在冷水中冷卻30min，再4000r/min離心30min，倒出上清液，稱重離心管和沉淀的重量m2，并計算每克玉米胚芽蛋白的持油力，計算公式如下：

式中，m1—玉米胚芽粕和離心管的重量（g）；m2—蛋白沉淀和離心管的重量（g）。

1.2.8 蛋白起泡性測定 配1%玉米胚芽蛋白溶液5mL，用高速分散器在12000r/min下分散2min，讀取泡沫體積。

式中，V—泡沫的體積（mL）；V0—溶解樣品水溶液的體積（mL）。

1.2.9 實驗設計

1.2.9.1 單因素實驗 分別對影響玉米胚芽蛋白的提取的4個主要條件，即料液比、pH、提取溫度、提取時間進行單因素實驗。單因素實驗中除了變量以外所選取的固定條件分別為：料液比1∶12、pH9、提取溫度50℃、提取時間3.5h。

1.2.9.2 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結果，選取料液比、pH、提取溫度、提取時間4個因素，以蛋白提取率為考察指標，進行四因素三水平正交實驗。實驗設計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對蛋白提取率的影響 設置不同的料液比（1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18）在pH9、溫度為50℃、提取時間3.5h下進行蛋白提取，結果如圖1所示。由圖1可知，當料液比低于1∶12時，玉米胚芽蛋白提取率明顯升高，當料液比為1∶12時，蛋白提取率可達最大值，此結果與顧尤[5]的研究結果相似。當料液比介于1∶12～1∶18之間時，玉米胚芽粕蛋白提取率隨提取液的增加略有下降，但變化不明顯。因此，玉米胚芽粕蛋白提取最適料液比為1∶12。

2.1.2 pH對蛋白提取率的影響 分別選取不同的pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）在料液比1∶12、溫度50℃、時間3.5h下進行蛋白提取，結果如圖2所示。由圖2可知，隨著pH的增加，玉米胚芽蛋白提取率呈先上升后下降的趨勢，在pH達9.5時，蛋白提取率最大，其原因是隨pH的增加，蛋白質與水之間的相互作用力增強，蛋白溶解性提高，進而使蛋白提取率明顯上升。當pH為9.5～10.0時，蛋白提取率開始下降。已有實驗證明，堿濃度過高會導致溶液中淀粉發(fā)生糊化現(xiàn)象，而是溶液粘度增加[6]，進而導致蛋白提取率下降。另外，pH過高容易使蛋白質分子脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，同時會發(fā)生“胱賴反應”，把氨基酸轉化成有毒的化合物，影響蛋白的安全性[7-8]，因此，玉米胚芽蛋白提取的最適pH為9.5。

圖1 料液比對玉米胚芽蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of solvent/solid ratio on the extract content of protein

圖2 pH對玉米胚芽蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extract content of protein

圖3 提取溫度對玉米胚芽蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extract content of protein

2.1.3 溫度對蛋白提取率的影響 分別選取不同溫度（30、40、50、60、70℃）在料液比1∶12、pH9、提取時間為3.5h下測定玉米胚芽蛋白提取率，結果見圖3。由圖3可知，隨著溫度的升高，蛋白提取率呈先升后降的趨勢，結果與張娜等的結果相似[9]，當溫度達到40℃時，蛋白提取率最大。溫度在30～40℃時，蛋白提取率隨溫度升高而上升，其原因可能是溫度適當升高會使蛋白質分子的構象發(fā)生變化，立體結構的伸展對蛋白有一定的增溶效果[10]。當溫度超過40℃時，蛋白提取率隨溫度的升高而下降。原因可能是溶液中殘留的淀粉由于溫度的升高而逐漸產生糊化現(xiàn)象，使溶液粘度增加，阻礙了提取時蛋白質的析出，從而造成提取率的降低[11]。因此，最佳提取溫度為40℃。

2.1.4 提取時間對蛋白提取率的影響 分別設置不同提取時間（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）在料液比1∶12、pH9、提取溫度為50℃下測定蛋白提取率，結果如圖4所示。由圖4可知，隨著提取時間的延長，玉米胚芽蛋白質提取率呈先上升后下降的趨勢，在提取時間為3.5h時，蛋白提取率最大，達到21.96%。在時間較短時，蛋白質的總提取率較低，可能是因為短時間內蛋白質沒有得到充分溶解；在3.5h后蛋白提取率下降，可能是因為隨著浸提時間的延長，蛋白質會被微生物感染而變質[12]，從而導致蛋白質提取率下降。因此，玉米胚芽粕蛋白提取最適提取時間為3.5h。

圖4 提取時間對玉米胚芽蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extract content of protein

2.2 正交實驗

由表2的極差分析可知，各因素對提取效果的影響是不同的，順序為料液比＞pH＞提取溫度＞提取時間，最佳組合為A2B2C2D3，即料液比1∶12、pH9.5、溫度50℃、時間4h。按此優(yōu)化條件進行實驗驗證，玉米胚芽粕蛋白提取率為23.05%，驗證結果表明，此優(yōu)化工藝條件可行。

由表3方差分析結果可以看出，料液比和提取液pH對胚芽蛋白提取率的影響是顯著的，而溫度和提取時間的影響相對較弱。

2.3 玉米胚芽粕蛋白的特性研究

2.3.1 玉米胚芽粕蛋白氨基酸分析 由玉米胚芽粕蛋白的氨基酸分析結果（表4）可知，谷氨酸是玉米胚芽蛋白中含量最高的氨基酸，其含量為每100g胚芽蛋白中含有6765.03mg，其次是精氨酸，其含量為每100g胚芽蛋白中含有4265.81mg；且玉米胚芽蛋白中富含人體必須的八種氨基酸，其中纈氨酸和亮氨酸含量較高，分別為每100g胚芽蛋白中含1887.58mg和 2312.16mg。

表2 正交實驗方案及結果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

2.3.2 玉米胚芽粕蛋白的溶解性 由圖5中可知，pH在2～9范圍內時，玉米胚芽粕蛋白的pH-溶解度曲線基本符合“V”字形，pH大于9.0時，蛋白溶解度下降。在pH2～5范圍內，其溶解度較低，特別是在pH為4.0時，由于接近蛋白的等電點，其溶解度約為20%，但隨著pH的增加，蛋白溶解度明顯增加，當pH達到9時，80%的蛋白質都已溶解，說明pH對蛋白的溶解性影響較大。這種溶解度的變化反映酸堿處理對蛋白質二三級構象的改變作用[13]。在等電點附近蛋白質多肽鏈之間的靜電排斥作用受到抑制，以及蛋白質間的相互作用超過蛋白質與溶劑間的相互作用而引起了聚集反應，從而破壞了蛋白質的空間結構。pH大于9.0時，其溶解度下降，原因是由于強堿的作用是溶液中殘留的淀粉產生糊化現(xiàn)象，使溶液粘度增大，蛋白不易析出，從而使蛋白溶解度下降。

圖5 玉米胚芽蛋白的溶解度Fig.5 Solubility of corn germ meal protein

2.3.3 玉米胚芽蛋白加工特性 蛋白質產品在食品工業(yè)的應用范圍取決于其加工特性。玉米胚芽蛋白的持水性為211.6%，低于酪蛋白（248%）；其持油性為444.8%，顯著高于酪蛋白（172%）[14]和大豆分離蛋白（216%），這說明其表面含有較多的疏水因子，進而表現(xiàn)出強持油性和弱持水性，因此玉米胚芽蛋白可以應用于烘培食品、油炸食品和面制品中。

乳化特性是利用蛋白質分子結構中的親水和親油基團，吸附在油-水界面上，形成一層膜，從而阻止油滴的聚集，達到穩(wěn)定乳化的作用[15]。玉米胚芽蛋白的乳化特性高于酪蛋白（48%）和秈米蛋白（45%），這說明該蛋白在油水界面具有較強的形成連續(xù)相的能力[16]。因此，玉米胚芽蛋白可用于罐頭食品、乳制品（人造乳、豆奶和豆奶酪等）和肉制品加工（香腸、肉丸和肉湯等）中。

起泡性反映了蛋白質溶解擴散到氣/水界面，并能在氣/水界面發(fā)生構象轉變的能力[17]。蛋白質的發(fā)泡性可以賦予食品以疏松的結構和良好的口感。玉米胚芽蛋白的起泡性高于酪蛋白（14.3%），因此玉米胚芽蛋白可用于蛋糕面糊、人造稠黃油、飲料、餐后甜點和蜜餞的制作中。

表4 玉米胚芽蛋白的氨基酸組成Table 4 Compositions and contents of amino acids in corn germ meal protein

表5 玉米胚芽蛋白的加工特性Table 5 Processing properties of corn germ meal protein

3 結論

本文研究了各種因素對玉米胚芽蛋白提取率的影響，通過正交實驗優(yōu)化了提取條件，確定了最佳提取條件為液料比為1∶12、pH9.5，提取溫度50℃，提取時間4h，在此條件下提取玉米胚芽蛋白，提取率達到23.05%。這個結果顧尤等[5]對玉米胚芽進行蛋白質提取時的蛋白提取率（14%～17%）。為了進一步提高蛋白提取率，我們在后期的研究中采用堿酶兩步法對玉米胚芽蛋白進行提取[18]。蛋白得率已有所提高。采用傳統(tǒng)的“堿溶酸沉”及酶解相結合的方法提取玉米胚芽蛋白，簡單可行，既適應工業(yè)化生產的需求，又避免了目前玉米胚芽粕的大量浪費或者只是進行簡單脫毒處理作為動物飼料。綜合我國玉米餅粕的豐富資源與其低利用率間的矛盾問題，本研究的實施具有一定的應用價值。

通過液相色譜分析可知，玉米胚芽蛋白中谷氨酸和精氨酸含量較高，均在10%以上，且玉米胚芽蛋白中富含人體所需的八種氨基酸；另外，該蛋白具有良好的溶解性、乳化性、起泡性、持水性和持油性。

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