外周血DNT細胞和T細胞亞群檢測在乙型肝炎病毒感染者診斷中的意義*

杜振華，鮑布和，王仁杰，任黨利，張明華，劉冀琴

·病毒性肝炎·

外周血DNT細胞和T細胞亞群檢測在乙型肝炎病毒感染者診斷中的意義*

杜振華，鮑布和，王仁杰，任黨利，張明華，劉冀琴

目的探討乙型肝炎病毒感染者外周血CD3+CD4-CD8-T細胞（DNT）和T細胞亞群的變化及意義。方法使用流式細胞儀檢測136例乙型肝炎病毒感染者，包括33例無癥狀攜帶者、28例急性乙型肝炎患者、28例輕度慢性乙型肝炎患者、25例中度慢性乙型肝炎患者、22例重度慢性乙型肝炎患者和39例健康人外周血DNT細胞及T細胞亞群。結(jié)果健康人群和急性乙型肝炎患者外周血DNT細胞比例分別為（4.82±3.43）%和（4.75± 2.71）%，顯著低于無癥狀攜帶者[（5.43±3.31）%，P＜0.05]和慢性乙型肝炎患者（P＜0.05）；輕度慢性乙型肝炎患者DNT細胞比例為（7.97±4.12）%，顯著低于重度慢性乙型肝炎患者[（11.36±5.01)%，P＜0.05]；中度慢性乙型肝炎患者DNT細胞比例為（8.41±4.93）%，也顯著低于重度慢性乙型肝炎患者（P＜0.05）；健康人、急性乙型肝炎患者和無癥狀攜帶者之間T淋巴細胞亞群分布無明顯差異，但隨著慢性乙型肝炎患者病情加重，外周血CD3+、CD3+CD4+CD8-細胞比例降低（P＜0.05），CD3+CD4-CD8+細胞比例升高（P＜0.05）。結(jié)論外周血DNT細胞比例的升高與乙型肝炎病毒感染者慢性化及慢性乙型肝炎患者的疾病進程有關(guān)。

慢性乙型肝炎；CD3+CD4-CD8-T細胞；T淋巴細胞亞群

T淋巴細胞亞群檢測是評估機體免疫狀態(tài)的重要指標。乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展與宿主細胞免疫狀態(tài)密切相關(guān)，目前認為宿主免疫功能調(diào)控紊亂是導(dǎo)致慢性肝損傷的主要原因，其中由T淋巴細胞亞群介導(dǎo)的細胞免疫以及細胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控異常起著重要作用[1]。CD3+CD4-CD8-（double negative T，DNT）細

胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一群具有免疫調(diào)節(jié)作用的T細胞亞群，占正常人外周血總淋巴細胞的1%～5%，被發(fā)現(xiàn)對艾滋病毒[2]、丙型肝炎病毒感染[3]的病情發(fā)展和轉(zhuǎn)歸均有重要影響。動物實驗研究提示DNT細胞可能參與了小鼠慢性乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展過程[4]，而乙型肝炎患者外周血DNT細胞分布情況未見報道。本研究使用流式細胞分析儀檢測了乙型肝炎病毒感染者外周血CD3+CD4+CD8-細胞（CD4+T細胞）、CD3+CD4-CD8+細胞（CD8+T細胞）、DNT細胞亞群的變化，以探討DNT淋巴細胞亞群在乙型肝炎診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2012年4月至2014年4月本院門診及住院的無癥狀HBV攜帶者（asymptomatic hepatitis B virus carrier,ASC）33例[男20例，女13例；平均年齡（42.3±5.2）歲]，急性乙型肝炎患者（acute hepatitis B，AHB）28例[男16例，女12例；平均年齡（48.7±7.5）歲]，慢性乙型肝炎患者（chronic hepatitis B，CHB）75例，其中輕度慢性乙型肝炎（mild chronic hepatitis B，CHB-mild）患者28例[男18例，女10例；平均年齡（43.3±4.3）歲]，中度慢性乙型肝炎（moderate chronic hepatitis B，CHB-moderate）25例[男15例，女10例；平均年齡（50.4± 5.7）歲]，重度慢性乙型肝炎（severe chronic hepatitis B，CHB-severe）22例[男11例，女11例；平均年齡（42.7±4.8）歲]。臨床診斷均符合2000年發(fā)布的病毒性肝炎防治方案[5]。所有入選對象在3個月內(nèi)均未接受過抗病毒及免疫抑制劑治療，排除其它病毒感染及自身免疫性肝病。另選擇健康對照（healthy control，HC）39例[男21例，女18例；平均年齡（45.7±7.2）歲]，均為我院健康體檢者。

1.2 外周血淋巴細胞亞群檢測使用美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的FC 500流式細胞儀、熒光素標記抗CD3-PC5/CD8-PE/CD4-FITC（BECKMAN COULTER）和紅細胞裂解液（BECKMAN COULTER. OptiLyse C lysing solution）?；颊哂谇宄靠崭共裳⊙? h內(nèi)進行檢測，即取EDTA-K2抗凝外周血50 μL，加入10 μL的三標記單克隆抗體復(fù)合試劑（CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE），充分混勻，室溫避光20 min后，加入紅細胞裂解液250 μl，充分混勻后，室溫避光10 min。加入PBS洗液1 ml，混勻后300 g離心5 min，棄去上清，用1 ml PBS緩沖液重懸后，300 g離心5 min，用500 μL PBS緩沖液重懸，10 min內(nèi)上機，檢測10000個淋巴細胞，各細胞亞群分別用百分比表示。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙型肝炎患者與健康人外周血DNT細胞水平比較ASC組外周血DNT細胞比例為（5.43± 3.31）%，AHB組DNT細胞比例為（4.75±2.71）%，HC組DNT細胞比例為（4.82±3.43）%，三者間DNT細胞比例無明顯差異（P＞0.05）；與HC組和AHB組比，CHB組DNT比例明顯升高（P＜0.05），CHB-mild組與CHB-moderate組DNT細胞比例無明顯差異（P＞0.05），分別為（7.97±4.12）%和（8.41± 4.93）%，而CHB-severe組DNT細胞比例為（11.36± 5.01）%，比前兩者明顯升高（P＜0.05）；ASC組DNT細胞比例除較CHB-severe組低外（P＜0.05），與其余四組比，均無明顯差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組人群外周血DNT細胞比例比較隨著慢性肝炎病情的加重，DNT水平呈上升趨勢

2.2 乙型肝炎患者與健康人T淋巴細胞亞群分布的比較HC組、ASC組和AHB組CD3+細胞比例無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但三者CD3+細胞比例均較CHB組高（P＜0.05）；CHB-mild組與CHB-moderate組CD3+細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但兩組均較CHB-severe組高（P＜0.05）；HC組、ASC組和AHB組CD4+淋巴細胞比例無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而HC組和ASC組CD4+淋巴細胞水平均顯著高于CHB組（P＜0.05），CHB-mild組和CHB-moderate組CD4+淋巴細胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但均比CHB-severe組高（P＜0.05）；AHB組CD4+淋巴細胞水平較CHB-moderate組和CHB-severe組明顯升高（P＜0.05）；CHB-moderate組和CHB-severe組間CD4+T淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；HC組、ASC組和AHB組CD8+淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但三者CD8+淋巴細胞比例均比CHB組低（P＜0.05）；CHB-mild組、CHB-moderate組、CHB-severe組間CD8+淋巴細胞水平依次遞增，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HC組、ASC組和AHB組CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），三組均比CHB組高（P＜0.05）；CHB-mild組較CHB-severe組明顯升高（P＜0.05），而CHB-moderate組與CHB-severe組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 乙型肝炎患者與正常人外周血T淋巴細胞亞群（%，）比較

表1 乙型肝炎患者與正常人外周血T淋巴細胞亞群（%，）比較

與HC組比，①P＜0.05；與AHB組比，②P＜0.05；與CHB-moderate組比，③P＜0.05

3 討論

乙型肝炎病毒感染機體后，主要有兩種結(jié)局：急性自限性和慢性持續(xù)性。機體能否清除病毒，很大程度上取決于感染者的免疫狀態(tài)。當機體免疫功能強大時，可發(fā)生劇烈的炎癥反應(yīng)，臨床上可出現(xiàn)較重的急性乙型肝炎，甚至出現(xiàn)急性或亞急性肝衰竭，但患者臨床痊愈時，HBV被徹底清除；而當機體免疫力弱時，炎癥反應(yīng)較弱，往往機體內(nèi)的HBV不能被徹底清除而病情遷延，成為慢性肝炎或無癥狀攜帶者。大量研究表明病毒性肝炎肝臟損傷的機制來源于免疫應(yīng)答而非病毒的直接細胞毒性效應(yīng)，病毒特異性的CD8+T細胞又稱細胞毒性T細胞（CTLs）被認為在肝臟的損傷和病毒控制過程中起重要作用。此外，CD4+T細胞輔助反應(yīng)與肝炎急性期的病毒清除密切相關(guān)[6]。DNT細胞是最新發(fā)現(xiàn)的一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細胞亞群，它與機體的免疫調(diào)節(jié)和免疫防御功能有關(guān)，且也被證明在抗移植排斥、腫瘤免疫等方面發(fā)揮重要作用[7]。已發(fā)現(xiàn)DNT細胞的抗原特異性免疫調(diào)節(jié)功能對CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞和樹突狀細胞的免疫抑制功能等發(fā)揮作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，CHB組DNT細胞比例較HC組、ASC組和AHB組明顯升高，且隨著慢性肝炎病情的加重，DNT水平也呈上升趨勢，與孫穎等人[9]在動物模型上的發(fā)現(xiàn)相一致，可見外周血DNT細胞水平與乙型肝炎病毒感染患者的疾病轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，可能與其慢性化有關(guān)。乙型肝炎慢性化可能是機體免疫功能低下的結(jié)果，包括產(chǎn)生抗病毒抗原抗體的體液免疫和清除細胞內(nèi)病毒的細胞免疫不足。已知抗原特異性的CD8+T細胞是清除病毒的主要效應(yīng)細胞[10，11]。動物研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)DNT細胞可以殺死活化的特異性CD8+T細胞[9，12，13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染過程中，DNT細胞能通過抑制宿主免疫反應(yīng)來起到保護肝臟損傷的功能，但同時也會造成病毒無法徹底清除而持續(xù)存在[12]。這與我們的研究相符：ASC組和CHB組DNT水平較HC組和AHB組水平明顯升高。因此，DNT的多種免疫功能在HBV感染過程中可能是一把雙刃劍，它能發(fā)揮類似Th1細胞的功能，從而促進病毒的清除，但也能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，通過抑制細胞毒性CD8+T細胞來達到保護肝臟的目的，而兩者達到動態(tài)平衡的過程也就是HBV慢性化的過程[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HC組、ASC組、AHB組間T淋巴細胞亞群分布無明顯差異，而CHB組中隨著患者病情的加重，其CD3+細胞、CD4+T細胞水平逐漸減低，CD8+T細胞水平逐漸升高，CD4+/CD8+細胞比值逐漸減低并出現(xiàn)倒置，這與國內(nèi)外的一些研究結(jié)果相一致[15～19]。急性肝炎組T淋巴細胞亞群的分布情況與劉波等人[20]的報道結(jié)果不同，他們發(fā)現(xiàn)早期急性乙型肝炎患者外周血CD3+、CD4+和CD8+T細胞頻率顯著高于慢性組和對照組，可能是由于病例選擇的差異造成的。

本研究發(fā)現(xiàn)慢性肝炎發(fā)展過程中CD8+T細胞比例并未因DNT水平的升高而有所降低，我們推測這可能是由于慢性肝炎患者體內(nèi)HBV抗原特異性CD8+細胞數(shù)量減少，大量非病毒特異性CD8+T細胞產(chǎn)生，從而一方面導(dǎo)致CD8+T細胞無法有效發(fā)揮病毒清除功能，反而對肝細胞的損傷起破壞作用；另一方面導(dǎo)致DNT對HBV抗原特異性CD8+T細胞的調(diào)控作用失效，但隨著病情的發(fā)展，DNT細胞水平代償性升高，并且由于其對CD4+T細胞和抗原呈遞細胞也存在抑制作用，因此高水平的DNT細胞又抑制了由CD4+T細胞誘導(dǎo)的免疫防御作用，從而又反過來促進了病情的惡化。有研究發(fā)現(xiàn)急性乙型肝炎患者HBV抗原特異性CD8+T細胞水平明顯比慢性乙型肝炎患者高。關(guān)于DNT細胞在慢性乙型肝炎惡化過程中的具體機制有待進一步研究。

總之，DNT細胞作為T細胞發(fā)揮調(diào)控功能的組成部分，與乙型肝炎病毒感染者慢性化有關(guān)，也與慢性乙型肝炎患者的疾病進程有關(guān)。外周血T淋巴細胞亞群是反應(yīng)機體免疫狀態(tài)的主要指標，外周血DNT細胞和T淋巴細胞亞群檢測將會對評估乙型肝炎病毒感染者預(yù)后及疾病進程有重要的價值。

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（收稿：2014-06-18）

（校對：陳從新）

Changes of peripheral blood double negative T cells and T cell subsets in patients with hepatitis B virus infection

Du Zhenhua，Bao Buhe，Wang Renjie，et al.Department of Clinical Laboratory，Affiliated Hospital to Logistics University of Chinese People's Armed Police Force，Tianjin 300162，China

ObjectiveTo investigate the changes of peripheral blood CD3+CD4-CD8-T cells（double negative T，DNT）and T lymphocyte subsets in patients with hepatitis B virus（HBV）infection.MethodsThe peripheral blood DNT cells and T lymphocyte subsets were detected by flow cytometry in 136 HBV cases including asymptomatic carriers（ASCs，n=33），acute hepatitis B（AHB，n=28），mild chronic hepatitis B（n=28），moderate chronic hepatitis B（n=25），severe chronic hepatitis B（n=22）and healthy persons（n=39）.ResultsThe percentages of DNT cells in healthy persons and in patients with AHB were（4.82±3.43）%and（4.75±2.71）%，respectively，both of which were significantly lower than that in ASCs[（5.43±3.31）%，P＜0.05]；The percentage of DNT cells in patients with mild CHB was（7.97±4.12）%，significantly lower than in patients with severe CHB [（11.36±5.01）%，P＜0.05]，and the percentage of DNT cells in patients with moderate CHB was（8.41±4.93）%，also significantly lower than in patients with severe CHB（P＜0.05）；There were no differences in percentages of T lymphocyte subsets among health persons，patients with acute hepatitis B and ASCs；The percentages of CD3+and CD3+CD4+CD8-cells decreased（P＜0.05）and the percentage of CD3+CD4-CD8+cells increased（P＜0.05）in patients with chronic severe hepatitis B.ConclusionsThe increase in peripheral blood DNT cells is associated with the chronicity of illness in patients with CHB.

Chronic hepatitis B；CD3+CD4-CD8-T cell；T lymphocyte subsets

武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院院內(nèi)基金項目（編號：FYQ201441）

300162天津市武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科

杜振華，男，29歲，醫(yī)學(xué)碩士。主要研究方向為病毒性肝炎發(fā)病機制研究。E-mail:dzhtoms@163.com

張明華，E-mail:wj60572014@163.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.06.006