模擬代謝性內(nèi)毒素血癥對(duì)肝損傷小鼠肝組織TLR4信號(hào)通路的影響*

徐正婕，李楠，何崇信，范建高

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

模擬代謝性內(nèi)毒素血癥對(duì)肝損傷小鼠肝組織TLR4信號(hào)通路的影響*

徐正婕，李楠，何崇信，范建高

目的觀察持續(xù)4 w的模擬代謝性內(nèi)毒素血癥對(duì)小鼠肝臟組織病理和4型Toll樣受體（TLR4）信號(hào)通路的影響。方法將30只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組（n=10）和內(nèi)毒素組（n=10），均予以普通飼料喂養(yǎng)，和高脂組（n=10），予以高脂飼料喂養(yǎng)。內(nèi)毒素組小鼠同時(shí)經(jīng)腹部皮下植入的微泵注入內(nèi)毒素300 μg·kg-1·d-1，連續(xù)4 w，正常組小鼠皮下微泵持續(xù)注入生理鹽水作為對(duì)照。4 w后測(cè)定小鼠血清內(nèi)毒素水平，對(duì)肝組織切片行HE染色后進(jìn)行非酒精性脂肪性肝病評(píng)分（NAS），采樣Real time PCR法測(cè)定小鼠肝組織TLR4及其下游的MyD88和TRIF-related adaptor molecule（TRAM）mRNA水平。結(jié)果內(nèi)毒素組小鼠血清內(nèi)毒素水平（0.62±0.04 EU/ml）顯著高于正常組（0.50±0.06 EU/ml，P＜0.05）和高脂組（0.49±0.05 EU/ml，P＜0.05）；內(nèi)毒素組小鼠肝組織主要表現(xiàn)為單純性脂肪變性，NAS積分為（2.30±0.49），高脂組小鼠肝組織炎癥較明顯，NAS積分為（4.20±1.61），顯著高于內(nèi)毒素組（P＜0.05）；與正常組相比，內(nèi)毒素組小鼠肝組織TLR4mRNA水平上調(diào)5.12倍（P＜0.01），TRAM mRNA水平上調(diào)3.46倍（P＜0.01），而MyD88 mRNA水平與正常組比，無顯著差別。結(jié)論持續(xù)4 w的模擬代謝性內(nèi)毒素血癥可誘導(dǎo)小鼠肝臟單純性脂肪變性，TLR4 mRNA和TRAM mRNA水平上調(diào)，而MyD88 mRNA水平無顯著變化。

非酒精性脂肪性肝??；代謝性內(nèi)毒素血癥；高脂飲食；4型Toll樣受體；小鼠

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，肝臟則是腸源性內(nèi)毒素的首過器官[1～3]。既往內(nèi)毒素一直被認(rèn)為是NAFLD發(fā)病機(jī)制中的“第二次打擊”因子之一[4～8[9～11]，而低水平的“代謝性內(nèi)毒素血癥”對(duì)肝臟病變的影響尚不清楚。4型Toll樣受體（Toll-like receptor 4，TLR4）是內(nèi)毒素受體。TLR4激活細(xì)胞內(nèi)下游的myeloid differentiation factor 88（MyD88）依賴和（或）非MyD88依賴途徑，前者由MyD88介導(dǎo)，活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κβ和AP-1，引起促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6等的基因轉(zhuǎn)錄[12]，后者由Toll/ IL-1 receptor-domain-containing adaptor inducing interferon-β（TRIF）和TRIF-relatedadaptor molecule（TRAM）介導(dǎo)，通過活化干擾素調(diào)節(jié)因子-3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）促使IFN-β的生成。我們?cè)诩韧难芯恐邪l(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD/非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝臟出現(xiàn)TLR4表達(dá)水平上調(diào)[13]，并與NASH的發(fā)生相關(guān)[14]。高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD/NASH動(dòng)物肝臟TLR4表達(dá)的增強(qiáng)可能與多個(gè)因素，如高脂飲食誘導(dǎo)的“代謝性內(nèi)毒素血癥”相關(guān)。此外，高脂飲食所含有的脂肪酸本身或通過其它信號(hào)途徑也可以激活和上調(diào)TLR4。但是，目前這些因素對(duì)TLR4兩條下游信號(hào)通路的影響也不清楚。本研究采用持續(xù)4 w皮下注入小劑量?jī)?nèi)毒素小鼠模型，并與持續(xù)4 w高脂飲食小鼠相比較，以觀察模擬代謝性內(nèi)毒素血癥對(duì)肝臟病變和TLR4信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型30只清潔級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量19～20 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證為“SR×R（滬）2008-0016”。飼養(yǎng)小鼠于我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，分6籠，每籠5只，室內(nèi)溫度維持在20℃～29℃，自由進(jìn)食和飲用無菌水。給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，將小鼠隨機(jī)分成3組，給予正常組（n=10）和內(nèi)毒素組（n=10）普通飼料喂養(yǎng)4 w，給予高脂組（n=10）高脂飼料（88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇）喂養(yǎng)4 w。內(nèi)毒素組小鼠同時(shí)經(jīng)腹部皮下植入微泵，持續(xù)注入內(nèi)毒素300 μg.kg-1.d-1，連續(xù)4 w。正常組小鼠經(jīng)皮下微泵持續(xù)注入生理鹽水作為對(duì)照。在造模4 w后，所有小鼠禁食12 h，經(jīng)眼球采血。收集血液于無致熱原試管中，室溫靜置30 min，在4℃高速離心機(jī)下3000 r/m離心15 min，取血清，分裝后置于-80℃冰箱保存；迅速摘除肝臟組織，稱量肝臟濕質(zhì)量，切取肝右葉肝組織約1×1×0.5 cm大小，置于10%中性甲醛液固定；取肝右葉適度大小組織塊，分裝于凍存管內(nèi)，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血清內(nèi)毒素檢測(cè)采用鱟試劑終點(diǎn)比色法檢測(cè)血清內(nèi)毒素水平（廈門鱟試劑廠有限公司）。

1.3 肝組織學(xué)檢查常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色。在200倍光鏡下，根據(jù)非酒精性脂肪性肝病計(jì)分（NAFLD activity score，NAS）標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行肝脂肪變性和炎癥分級(jí)檢查。NAS計(jì)分包括，（1）肝脂肪變性，0分：脂肪變細(xì)胞＜5%；1分：5%～33%；2分：34%～66%；3分：＞66%。（2）小葉內(nèi)炎癥，0分：無；1分：＜2個(gè)；2分：2～4個(gè)；3分：＞4個(gè)。（3）肝細(xì)胞氣球樣變，0分：無；1分：少量氣球樣變細(xì)胞；2分：多見。NAS＝1＋2＋3（0～8分），NAS＜3分可排除NASH，NAS≥5分則可診斷為NASH，介于兩者之間者為NASH可能。

1.4 肝組織TLR4、MyD88和TRAM mRNA水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，提取小鼠肝組織總RNA，合成cDNA第一鏈。設(shè)計(jì)并合成引物，引物序列如下：TLR4-Sense：5’-CTCTCCTGCGTGAGACCAG-3’，Antisense:5’-TCCATGCATTGATAAGTAATATTAGGA-3’；MyD88：Sense5’-CTGCTCGAGCTGCTTACCA-3’，Antisense:5’-CTTTTGGCAATCCTCCTCAA-3’；TRAM：Sense:5’-CGATCAAGACGGCCATGAGTC-3’，Antisense:5’-CTCGTCGGTGTCATCTTCTGC-3’；β-actin：Sense:5'-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，Antisense:5'-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3'。配制反應(yīng)液，設(shè)置反應(yīng)程序，應(yīng)用ABI 7500實(shí)時(shí)PCR儀獲得目的基因擴(kuò)增曲線及CT值，采用2-△△ct法對(duì)各組CT值進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（），采用方差分析進(jìn)行多組間比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清內(nèi)毒素水平正常組和高脂組小鼠血清內(nèi)毒素水平無明顯差異[（0.50±0.06）對(duì)（0.49±0.05）EU/ml，P＞0.05]，內(nèi)毒素組小鼠血清內(nèi)毒素水平[（0.62±0.04）EU/ml]顯著高于正常組（P＜0.05，圖1）。

2.2 小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)在光鏡下，正常組小鼠肝組織未見異常；內(nèi)毒素組小鼠肝組織病理學(xué)變化以單純性脂肪變?yōu)橹饕卣?，小鼠肝臟出現(xiàn)輕到中度脂肪變性，未觀察到明顯的小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無肝細(xì)胞氣球樣變；高脂組小鼠也表現(xiàn)為肝臟脂肪變性，以中度為主，小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較內(nèi)毒素組明顯，2只小鼠出現(xiàn)肝細(xì)胞氣球樣變（圖2）。根據(jù)NAS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在10只高脂組小鼠中3只診斷為NASH（NAS≥5分），7只診斷為NASH可能（3≤NAS≤4之間，表1），而內(nèi)毒素組所有小鼠均未達(dá)到NASH的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 小鼠血清內(nèi)毒素水平比較內(nèi)毒素組顯著高于其他兩組（*P＜0.05）

表1 小鼠肝組織NAS評(píng)分（）比較

表1 小鼠肝組織NAS評(píng)分（）比較

圖2 小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）

與正常組比，①P＜0.01；②P＜0.05；與高脂組比，③P＜0.05

2.3 小鼠肝組織TLR4 mRNA水平比較與正常組小鼠比，高脂組小鼠（8.73倍，P＜0.01）和內(nèi)毒素組小鼠（5.12倍，P＜0.01）肝組織TLR4 mRNA水平均明顯增高，而高脂組小鼠又明顯高于內(nèi)毒素組小鼠（P＜0.05）；與正常組小鼠比，高脂飲食小鼠肝組織MyD88 mRNA（4.73倍）和TRAM mRNA（2.94倍）水平均明顯升高（P＜0.01），而內(nèi)毒素注射小鼠僅有TRAM mRNA（3.46倍）水平顯著升高（P＜0.01，圖3）。

圖3 小鼠肝組織TLR4、MyD88和TRAM mRNA水平比較

3 討論

本研究觀察了模擬代謝性內(nèi)毒素血癥對(duì)小鼠肝臟病理損傷的影響。結(jié)果顯示，持續(xù)4周的輕度內(nèi)毒素血癥可以使小鼠肝臟出現(xiàn)輕到中度的單純性脂肪變性，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及肝細(xì)胞氣球樣變性。

綜合目前關(guān)于代謝性內(nèi)毒素血癥、機(jī)體輕度炎癥狀態(tài)和胰島素抵抗的文獻(xiàn)以及本研究結(jié)果，我們作如下推論：輕度內(nèi)毒素血癥可誘導(dǎo)脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)并釋放炎癥因子，導(dǎo)致甘油三脂被脂解為脂肪酸增加，脂肪組織-肝軸的“脂肪酸流”增多，進(jìn)入肝臟代謝后引起肝細(xì)胞脂肪變性。Miele et al曾報(bào)道，在35例肝活檢病理證實(shí)的NAFLD患者中，腸黏膜通透性增加的程度以及小腸細(xì)菌過度生長(zhǎng)的患病率與肝臟脂肪變性密切相關(guān)，而與脂肪性肝炎無關(guān)[15]。這一臨床研究的結(jié)果支持我們的推論。

我們同時(shí)還觀察了高脂飲食4周小鼠的肝臟病理學(xué)表現(xiàn)。高脂飲食所誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織變化隨著高脂飲食配方的不同而不同?？偟恼f來，配方中脂肪的含量越高，內(nèi)毒素血癥及其他代謝紊亂出現(xiàn)的時(shí)間越早，程度越重。Cani et al用含72%脂肪（豬油和玉米油）的無碳水化合物高脂飲食，4周就誘導(dǎo)小鼠發(fā)生內(nèi)毒素血癥[5]。我們所采用的高脂飲食配方脂肪含量較低，豬油僅占10%，從而更接近人類日常高脂飲食中飽和脂肪酸的比例。給予此種高脂飲食8周，大鼠呈現(xiàn)單純性脂肪肝，未出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥。12周呈現(xiàn)脂肪性肝炎伴有門靜脈內(nèi)毒素血癥[16]。而從第9周起，給予高脂飲食大鼠口服環(huán)丙沙星可使血清內(nèi)毒素維持在較低水平，肝臟脂肪變及炎癥浸潤(rùn)程度均明顯減輕[14]。在同樣配方的高脂飲食喂養(yǎng)4周的小鼠，未見內(nèi)毒素血癥，卻出現(xiàn)了中度脂肪變性，小葉內(nèi)炎癥的程度明顯重于內(nèi)毒素注射4周的小鼠，甚至有3/10只小鼠達(dá)到NASH診斷標(biāo)準(zhǔn)。因此我們認(rèn)為，高脂飲食誘導(dǎo)肝臟脂肪變性和炎癥涉及多種機(jī)制，代謝性內(nèi)毒素血癥只是其中之一，而代謝性內(nèi)毒素血癥可能不是高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD/NASH的必要條件。

本研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)模擬代謝性內(nèi)毒素血癥或高脂飲食均可引起小鼠肝組織TLR4 mRNA水平上調(diào)，但是后者的作用更強(qiáng)，提示高脂飲食所誘導(dǎo)的肝臟TLR4激活并不依賴于代謝性內(nèi)毒素血癥的存在。有趣的是，兩者激活TLR4下游信號(hào)通路的強(qiáng)度也有所不同。輕度內(nèi)毒素血癥引起TRIF通路的TRAM表達(dá)增強(qiáng)，而對(duì)MyD88無明顯影響，而高脂飲食則使TRAM和MyD88水平均上調(diào)。該結(jié)果一方面提示代謝性內(nèi)毒素血癥激活TLR4后可能通過TRIF/TRAM信號(hào)通路來影響肝臟，不依賴于傳統(tǒng)的MyD88通路，另一方面也提示高脂飲食可能通過多種途徑來激活TLR4信號(hào)通路，從而對(duì)兩條下游信號(hào)通路均有影響。因?yàn)槟壳岸鄶?shù)研究仍局限于體外實(shí)驗(yàn)，來自于高脂飲食的飽和脂肪酸本身是否確實(shí)能夠直接激活細(xì)胞TLR4信號(hào)通路尚有爭(zhēng)議。Li et al認(rèn)為，在高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD的第4周，游離脂肪酸可誘導(dǎo)肝細(xì)胞生成高遷移率族蛋白B1，后者作為配體可激活TLR4/MyD88信號(hào)途徑[17]。

總之，本研究顯示持續(xù)模擬代謝性內(nèi)毒素血癥4周可使小鼠肝臟出現(xiàn)單純性脂肪變性，TLR4 mRNA水平上調(diào)，TLR4下游的TRAM水平增強(qiáng)，而對(duì)MyD88無影響。給予高脂飲食4周則使小鼠肝臟出現(xiàn)脂肪性肝炎，TLR4 mRNA水平高于模擬代謝性內(nèi)毒素血癥小鼠，使TRAM和MyD88水平均上調(diào)。

[1]Ley RE，Turnbaugh PJ，Klein S，et al.Microbial ecology:human gut microbes associated with obesity.Nature，2006，444（7122）: 1022-1023.

[2]Neish AS.Microbes in gastrointestinal health and disease.Gastroenterology，2009，136（1）:65-80.

[3]Pendyala S，Walker JM，Holt PR.A high-fat diet is associated with endotoxemia that originates from the gut.Gastroenterology，2012，142（5）:1100-1101.

[4]Laugerette F，Vors C，Peretti N，et al.Complex links between dietary lipids，endogenous endotoxins and metabolic inflammation.Biochimie，2011，93（1）:39-45.

[5]Cani PD，Amar J，Iglesias MA，et al.Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance.Diabetes，2007，56（7）:1761-1772.

[6]Mehta NN，McGillicuddy FC，Anderson PD，et al.Experimental endotoxemia induces adipose inflammation and insulin resistance in humans.Diabetes，2010，59（1）:172-181.

[7]Rabot S，Membrez M，Bruneau A，et al.Germ-free C57BL/6J mice are resistant to high-fat-diet-induced insulin resistance and have altered cholesterol metabo-lism.FASEB J，2010，24（12）:4948-4959.

[8]Kemp DM.Does chronic low-grade endotoxemia define susceptibility of obese humans to insulin resistance via dietary effects on gut microbiota.Adipocyte，2013，2（3）:188-190.

[9]Yang SQ，Lin HZ，Lane MD，et al.Obesity increases sensitivity to endotoxin liver injury:implications for the pathogenesis of steatohepatitis.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（6）:2557-2562.

[10]徐正婕，范建高，王國(guó)良，等.小劑量?jī)?nèi)毒素導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎大鼠急性肝功能衰竭.中華肝臟病雜志，2004，12（4）: 244-245.

[11]Day CP.Pathogenesis of steatohepatitis.Balliere's Best Pract Res Clin Gastroenterol，2002，16（5）:663-678.

[12]Roh YS，Seki E.Toll-like receptors in alcoholic liver disease，non-alcoholic steatohepatitis andcarcinogenesis.J Gastroenterol Hepatol，2013，28（Suppl 1）:38-42.

[13]徐正婕，范建高，王興鵬，等.大鼠非酒精性脂肪性肝炎內(nèi)毒素受體表達(dá)上調(diào).中華肝臟病雜志，2006，14（1）:50-53.

[14]李楠，徐正婕，范建高，等.口服抗生素對(duì)NASH大鼠肝組織TLR4信號(hào)通路的影響.實(shí)用肝臟病雜志，2012，15（4）:299-302.

[15]Miele L，Valenza V，La Torre G，et al.Increased intestinal permeability and tight junction alterations innonalcoholic fatty liver disease.Hepatology，2009，49（6）:1877-1887.

[16]范建高，徐正婕，王國(guó)良，等.大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成過程中血清內(nèi)毒素含量的改變.中華肝臟病雜志，2003，11（2）:73-76.

[17]Li L，Chen L，Hu L，et al.Nuclear factor high-mobility group box1 mediating the activation of Toll-like receptor 4 signaling in hepatocytes in the early stage of nonalcoholic fatty disease. Hepatology，2011，54（5）:1620-1630.

（收稿：2014-04-30）

（校對(duì)：陳從新）

Influence of mimic metabolic endotoxemia on hepatic histology and TLR4 signaling pathway in mice

Xu Zhengjie，Li Nan，He Chongxin，et al.Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital，Affiliated to Jiaotong University of Medical School，Shanghai 200092

ObjectiveTo observe the influence of 4-week mimic metabolic endotoxemia on hepatic histology and Toll-like receptor 4（TLR4）signaling pathway in mice.MethodsThirty male C57BL/6J mice were randomly divided into normal（n=10）and endotoxin（n=10）groups，fed with normal diet，and high-fat（n=10）group，fed with high-fat diet.The mice in endotoxin group were implanted with subcutaneous osmotic minipump to infuse endotoxin at 300 μg·kg-1·d-1for 4 weeks.The mice in normal group were implanted with minipump filled with saline as control.At the end of the 4th week，the serum endotoxin level were detected.NAFLD activity score（NAS）of liver tissue was evaluated.The mRNA levels of hepatic TLR4，MyD88 and TRAM were detected by real time PCR.ResultsSerum endotoxin level in endotoxin group[（0.62±0.04）EU/ml]was significantly higher than that in normal group[（0.50±0.06）EU/ml，P＜0.05]and in high-fat group[（0.49±0.05）EU/ml，P＜0.05]；The dominant histology change of liver in endotoxin mice was simple steatosis and the NAS score was（2.30±0.49），while the mice in high-fat group had more severe hepatic inflammation and the NAS score was（4.20±1.61），which was significantly higher than that in the endotoxin group（P＜0.05）；The TLR4 mRNA level in endotoxin group was 5.12 times higher（P＜0.01）and TRAM mRNA level was 3.46 times higher（P＜0.01）as compared with in normal group，but the MyD88 mRNA levels in the three groups had no significant difference.ConclusionFour-week mimic metabolic endotoxemia induces hepatic steatosis with increased levels of hepatic TLR4 and TRAM mRNA，but has no effect on the hepatic MyD88 mRNA.

Nonalcoholic fatty liver disease；Metabolic endotoxemia；High-fat diet；Toll-like receptor 4；Mice

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃973項(xiàng)目（2012CB517501）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81070322，81270491）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研基金（09140903500，10411956300）；上海市衛(wèi)生局新百人計(jì)劃項(xiàng)目（XBR2011007）；王寶恩肝纖維化基金項(xiàng)目20110006

200092上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化科（徐正婕，何崇信，范建高）；浙江醫(yī)院消化科（李楠）

徐正婕，女，41歲，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。主要從事脂肪肝防治研究。E-mail:ajanexu@163.com

范建高，E-mail:fanjiangao@gmail.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.06.014