果蠅在腫瘤學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用前景

霍桂桃,呂建軍,屈哲,林志,張頔,楊艷偉,李波

中國(guó)食品藥品檢定研究院,國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心,北京 100176

果蠅(Drosophila melanogaster)是研究人類疾病發(fā)生機(jī)制的理想模式生物,果蠅和哺乳動(dòng)物的許多基本生物學(xué)、生理學(xué)和神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能等方面比較相似。果蠅作為研究人類疾病的模式生物,在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制研究中取得了很大進(jìn)展,目前已經(jīng)建立果蠅模型的人類神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病包括：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)、亨廷頓氏病(Huntingdon’s disease,HD)、朊蛋白疾病(Prion disease)等[1～4]。近年來(lái),人們利用果蠅這一強(qiáng)大的遺傳學(xué)工具在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移機(jī)制方面取得了很大的進(jìn)展,而且,已經(jīng)建立并完善了一套快速鑒定與腫瘤形成及發(fā)展相關(guān)基因的技術(shù)。果蠅和哺乳動(dòng)物在基因和調(diào)控通路上的高度保守性、細(xì)胞過(guò)程的相似性以及腫瘤發(fā)生時(shí)腫瘤抑制因子出現(xiàn)證據(jù)上的保守性等使得果蠅在研究人類癌癥發(fā)生機(jī)制方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。本文就果蠅在腫瘤學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)、已經(jīng)建立的研究人類癌癥的果蠅模型進(jìn)行闡述,并對(duì)果蠅在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 果蠅在腫瘤學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)

1.1 果蠅作為模式生物的優(yōu)勢(shì)

孟德?tīng)栮P(guān)于豌豆的遺傳學(xué)研究是他在寺院進(jìn)行研究的偶然結(jié)果,而與之相反,果蠅作為遺傳學(xué)研究的重要模式生物則是摩爾根尋找合適的物種進(jìn)行遺傳學(xué)研究慎重考慮的結(jié)果。果蠅符合摩爾根提出的所有標(biāo)準(zhǔn),即物種小、生活周期短、容易飼育并且可以獲得大量的后代[5]。果蠅的生活周期隨其生活的環(huán)境溫度不同而存在一定的變化,一般情況下,25℃飼養(yǎng)條件的生活周期為10天左右。一對(duì)生殖交配果蠅可產(chǎn)生幾百個(gè)遺傳學(xué)上一致的后代,而傳統(tǒng)的嚙齒類動(dòng)物模型每3～4個(gè)月只能獲得極少數(shù)的后代[6]。

果蠅的發(fā)育經(jīng)歷多個(gè)不同的階段,每個(gè)階段可作為不同研究目的的模型。果蠅的發(fā)育階段主要經(jīng)歷胚胎期、幼蟲(chóng)期、蛹期和成蠅期。胚胎通常用于基本發(fā)育研究,以檢測(cè)發(fā)育模式形成、細(xì)胞命運(yùn)決定、器官發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育以及神經(jīng)軸突的正確形成。幼蟲(chóng),特別是能夠自由爬動(dòng)的三齡幼蟲(chóng),經(jīng)常被用于研究發(fā)育和生理過(guò)程,以及覓食行為。果蠅的幼蟲(chóng)期對(duì)于藥物的研究特別有用,因?yàn)橛紫x(chóng)連續(xù)進(jìn)食,很少節(jié)制。果蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)包含有其成年后的結(jié)構(gòu),如成蟲(chóng)盤(pán),成蟲(chóng)盤(pán)主要由未分化的上皮細(xì)胞組成。從三齡幼蟲(chóng)晚期到蛹期,這些結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)的變化,最后形成成年果蠅的結(jié)構(gòu)。通過(guò)在蛹期對(duì)成蟲(chóng)盤(pán)發(fā)育過(guò)程的分子及遺傳機(jī)制的研究,不僅為果蠅生物學(xué)提供了重要的理念,也為人類生物學(xué)研究提供了新的思路。因此,蛹是研究某些特定發(fā)育過(guò)程的理想模型。成蛹期結(jié)束后,新羽化的成年果蠅擁有許多進(jìn)行遺傳學(xué)研究的評(píng)分結(jié)構(gòu),如剛毛、翅膀、復(fù)眼、觸角的類型等均可以在不致死的情況下發(fā)生突變,這就有利于分離到許多標(biāo)志性的突變類型,是大多數(shù)遺傳學(xué)研究的重要工具。成年果蠅是一種相對(duì)高等的復(fù)雜生物,其體內(nèi)有類似哺乳動(dòng)物的心臟、肺、腎臟、胃腸和生殖道功能的結(jié)構(gòu)。果蠅的大腦有 100 000多個(gè)神經(jīng)元,形成具體的神經(jīng)環(huán)路和神經(jīng)纖維網(wǎng),調(diào)控復(fù)雜的行為,如晝夜節(jié)律、睡眠、學(xué)習(xí)和記憶、求偶、覓食、打斗、梳理和飛行等[6,7～9]。

果蠅基因組全序列的測(cè)序和標(biāo)注均已完成,果蠅共有4對(duì)染色體,編碼超過(guò)14 000個(gè)基因,其中3對(duì)染色體含有基因組中的大部分基因。以往的研究證明,果蠅體內(nèi)的許多基因是人類致癌基因或腫瘤抑制基因的同源物。據(jù)統(tǒng)計(jì),大約 75%與人類疾病相關(guān)的基因在果蠅體內(nèi)可以找到同源基因[10],哺乳動(dòng)物和果蠅的同源基因在核苷酸水平或蛋白序列上的整體同源性達(dá)到 40%,而在保守的功能區(qū)域,同源性可達(dá)到80%～90%[11]。

1.2 果蠅在腫瘤學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)

1.2.1 果蠅和人類在信號(hào)傳導(dǎo)通路上的保守性

眾多研究表明,果蠅和人類在信號(hào)傳導(dǎo)通路方面保守性極高,例如,Ras原癌基因的信號(hào)通路就是通過(guò)研究果蠅眼部感光細(xì)胞的發(fā)育而被首次闡明[12]。同時(shí)在原癌基因研究和果蠅遺傳學(xué)方面知識(shí)的積累為當(dāng)代人類癌癥研究提供了重要的線索。例如,以果蠅 patched/hedgehog 信號(hào)通路上Patched突變引起痣樣基底細(xì)胞癌綜合征為線索,確定Patched為腫瘤抑制基因,為人類相應(yīng)信號(hào)通路上的組件可能作為腫瘤抑制基因或致癌基因提供了線索。目前至少發(fā)現(xiàn) patched/hedgehog信號(hào)通路上的 3個(gè)其他成員與哺乳動(dòng)物腫瘤形成有關(guān)[13,14]。Notch基因最早在果蠅中發(fā)現(xiàn),Notch基因缺失或突變可導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣缺口,進(jìn)一步的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究表明許多Notch的調(diào)節(jié)器或靶點(diǎn)在進(jìn)化上非常保守。果蠅 Notch信號(hào)的異常表達(dá)可導(dǎo)致過(guò)度增殖,人類NOTCH1基因的異常表達(dá)是引起T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病因素,同時(shí) Notch信號(hào)的激活與許多造血系統(tǒng)腫瘤和固體腫瘤有關(guān)[15～17]。人類 JAK/STAT信號(hào)通路的紊亂可導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病,包括癌癥、Polycytemia癥、嚴(yán)重的免疫缺陷、過(guò)敏以及神經(jīng)缺失等; 果蠅 JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡,JAK激酶Hopscotch激活突變誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)移的造血系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生,對(duì)照此結(jié)果的后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),人類造血干細(xì)胞JAK2激活突變與各種造血系統(tǒng)惡性腫瘤有關(guān)[18～20]。Wnt信號(hào)通路在進(jìn)化中高度保守,在生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和干細(xì)胞維持等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用; Wnt通路的過(guò)度激活與多種癌癥(包括結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等)的發(fā)生密切相關(guān)。例如,在結(jié)腸癌患者中廣泛存在 Wnt通路的調(diào)節(jié)因子包括APC、beta-Catenin、Axin、TCF等基因的突變,從而造成與生長(zhǎng)相關(guān)的基因過(guò)量表達(dá)[21～24]。對(duì)果蠅體內(nèi)人類結(jié)腸腫瘤抑制因子APC基因同源物的研究表明,在某些特定的細(xì)胞類型中,APC是控制紡錘體定位的必要因素[25]。APC的亞細(xì)胞定位與Wnt信號(hào)在功能上不存在相關(guān)性,而APC氨基末端能夠促進(jìn) Wnt信號(hào)異常表達(dá),這可能與截除氨基末端的APC變異體在人類大腸癌中選擇性保留有關(guān)[26]。另外,對(duì)果蠅發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn),在通過(guò)抑制氨基酸傳感和組成性激活 P13K信號(hào)的營(yíng)養(yǎng)限制實(shí)驗(yàn)中,中樞神經(jīng)系統(tǒng)間變性淋巴激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)的含量要比其他組織中多,在人類 ALK的研究中發(fā)現(xiàn),人類多種腫瘤中可檢測(cè)到ALK 的組成性激活[27,28]。Hippo信號(hào)通路通過(guò)協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖和凋亡控制器官的尺寸大小,人類的許多癌癥過(guò)程中該信號(hào)通路出現(xiàn)下調(diào)。在果蠅體內(nèi)的遺傳學(xué)篩選中發(fā)現(xiàn)wart、salvador、hippo和mob為腫瘤抑制基因,這些基因中任何一個(gè)功能喪失均可引起顯著的增生現(xiàn)象,主要是因?yàn)?cycE、DIAP1和bantam轉(zhuǎn)錄激活進(jìn)而引起過(guò)度增殖和凋亡下降[29]。由此可見(jiàn),果蠅和人類在多種信號(hào)通路上的保守性為深入研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制提供可靠的信息。

1.2.2 果蠅的遺傳學(xué)可操作性

1.2.2.1 UAS-GAL4系統(tǒng) 果蠅作為模式生物的主要優(yōu)勢(shì)之一就是其基因的可操縱性,簡(jiǎn)而言之,果蠅體內(nèi)所有基因的活性,幾乎都可在任何細(xì)胞類型、細(xì)胞發(fā)育的任何階段增強(qiáng)或減弱[30]。目前的果蠅實(shí)驗(yàn)技術(shù)為檢測(cè)致癌基因的發(fā)展背景提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),例如,基因的異常表達(dá)效應(yīng)就可很容易地利用果蠅來(lái)研究,這對(duì)研究腫瘤的形成原因非常有用,因?yàn)橹掳┗蛲ǔ?huì)被異常活化(如Ras基因)或過(guò)度表達(dá)(如細(xì)胞周期蛋白 D)[31]。果蠅研究者們?cè)诓挥闷蕷?dòng)物的情況下,通過(guò)特異的啟動(dòng)子異位表達(dá)目的基因來(lái)研究該基因過(guò)度表達(dá)后的生物學(xué)特性。果蠅系統(tǒng)是獨(dú)一無(wú)二的,因?yàn)樵诠夡w內(nèi)可廣泛使用多種啟動(dòng)子,包括全身性表達(dá)的啟動(dòng)子(如熱休克蛋白或Actin啟動(dòng)子)或組織特異性啟動(dòng)子(神經(jīng)元特異性或眼部特異性啟動(dòng)子等),而且在某個(gè)時(shí)間范圍內(nèi),可以通過(guò)誘導(dǎo)一種熱休克蛋白啟動(dòng)子在時(shí)間上控制基因的表達(dá)。組織特異性啟動(dòng)子的多樣性可允許在不致死的情況下進(jìn)行基因的特定組織的過(guò)表達(dá)研究。同樣,通過(guò)缺失或進(jìn)行點(diǎn)突變,可將某個(gè)基因在體外進(jìn)行修飾形成具有致癌性的突變基因,并在體內(nèi)檢測(cè)致癌基因的活性,利用這種技術(shù)檢測(cè)表明,在2B型多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤中,突變的Ret基因處于超活性狀態(tài)[32]。酵母UAS-GAL4系統(tǒng)的引入使得果蠅體內(nèi)基因的異位表達(dá)研究變得更加容易,更加多樣化。在UAS-GAL4系統(tǒng)中,僅僅需要構(gòu)建一個(gè)驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的 UAS-cDNA質(zhì)粒,攜帶UAS-cDNA質(zhì)粒的果蠅品系可以和以組織特異性的模式進(jìn)行表達(dá) GAL4的果蠅品系雜交,通過(guò)雜交所獲取的后代則在特定的組織表達(dá)目的基因。這些先進(jìn)的技術(shù)使得異位活化篩選技術(shù)得以發(fā)展,其中UAS原件隨機(jī)插入到果蠅的基因組中,然后便可對(duì)感興趣的過(guò)表達(dá)表型進(jìn)行篩選。通過(guò)某些基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致腫瘤形成來(lái)確定這種篩選可被用于確定果蠅致癌基因。同樣,UAS-GAL4系統(tǒng)也可在果蠅發(fā)育過(guò)程中異位表達(dá)哺乳動(dòng)物致癌基因或抑癌基因,以評(píng)價(jià)這些基因的生物學(xué)功能[5,33]。

1.2.2.2 基于FLP/FRT的可抑制的細(xì)胞標(biāo)記物的嵌合克隆(Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker,MARCM)系統(tǒng) 多個(gè)基因的變異累積往往會(huì)造成復(fù)雜的癌癥表型,而癌癥基因組圖譜計(jì)劃面臨的主要挑戰(zhàn)之一就是如何理解單個(gè)腫瘤中所匯聚的多個(gè)基因突變之間的相互作用,以及正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化所涉及的腫瘤微環(huán)境細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。因此,模擬癌癥發(fā)生發(fā)展的模型需能夠產(chǎn)生具有復(fù)雜表型的特定細(xì)胞數(shù)量和能在體內(nèi)追蹤這些細(xì)胞的行為變化。果蠅作為研究癌癥發(fā)生機(jī)制的模擬系統(tǒng)可產(chǎn)生上述具有復(fù)雜表型的特定細(xì)胞(即克隆),其在組織內(nèi)表現(xiàn)為表型正常的細(xì)胞,但包含多個(gè)突變。這種遺傳學(xué)上復(fù)雜的細(xì)胞克隆可通過(guò)MARCM系統(tǒng)產(chǎn)生,其原理是將FLP/FRT介導(dǎo)的突變體和非突變體之間的有絲分裂重組與 UAS-GAL4系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)應(yīng)用于基因的靶向表達(dá)或?qū)μ囟ńM織內(nèi)目的基因的RNAi[34]。Pagliarini、Leong、Martin-Belmonte、Igaki等[35～38]研究小組利用MARCM系統(tǒng)闡明了果蠅體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的多基因元件和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的合作作用,即通過(guò)對(duì)果蠅眼部成蟲(chóng)盤(pán)scrib-突變克隆的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤發(fā)生的抑制是由癌組織周圍正常細(xì)胞激活的JNK調(diào)節(jié)的凋亡通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的,而腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的重新獲得則是通過(guò)同一克隆內(nèi) Ras信號(hào)上調(diào)的協(xié)同效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了scrib-克隆細(xì)胞周圍正常細(xì)胞的作用,這種細(xì)胞間的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)類似于哺乳動(dòng)物癌癥中所觀察到的; 如果同時(shí)激活Ras或Notch信號(hào),JNK調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡受阻,Ras/Notch則與JNK共同協(xié)作,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲,即 JNK信號(hào)激活可促進(jìn)Scrib缺陷細(xì)胞凋亡,當(dāng)具有致癌活性的 Ras或Notch信號(hào)存在時(shí),JNK則驅(qū)動(dòng)細(xì)胞過(guò)度增殖和腫瘤發(fā)生; 同時(shí)也有研究證實(shí)細(xì)胞極性喪失和腫瘤發(fā)生在分子水平也存在一定的聯(lián)系,RasV12異常激活導(dǎo)致JNK活性及E-cad失活,從而使scrib-、dlg-及l(fā)gl-克隆細(xì)胞向周圍正常細(xì)胞轉(zhuǎn)移。以果蠅模型研究 JNK調(diào)節(jié)的腫瘤發(fā)生機(jī)制時(shí),果蠅細(xì)胞所展現(xiàn)的多基因元素與 Ras信號(hào)協(xié)作促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象同樣也發(fā)生在哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞中,這就提示以果蠅進(jìn)行腫瘤學(xué)研究可有助于科學(xué)家們進(jìn)一步闡明哺乳動(dòng)物體內(nèi)腫瘤形成及轉(zhuǎn)移機(jī)制。

1.2.2.3 雙股 RNA 干擾(dsRNAi)的基因篩選 果蠅的遺傳可操作性同樣也包括在特定的組織敲除目的基因以研究該基因的生物學(xué)功能或建立特定的疾病模型,通常使用 RNAi技術(shù)干擾特定基因的轉(zhuǎn)錄以降低基因的活性,從而達(dá)到靶向敲除目的基因的目的,即通過(guò)dsRNA反向重復(fù)表達(dá)引發(fā)由Dicer酶調(diào)節(jié)的復(fù)合物誘導(dǎo)同源序列靶向降解,這種基因敲除的方法在果蠅體內(nèi)非常有效[39]。利用 dsRNAi進(jìn)行基因功能的研究主要通過(guò)將dsRNA注入果蠅胚胎、體內(nèi)組織特異性表達(dá)短的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的 RNA以及將dsRNA加入培養(yǎng)的細(xì)胞的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。世界轉(zhuǎn)基因果蠅庫(kù)所儲(chǔ)存的果蠅可條件性地表達(dá)干涉型雙股RNA,幾乎可以和果蠅基因組中 90%的基因發(fā)生靶向作用[40]。以果蠅為模型的基因組廣泛的 RNAi篩選主要集中于與醫(yī)學(xué)相關(guān)的幾個(gè)方面,包括衰老、肥胖、感染、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥等[41]。首次在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多個(gè)重要的基因,如原癌基因、腫瘤抑制基因、與細(xì)胞增殖、分化及死亡相關(guān)的重要基因就是通過(guò) RNAi篩選獲得的[42]。利用果蠅實(shí)施基因組廣泛的 RNAi篩選的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：dsRNAi篩選的有效性及良好的基因組注釋使得幾乎對(duì)任何基因及基因片段的研究成為可能; 果蠅和脊椎動(dòng)物基因組的高度保守性以及重要信號(hào)通路的保守性為將果蠅模型的研究結(jié)果應(yīng)用到脊椎動(dòng)物提供生物學(xué)基礎(chǔ); 果蠅強(qiáng)大的遺傳學(xué)工具和大量的化學(xué)、轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的突變體果蠅及缺陷型果蠅品系為快速體內(nèi)鑒定 RNAi篩選獲得的目標(biāo)基因奠定了基礎(chǔ); 此外,靶向基因敲除及具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA干涉方法的應(yīng)用使得通過(guò)基因工程方法在特定基因中產(chǎn)生喪失功能的基因突變來(lái)分析基因的功能成為可能[33,43]。Willecke等[44]利用這一基因技術(shù)為篩選體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)所必需的基因建立了一個(gè)完善的系統(tǒng),這種建立在復(fù)雜遺傳背景基礎(chǔ)上的篩選方式可在果蠅體內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)的、全基因組廣泛性的篩選,加快研究者們對(duì)復(fù)雜疾病例如癌癥的理解。Neumüller等[45]利用 RNAi篩選發(fā)現(xiàn)有600多個(gè)基因參與調(diào)控果蠅成神經(jīng)細(xì)胞的自我更新,其中有些基因?yàn)槟X腫瘤抑制子,哺乳動(dòng)物中這些基因的同源物行使腫瘤抑制子的功能,平衡自我更新及干細(xì)胞分化。Read等[46]以果蠅RNAi技術(shù)研究RTK和P13K信號(hào)依賴的腫瘤形成所必需新基因時(shí)發(fā)現(xiàn),非典型蛋白激酶RIOK1和RIOK2以Akt依賴的方式在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá),過(guò)表達(dá)的 RIOK2和 RIOK1、mTor以及 mTor復(fù)合物 2形成復(fù)合物,過(guò)表達(dá)的 RIOK2上調(diào) Akt信號(hào),促進(jìn)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤發(fā)生;相反,降低RIOK1或RIOK2的表達(dá)則使Akt信號(hào)中斷,通過(guò) RpL11依賴的核糖體壓力檢驗(yàn)點(diǎn)誘導(dǎo) p53激活,從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞周期結(jié)束、細(xì)胞凋亡以及化療敏感性增強(qiáng)。

1.2.3 果蠅相對(duì)缺乏基因冗余

脊椎動(dòng)物基因組在進(jìn)化過(guò)程中的復(fù)制常導(dǎo)致產(chǎn)生擁有多個(gè)同源旁系的基因子集,在后續(xù)的進(jìn)化中出現(xiàn)基因子集擴(kuò)展和蛋白功能的多樣性。由于這些基因擁有共同的祖先,通常這些基因編碼的同源蛋白保持功能上的重疊。當(dāng)基于單個(gè)基因突變進(jìn)行疾病模型的建立時(shí),基因冗余可以遮蓋在模型動(dòng)物中檢測(cè)表型的能力,因而使得以模型動(dòng)物研究疾病發(fā)生機(jī)制變得更加復(fù)雜[33]。與人類等哺乳動(dòng)物相比,果蠅基因組相對(duì)缺少基因冗余,例如Wnt 信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子 TCF 在小鼠中擁有 4 種同源蛋白,而在果蠅中只存在一種同源蛋白[47],因此,利用果蠅作為替代模型研究Wnt信號(hào)通路中TCF的功能更容易獲得生理上相關(guān)的表型。

1.3 利用果蠅進(jìn)行腫瘤學(xué)研究的局限性

果蠅并不是研究腫瘤發(fā)生所有方面的理想模型。例如,果蠅具有開(kāi)放的循環(huán)系統(tǒng),不具有獲得性免疫功能。另外,果蠅的生命周期比較短,而人類癌癥從根本上講則主要和衰老有關(guān)。盡管人類的每個(gè)癌細(xì)胞發(fā)展所處的基因和微環(huán)境是決定腫瘤最終結(jié)果的關(guān)鍵因素,但是癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的復(fù)雜性卻很難用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)復(fù)制。雖然果蠅有一定的局限性,但利用果蠅模型進(jìn)行癌癥方面的研究所取得的成果極大地促進(jìn)了人們對(duì)癌癥的理解。

2 已經(jīng)建立的研究人類癌癥的果蠅模型

2.1 人/果蠅嵌合體蛋白BCR-ABL轉(zhuǎn)基因果蠅

費(fèi)城染色體上(Philadelphia chromosome,Ph)的BCR-ABL是第一個(gè)利用果蠅進(jìn)行研究的人類致癌基因,幾乎所有的慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)和某些急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoid leukemia,ALL)都是由該基因引起[48]。人類9號(hào)染色體上的癌基因ABL鏈接到22號(hào)染色體上的斷點(diǎn)簇集區(qū)(BCR),形成p210BCR-ABL融合基因和p185BCR-ABL融合基因,這兩種融合基因使相應(yīng)的BCR、ABL酪氨酸激酶持續(xù)激活,引起細(xì)胞增殖、黏附和生存性質(zhì)的改變,從而導(dǎo)致 CML和ALL[49]。為了獲得BCR-ABL異構(gòu)體的活動(dòng)模式,Fogert等[28]構(gòu)建了表達(dá)P210或P185人/果蠅嵌合體蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅,融合基因包括BCR、人ABLN端序列以及來(lái)自果蠅的存在較多差異的ABL的C端尾巴。P185和P210能夠挽救dAbl突變果蠅致死表型和ABL信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活,而且它們的過(guò)表達(dá)還能產(chǎn)生獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)表型,特別是眼睛。同時(shí)也能激活正常情況下ABL不能激活的信號(hào)通路。這種果蠅模型可進(jìn)一步幫助研究者發(fā)現(xiàn) BCR-ABL信號(hào)級(jí)聯(lián)的組成元件和與P210和P185相關(guān)的白血病的獨(dú)特臨床特征之間的差異[50,51]。

2.2 混合系白血病相關(guān)的染色體異位(Mixed lineage leukemia(MLL)-associated translocations)

MLL(Mixed-lineage leukemia) 基因,又稱HRX、HTRX1、ALL-1或TRX1基因,位于 11號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)3帶( 11q23) ,1991年由Ziemin-Van Der Poel等克隆[52]。MLL基因是造血過(guò)程調(diào)控的一個(gè)關(guān)鍵基因,其異常與白血病的發(fā)病密切相關(guān)。根據(jù) Meyer等[53]所作的統(tǒng)計(jì),MLL基因重排至少有104 種,而已鑒定出的MLL融合基因高達(dá) 64 種; 其中MLLAF9(與AML有關(guān))和MLL-AF4(在ALL中發(fā)現(xiàn))是頻繁易位的產(chǎn)物。盡管MLL和大多數(shù)MLL融合蛋白被整合到攜帶組蛋白修飾活性的大分子核復(fù)合物中,但是目前還不清楚 MLL融合蛋白是如何促進(jìn)白血病發(fā)生的。在果蠅中表達(dá)MLL-AF4或MLL-AF9可誘導(dǎo)果蠅在蛹期致死,但這兩個(gè)融合蛋白對(duì)果蠅幼蟲(chóng)大腦的增生和染色體濃縮有不同的作用,且在很大程度上顯示可不重疊結(jié)合到果蠅唾液腺染色體上[54]。這些現(xiàn)象表明二者具有不同的干擾通路。因此,MLL融合蛋白的C端伙伴基因(Partner gene)可能對(duì)嵌合體異常活動(dòng)具有更重要的作用。

2.3 AML1-ETO融合基因和AML

果蠅是研究與人類致癌蛋白功能相關(guān)的增強(qiáng)子、抑制子及修飾基因的有價(jià)值的體內(nèi)篩選平臺(tái),在分析AML病人骨髓內(nèi)的染色體異位時(shí)發(fā)現(xiàn),一些轉(zhuǎn)錄因子在造血過(guò)程中起著非常重要的作用,且在白血病的發(fā)生過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用。這些因子包括AML1、LMO2、SALL以及SC1/Tali,所有這些因子都可以在果蠅體內(nèi)找到同源類似物[55]。t(8;21)(q22; q22)染色體異位導(dǎo)致AML1-ETO融合蛋白產(chǎn)生,大概12%的AML病人屬于這種情況。AML1是一種具有RUNX結(jié)構(gòu)域的蛋白,在造血過(guò)程的多個(gè)步驟中起到組織特異性轉(zhuǎn)錄激活子的作用; 而ETO(也稱作RUNX1T1和MTG8)則行使轉(zhuǎn)錄抑制子的功能。一般認(rèn)為 AML1-ETO融合蛋白是 AML1蛋白功能的組成性抑制子,在抑制髓樣分化的同時(shí)促進(jìn)多系祖細(xì)胞的增殖[56]。在果蠅中,RUNX因子Lozenge基因控制兩個(gè)主要的血細(xì)胞系中一個(gè)細(xì)胞系的出現(xiàn)和分化,而且,人類和果蠅的血細(xì)胞發(fā)育特點(diǎn)比較保守,由此表明果蠅可能是研究 AML1-ETO融合蛋白作用方式的模型[57,58]。AML1-ETO,特別是在 Lozenge血細(xì)胞系中,可誘導(dǎo)產(chǎn)生白血病早期表型,其特點(diǎn)是破壞細(xì)胞分化和血祖細(xì)胞數(shù)量增加。此外,AML1–ETO融合基因表達(dá)可導(dǎo)致果蠅在蛹期致死的表型。利用體內(nèi)特異性的RNAi篩選策略,已經(jīng)確定了Ca2+依賴蛋白酶CalpainB是AML1-ETO誘導(dǎo)果蠅所產(chǎn)生表型的主要因素。更重要的是,人鈣激活中性蛋白酶抑制可引起AML1-ETO降解,顯著地降低白血病細(xì)胞系t(8;21)+的克隆性生長(zhǎng),表明鈣激活中性蛋白酶抑制劑可能對(duì)白血病的治療有效。由此可見(jiàn),果蠅是探尋AML1-ETO相關(guān)保守調(diào)節(jié)因子和研究治療AML化合物的有效模型[59,60]。

2.4 NF1基因和 1型神經(jīng)纖維瘤(Neurofibromatosis 1)

1型神經(jīng)纖維瘤是典型的兒童癌癥綜合征,是腦部及外周神經(jīng)系統(tǒng)的一種良性腫瘤。雖然僅有一小部分神經(jīng)纖維瘤患者會(huì)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移,但大部分患病兒童出現(xiàn)骨骼缺陷和記憶障礙,大多數(shù)患者的NF1基因發(fā)生突變[61]。果蠅體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,NF1調(diào)節(jié)Ras信號(hào)通路。小鼠實(shí)驗(yàn)證明,NF1活性降低,與p19ARF和p53共同促進(jìn)疾病的進(jìn)程[62]。這為開(kāi)發(fā)治療神經(jīng)纖維瘤的Ras通路抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。

2.5 ErbB-2 基因和乳腺癌

ErbB-2與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),是乳腺癌的一個(gè)重要分子標(biāo)志物。ErbB家族信號(hào)通路是一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),其異常激活可引起細(xì)胞生長(zhǎng)增殖失控、惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,存在于ErbB-2基因C末端尾巴的5個(gè)磷酸化酪氨酸(pTyr)中任何 4個(gè)發(fā)生自身磷酸化足以引發(fā)ErbB-2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化[63]。以果蠅研究激活的ErbB-2(其C末端5個(gè)磷酸化酪氨酸均攜帶一個(gè)點(diǎn)突變)的結(jié)果顯示,激活的ErbB-2編碼的蛋白質(zhì)所誘導(dǎo)產(chǎn)生的顯性表型類似于獲得等位基因功能果蠅EGFR的表型[64]。然而,這些表型可被不同的第二位點(diǎn)突變顯著抑制,這些突變能夠識(shí)別特定磷酸化酪氨酸下游的功能特異性配體(Adaptor)及第二信使。有研究表明,ErbB-2在結(jié)構(gòu)上與果蠅EGFR的相關(guān)性比與其它哺乳動(dòng)物EGFRs更強(qiáng)[65]。這就進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了利用果蠅模型研究ErbB-2致癌基因活性的可靠性。

2.6 CDH1基因和遺傳性彌散型胃癌(Hereditary diffuse gastric cancer,HDGC)

遺傳性彌散型胃癌是常染色體顯性遺傳的遺傳性胃癌綜合征,占所有胃癌病例的 1%～3%,主要由胚胎時(shí)期編碼細(xì)胞黏附分子 E-cadherin(E-cad)的CDH1基因突變引起。研究者們?cè)诠夡w內(nèi)表達(dá)突變的E-cad來(lái)研究E-cad在HDGC中的作用[66]。在果蠅的翅膀上皮表達(dá)兩個(gè)錯(cuò)義突變(A634V或V832M)的CDH1后,所表達(dá)的鈣粘蛋白仍保留鈣粘蛋白的一些功能,但在不同程度上干擾上皮細(xì)胞。事實(shí)上,盡管野生型和突變型CDH1定位正確,并與β-catenin 相互作用,但這兩種突變體可促進(jìn)細(xì)胞向上皮細(xì)胞的基底側(cè)擠壓。另外,A634V細(xì)胞以細(xì)胞連接組的形式移動(dòng),V832M細(xì)胞則以小的細(xì)胞簇或隔離細(xì)胞的形式逃離上皮[67]。因此,以果蠅為模型的研究可以揭示由不同的CDH1錯(cuò)義突變所導(dǎo)致的常見(jiàn)的和特定的功能改變。

2.7 腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)和腫瘤微環(huán)境

腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生過(guò)程起到很重要的作用,癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞以及周邊細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的類型有關(guān)。這些非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通過(guò)分泌生長(zhǎng)促進(jìn)信號(hào)、抗凋亡信號(hào)促進(jìn)血管生成和組織入侵及轉(zhuǎn)移來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。腫瘤細(xì)胞的主要特點(diǎn)是具有逃避程序性死亡的能力[68,69]。哺乳動(dòng)物TNF可調(diào)節(jié)炎癥、免疫及細(xì)胞的構(gòu)成,TNF一方面可促進(jìn)正常細(xì)胞和發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變細(xì)胞的程序性死亡,同時(shí) TNF可促進(jìn)炎癥發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移。果蠅TNF的同源物 Eiger(Egr)可促進(jìn)或抑制腫瘤生成依賴于腫瘤的遺傳學(xué)背景。果蠅眼部和翅膀的 Scrib-/-細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)小泡Egr-JNK調(diào)節(jié)的凋亡信號(hào)來(lái)清除,從scrib突變細(xì)胞(scrib-/-;egr-/-)中清除egr引起死亡抑制和促進(jìn)腫瘤增生,提示egr在scrib突變體組織中具有類似腫瘤抑制子的功能,相反,去除不同遺傳背景細(xì)胞(scrib-/-;RasV12;egr-/-)中的egr可抑制侵入性腫瘤的發(fā)生,提示egr在Ras激活的背景下具有腫瘤增強(qiáng)子的功能; 去除循環(huán)血細(xì)胞中egr的功能同樣可以抑制腫瘤的發(fā)展,說(shuō)明在促進(jìn) Ras腫瘤進(jìn)程時(shí),egr信號(hào)通路的作用是非自發(fā)的。因此,腫瘤微環(huán)境是免疫細(xì)胞富集的場(chǎng)所,通過(guò) egr/TNF信號(hào)控制細(xì)胞的死亡或入侵以及調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[70～73]。

2.8 EGFR、P13K和腦膠質(zhì)瘤

人類膠質(zhì)瘤是來(lái)源于神經(jīng)膠質(zhì)及其前體細(xì)胞的一種致命性的侵襲性腫瘤。膠質(zhì)瘤發(fā)生的同時(shí)EGFR和 P13K信號(hào)通路處于組成性激活狀態(tài)[74]。果蠅胚胎神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞EGFR和 P13K信號(hào)通路的激活導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖以及幼蟲(chóng)的大腦顯著增大。當(dāng)把膠質(zhì)瘤移植到果蠅腹部,則這種大腦來(lái)源的腫瘤不斷長(zhǎng)大并入侵鄰近組織,而且導(dǎo)致與腫瘤發(fā)生相關(guān)的一系列基因網(wǎng)落激活,包括Myc、Rb、Cyclins和dTor[75]。有趣的是,EGFR/P13K信號(hào)通路在成神經(jīng)細(xì)胞中的激活比較早,不會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖,提示果蠅幼蟲(chóng)膠質(zhì)細(xì)胞可能存在一種不同于成神經(jīng)細(xì)胞而有助于膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的狀態(tài)。

Witter等[76]分析了在果蠅幼蟲(chóng)眼盤(pán)膠質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)激活的果蠅EGFR、P13K和其他酪氨酸激酶受體(PDGFR/VEGFR、InR、EGFR)的轉(zhuǎn)基因果蠅品系。這些轉(zhuǎn)基因促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增殖,而且,EGFR和P13K可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞沿視神經(jīng)異常遷移。因此,這些果蠅模型復(fù)制了人腦膠質(zhì)瘤的主要組織學(xué)特征,包括沿神經(jīng)束入侵大腦結(jié)構(gòu)。過(guò)表達(dá)EGFR/P13K細(xì)胞的侵襲性可以通過(guò)飼喂果蠅幼蟲(chóng) EGFR抑制劑吉非替尼來(lái)部分逆轉(zhuǎn),P13K的抑制劑渥曼青霉素或Akt的抑制劑曲西立濱可完全挽救過(guò)表達(dá) EGFR/P13K細(xì)胞的表型。Read等[75]研究了激活果蠅幼蟲(chóng)大腦膠質(zhì)細(xì)胞D-EGFR或P13K信號(hào)后的表型。通過(guò)對(duì)這兩條通路不同組分的活性進(jìn)行修飾后發(fā)現(xiàn),EGFR和P13K通路誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化起協(xié)同作用。移植以后,EGFR/P13K激活的膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生較大的侵襲性腫瘤,刺激新的管道生長(zhǎng),其過(guò)程類似腫瘤血管生成。

2.9 PAX7-FKHR和橫紋肌肉瘤(Alveolar rhabdomyosarcoma,ARMS)

ARMS是一種侵襲性的兒童肌肉癌癥,是由兩種不同的染色體異位導(dǎo)致PAX3或PAX7的DNA結(jié)合域和FKHR/FOXO1的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生嵌合體蛋白引起[77]。PAX-FKHR融合作為致癌基因,干擾骨骼肌肉分化。而正常情況下骨骼肌分化受PAX3和PAX7的調(diào)控。有趣的是,在ARMS小鼠模型中,PAX3-FKHR在分化的肌纖維中表達(dá),而在肌肉干細(xì)胞中無(wú)表達(dá),提示PAX3-FKHR惡性細(xì)胞可能在合胞體肌肉組織有絲分裂后產(chǎn)生[78,79]。然而,引起ARMS的細(xì)胞類型的起源仍然存在爭(zhēng)議。Galindo等[80,81]利用果蠅肌肉來(lái)評(píng)估PAX-FKHR的活性主要基于果蠅和脊椎動(dòng)物生成肌肉過(guò)程的相似性和果蠅肌肉實(shí)時(shí)成像的可行性。值得注意的是,在分化的肌肉中表達(dá)PAX-FKHR引起合胞肌纖維的單個(gè)出芽并散播到其他組織。此外,分別增強(qiáng)或降低Ras的活性可增強(qiáng)或抑制PAX-FKHR相關(guān)的表型。因此,PAX-FKHR融合蛋白可能作用于Ras信號(hào)通路,通過(guò)“逆轉(zhuǎn)”或抑制肌細(xì)胞末端分化來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。更有意思的是,PAX-FKHR表達(dá)可誘導(dǎo)出現(xiàn)基因劑量敏感性的幼蟲(chóng)致死性表型,這可以用于鑒定其功能性伙伴基因的遺傳性篩選工作。

2.10 Ret基因和多發(fā)性內(nèi)分泌腺腫瘤綜合征 2型(Multiple endocrine neoplasia type 2,MEN2)

多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤綜合征是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性腫瘤,其發(fā)病與原癌基因Ret的突變與激活有關(guān)。目前已知MEN2型的突變位點(diǎn)位于Ret原癌基因第10號(hào)和11號(hào)外顯子編碼的半胱氨酸豐富的胞外區(qū)域。這些突變使胞外的一個(gè)保守的半胱氨酸突變?yōu)槠渌被?從而引起受體的二聚化,并引起其胞內(nèi)部分酪氨酸殘基自身磷酸化,進(jìn)而激活酪氨酸激酶途徑; 此外還有一些其他位點(diǎn)的突變?cè)诓灰鹗荏w二聚化的情況下,亦能引起受體自身磷酸化,進(jìn)而激活酪氨酸激酶途徑[82]。果蠅和脊椎動(dòng)物的Rets的表達(dá)模式相似,且果蠅體內(nèi)的RetMEN2突變殘基保守[83]。在發(fā)育的果蠅眼部表達(dá)dRetMEN2A 或dRetMEN2B類似物的突變體可誘導(dǎo)產(chǎn)生一些與人類 MEN2腫瘤相關(guān)的表型缺陷,如促進(jìn)細(xì)胞增殖、代償性細(xì)胞死亡和細(xì)胞分化異常[84]。這些眼部缺陷的程度與基因劑量有關(guān)。大規(guī)模的遺傳合作篩選準(zhǔn)確定位了一定數(shù)量的RetMEN2的修飾位點(diǎn)。然而,所有這些修飾位點(diǎn)都可以和dRetMEN2A、dRetMEN2B發(fā)生相互作用,由此認(rèn)為 MEN2A和MEN2B的表型區(qū)別可能是由于Ret激酶活性的改變不同,而并非是不同的信號(hào)特異性差異。人類同源基因的兩個(gè)修飾位點(diǎn)TNIK和CHD3/Mi-2a在MEN2相關(guān)的嗜鉻細(xì)胞瘤中出現(xiàn)雜合性丟失,由此推斷可能參與腎上腺組織腫瘤生成。此外,給果蠅幼蟲(chóng)飼喂ZD6474(在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,可以阻止 RET來(lái)源的腫瘤蛋白的酪氨酸激酶的活性),可抑制dRetMEN2相關(guān)的表型[85]。因此,這種果蠅癌癥模型也可能被用來(lái)篩選治療用的化合物。

3 果蠅在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用前景

以果蠅為模型研究人類癌癥相關(guān)的致癌基因極其修飾組分的功能,可加速人們對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的理解,并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)用于腫瘤早期診斷的新的生物標(biāo)志物、潛在的藥物作用靶點(diǎn),為進(jìn)一步研發(fā)抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。雖然目前大多數(shù)研究仍集中在腫瘤抑制基因和腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制方面,但現(xiàn)代果蠅研究的新技術(shù)和果蠅作為模式生物的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)使得果蠅可能成為開(kāi)發(fā)治療腫瘤藥物的理想系統(tǒng),用于抗癌藥物的低-高通量篩選和藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。

利用果蠅進(jìn)行腫瘤學(xué)方面的研究不免會(huì)遇到很多挑戰(zhàn),如致瘤性炎癥、體內(nèi)篩選作用于癌癥干細(xì)胞的藥物、癌癥治療藥物的設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)等,這些挑戰(zhàn)將使研究者們以全新的角度認(rèn)識(shí)和理解采用“多目標(biāo)”的方法來(lái)治療癌癥。創(chuàng)新技術(shù),如微陣列和納米技術(shù)、計(jì)算機(jī)和生物信息學(xué)與果蠅全基因組分析、染色質(zhì)功能圖譜、果蠅基因組的順式調(diào)控圖譜等相結(jié)合,可以更準(zhǔn)確地確定影響或決定單個(gè)癌細(xì)胞發(fā)展成腫瘤的基因網(wǎng)絡(luò)或通路。以上這些腫瘤學(xué)研究的新的方向,不僅強(qiáng)調(diào)了基礎(chǔ)研究的價(jià)值,也肯定了果蠅作為模式生物在研究癌癥復(fù)雜性方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

[1]Moloney A,Sattelle DB,Lomas DA,Crowther DC.Alzheimer’s disease:insights fromDrosophila melanogastermodels.Trends in Biochemical Sciences,2009,35(4):228–235.

[2]Feany MB,Bender WW.ADrosophilamodel of Parkinson’s disease.Nature,2000,404(6776):394–398.

[3]Wolfgang WJ,Miller TW,Webster JM,Huston JS,Thompson LM,Marsh JL,Messer A.Suppression of Huntington’s disease pathology inDrosophilaby human single-chain Fv antibodies.Proc Natl Acad Sci USA102(32):11563–11568.

[4]Thackray AM,Muhammad F,Zhang C,Di Y,Jahn TR,Landgraf M,Crowther DC,Evers JF,Bujdoso R.Ovine PrP transgenicDrosophilashow reduced locomotor activity and decreased survival.Biochem J,2012,444(3):487– 495.

[5]St Johnston D.The art and design of genetic screens:Drosophila melanogaster.Nat Rev Genet,2002,3(3):176–188.

[6]Pandey UB,Nichols CD.Human disease models inDrosophila melanogasterand the role of the fly in therapeutic drug discovery.Pharmacol Rev,2011,63(2):411–436.

[7]Satta R,Dimitrijevic N,Manev H.Drosophilametabolize 1,4-butanediol into gamma-hydroxybutyric acid in vivo.Eur J Pharmacol,2003,473(2-3):149–152.

[8]Wolf FW,Heberlein U.Invertebrate models of drug abuse.J Neurobiol,2003,54(1):161–178.

[9]Andretic R,Kim YC,Jones FS,Han KA,Greenspan RJ.DrosophilaD1 dopamine receptor mediates caffeineinduced arousal.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(51):20392–20397.

[10]Lloyd TE,Taylor JP.Flightless flies:Drosophilamodels of neuromuscular disease.Ann NY Acad Sci,2010,1184:e1–e20.

[11]Reiter LT,Potocki L,Chien S,Gribskov M,Bier E.A systematic analysis of human disease-associated gene sequences inDrosophila melanogaster.Genome Res,2001,11(6):1114–1125.

[12]Wassarman DA,Therrien M,Rubin GM.The Ras signaling pathway inDrosophila.Curr Opin Genet Dev,1995,5(1):44–50.

[13]Oro AE,Higgins KM,Hu ZL,Bonifas JM,Epstein EH Jr,Scott MP.Basal cell carcinomas in mice overexpressing sonic hedgehog.Science,1997,276(5313):817–821.

[14]Dahmane N,Lee J,Robins P,Heller P,Ruizi AA.Activation of the transcription factor Gli1 and the sonic hedgehog signalling pathway in skin tumours.Nature,1997,389(6653):876–881.

[15]Gonzalez C.Drosophila melanogaster:a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.Nat Rev Cancer,2013,13(3):172–183.

[16]Ranganathan P,Weaver KL,Capobianco AJ.Notch signaling in solid tumours:a little bit of everything but not all the time.Nat Rev Cancer,2011,11(5):338–351.

[17]Espinoza I,Pochampally R,Xing F,Watabe K,Miele L.Notch signaling:targeting cancer stem cells and epithelial-to-mesenchymal transition.Onco Targets Ther,2013,6:1249–1259.

[18]Malinge S,Ben-Abdelali R,Settegrana C,Radford-Weiss I,Debre M,Beldford K,Macintyre EA,Villeval JL,Vainchenker W,Berger R,Bernard OA,Delabesse E,Penard-Lacronique V.Novel activating JAK2 mutation in a patient with Down syndrome and B-cell Precursor acute lymphoblastic leukemia.Blood,2007,109(5):2202–2204.

[19]Harrison DA,Binari R,Nahreini TS,Gilman M,Perrimon N.Activation of aDrosophilaJanus kinase(JAK) causes hematopoietic neoplasia and developmental defects.EMBO J,1995,14(12):2857–2865.

[20]Vainchenker W,Dusa A,Constantinescu SN.JAKs in pathology:role of Janus kinases in hematopoietic malignancies and immunodeficiencies.Semin Cell Dev Biol,2008,19(4):385–393.

[21]Polakis P.The many ways of Wnt in cancer.Curr Opin Genet Dev,2007,17(1):45–51.

[22]Logan CY,Nusse R.The Wnt signaling pathway in development and disease.Annu Rev Cell Dev Biol,2004,20:781–810.

[23]Klaus A,Birchmeier W.Wnt signalling and its impact on development and cancer.Nat Rev Cancer,2008,8(5):387–398.

[24]Prestwich TC,Macdougald OA.Wnt/β-catenin signaling in adipogenesis and metabolism.Curr Opin Cell Biol,2007,19(6):612–617.

[25]Yamashita YM,Jones DL,Fuller MT.Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.Science,2003,301(5639):1547–1550.

[26]Roberts DM,Pronobis MI,Poulton JS,Kane EG,Peifer M.Regulation of Wnt signaling by the tumor suppressor adenomatous polyposis coli does not require the ability to enter the nucleus or a particular cytoplasmic localization.Mol Biol Cell,2012,23(11):2041–2056.

[27]Takacs CM,Baird JR,Hughes EG,Kent SS,Benchabane H,Paik R,Ahmed Y.Dual positive and negative regulation of wingless signaling by adenomatous polyposis coli.Science,2008,319(5861):333–336.

[28]Cheng LY,Bailey AP,Leevers SJ,Ragan RJ,Driscoll PC,Gould AP.Anaplastic lymphoma kinase spares organ growth during nutrient restriction inDrosophila.Cell,2011,146(3):435–447.

[29]Zhao B,Li L,Lei QY,Guan KL.The Hippo-YAP pathway in organ size control and tumorigenesis:an updated version.Genes Dev,2010,24(9):862–874.

[30]Kasai Y,Cagan R.Drosophilaas a tool for personalized medicine:a primer.Per Med,2010,7(6):621–632.

[31]Asha H,Nagy I,Kovacs G,Stetson D,Ando I,Dearolf CR.Analysis of ras-induced overproliferation in drosophila hemocytes.Genetics,2003,163(1):203–215.

[32]Miller M,Ginalski K,Lesyng B,Nakaigawa N,Schmidt L,Zbar B.Structural basis of oncogenic activation caused by point mutations in the kinase domain of the MET proto-oncogene:modeling studies.Proteins,2001,44(1):32–43.

[33]Bell AJ,Aean MJ,Dockendorff TC.Flies as the ointment:Drosophilamodeling to enhance drug discovery.Fly(Austin),2009,3(1):39–49.

[34]Xu T,Rubin GM.Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.Development,1993,117(4):1223–1237.

[35]Pagliarini RA,Xu T.A genetic screen inDrosophilafor metastatic behavior.Science,2003,302(5648):1227–1231.

[36]Leong GR,Goulding KR,Amin N,Richardson HE,Brumby AM.Scribble mutants promote aPKC and JNK-dependent epithelial neoplasia independently of Crumbs.BMC Biol,2009,7:62.

[37]Martin-Belmonte F,Perez-Moreno M.Epithelial cell polarity,stem cells and cancer.Nat Rev Cancer,2012,12(1):23–38.

[38]Igaki T,Pagliarini RA,Xu T.Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation inDrosophila.Curr Biol,2006,16(11):1139–1146.

[39]Kim K,Lee YS,Harris D,Nakahara K,Carthew RW.The RNAi pathway initiated by Dicer-2 inDrosophila.Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2006,71:39–44.

[40]Mohr SE,Perrimon N.RNAi screening:new approaches,understandings,and organisms.Wiley Interdiscip Rev RNA,2012,3(2):145–158.

[41]Kuttenkeuler D,Boutros M.Genome-wide RNAi as a route to gene function inDrosophila.Brief Funct Genomic Proteomic,2004,3(2):168–176.

[42]Dasgupta R,Perrimon N.Using RNAi to catchDrosophilagenes in a web of interactions:insights into cancer research.Oncogene,2004,23(51):8359–8365.

[43]Miles WO,Dyson NJ,Walker JA.Modeling tumor invasion and metastasis inDrosophila.Dis Model Mech,2011,4(6):753–761.

[44]Willecke M,Hamaratoglu F,Kango-Singh M,Udan R,Chen CL,Tao CY,Zhang XW,Halder G.The fat Cadherin acts through the Hippo tumor-suppressor pathway to regulate tissue size.Curr Biol,2006,16(21):2090–2100.

[45]Neumüller RA,Richter C,Fischer A,Novatchkova M,Neumüller KG,Knoblich JA.Genome-wide analysis of self-renewal inDrosophilaneural stem cells by transgenic RNAi.Cell Stem Cell,2011,8(5):580–593.

[46]Read RD,Fenton TR,Gomez GG,Wykosky J,Vandenberg SR,Babic I,Iwanami A,Yang HJ,Cavenee WK,Mischel PS,Furnari FB,Thomas JB.A kinome-wide RNAi screen inDrosophilaGlia reveals that the RIO kinases mediate cell proliferation and survival through TORC2-Akt signaling in glioblastoma.PLoS Genet,2013,9:e1003253.

[47]Cabrera CV,Alonso MC,Johnston P,Phillips RG,Lawrence PA.Phenocopies induced with antisense RNA identify thewinglessgene.Cell,1987,50(4):659–663.

[48]Quintás-Cardama A,Cortes J.Molecular biology of bcrabl1-positive chronic myeloid leukemia.Blood,2009.113(8):1619–1630.

[49]Ren RB.Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia.Nat Rev Cancer,2005,5(3):172–183.

[50]Fogerty FJ,Juang JL,Petersen J,Clark MJ,Hoffmann FM,Mosher DF.Dominant effects of thebcr-abloncogene onDrosophilamorphogenesis.Oncogene,1999,18(1):219–232.

[51]Stevens TL,Rogers EM,Koontz LM,Fox DT,Homem CCF,Nowotarski SH,Artabazon NB,Peifer M.Using Bcr-Abl to examine mechanisms by which abl kinase regulates morphogenesis inDrosophila.Mol Biol Cell,2008,19(1):378–393.

[52]Ziemin-Van Der Poel S,McCabe NR,Gill HJ,Espinosa R 3rd,Patel Y,Harden A,Rubinelli P,Smith SD,LeBeau MM,Rowley JD.Identification of a gene,MLL,that spans the breakpoint in 11q23 translocations associated with human leukemias.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(23):10735–10739.

[53]Meyer C,Kowarz E,Hofmann J,Renneville A,Zuna J,Trka J,Ben Abdelali R,Macintyre E,De Braekeleer E,De Braekeleer M,Delabesse E,de Oliveira MP,Cavé H,Clappier E,van Dongen JJ,Balgobind BV,van den Heuvel-Eibrink MM,Beverloo HB,Panzer-Grümayer R,Teigler-Schlegel A,Harbott J,Kjeldsen E,Schnittger S,Koehl U,Gruhn B,Heidenreich O,Chan LC,Yip SF,Krzywinski M,Eckert C,M?ricke A,Schrappe M,Alonso CN,Sch?fer BW,Krauter J,Lee DA,Zur Stadt U,Te Kronnie G,Sutton R,Izraeli S,Trakhtenbrot L,Lo Nigro L,Tsaur G,Fechina L,Szczepanski T,Strehl S,Ilencikova D,Molkentin M,Burmeister T,Dingermann T,Klingebiel T,Marschalek R.New insights to the MLL recombinome of acute leukemias.Leukemia,2009,23(8):1490–1499.

[54]Muyrers-Chen I,Rozovskaia T,Lee N,Kersey JH,Nakamura T,Canaani E,Paro R.Expression of leukemic MLL fusion proteins inDrosophilaaffects cell cycle control and chromosome morphology.Oncogene,2004,23(53):8639–8648.

[55]D?hner H,Estey EH,Amadori S,Appelbaum FR,Büchner T,Burnett AK,Dombret H,Fenaux P,Grimwade D,Larson RA,Lo-Coco F,Naoe T,Niederwieser D,Ossenkoppele GJ,Sanz MA,Sierra J,Tallman MS,L?wenberg B,Bloomfield CD.Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults:recommendations from an international expert panel,on behalf of the European LeukemiaNet.Blood,2010,115(3):453–474.

[56]Crozatier M,Vincent A.Drosophila:a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias.Dis Model Mech,2011,4(4):439–445.

[57]Niebuhr B,Fischer M,T?ger M,Cammenga J,Stocking C.Gatekeeper function of the RUNX1 transcription factor in acute leukemia.Blood Cells Mol Dis,2008,40(2):211–218.

[58]Ferjoux G,Augé B,Boyer K,Haenlin M,Waltzer L.A GATA/RUNX cis-regulatory module couplesDrosophilablood cell commitment and differentiation into crystal cells.Dev Biol,2007,305(2):726–734.

[59]Vidal M,Wells S,Ryan A,Cagan R.ZD6474 suppresses oncogenic RET isoforms in aDrosophilamodel for type 2 multiple endocrine neoplasia syndromes and papillary thyroid carcinoma.Cancer Res,2005,65(9):3538–3541.

[60]Waltzer L,Ferjoux G,Bataillé L,Haenlin M.Cooperation between the GATA and RUNX factors Serpent and Lozenge duringDrosophilahematopoiesis.EMBO J,2003,22(24):6516–6525.

[61]Williams JA,Su HS,Bernards A,Field J,Sehgal A.A circadian output inDrosophilamediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.Science,2001,293(5538):2251–2256.

[62]Barkan B,Starinsky S,Friedman E,Stein R,Kloog Y.The Ras inhibitor farnesylthiosalicylic acid as a potential therapy for neurofibromatosis type 1.Clin Cancer Res,2006,12(18):5533–5542.

[63]Dankort DL,Wang Z,Blackmore V,Moran MF,Muller WJ.Distinct tyrosine autophosphorylation sites negatively and positively modulate neu-mediated transformation.Mol Cell Biol,1997,17(9):5410–5425.

[64]Settle M,Gordon MD,Nadella M,Dankort D,Muller W,Jacobs JR.Genetic identification of effectors downstream of Neu(ErbB-2) autophosphorylation sites in aDrosophilamodel.Oncogene,2003,22(13):1916–1926.

[65]Alvarado D,Klein DE,Lemmon MA.ErbB2 resembles an autoinhibited invertebrate epidermal growth factor receptor.Nature,2009,461(7261):287–291.

[66]Caldeira J,Pereira PS,Suriano G,Casares F.Using fruitflies to help understand the molecular mechanisms of human hereditary diffuse gastric cancer.Int J Dev Biol,2009,53(8–10):1557–15561.

[67]Pereira PS,Teixeira A,Pinho S,Ferreire P,Fernandes J,Oliveira C,Seruca R,Suriano G,Casares F.E-cadherin missense mutations,associated with hereditary diffuse gastric cancer(HDGC) syndrome,display distinct invasive behaviors and genetic interactions with the Wnt and Notch pathways inDrosophilaepithelia.Hum Mol Genet,2006,15(10):1704–1712.

[68]Kalluri R,Zeisberg M.Fibroblasts in cancer.Nat Rev Cancer,2006 6(5):392–401.

[69]Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation.Cell,2011,144(5):646–674.

[70]Pietras K,?stman A.Hallmarks of cancer:interactions with the tumor stroma.Exp Cell Res,2010,316(8):1324–1331.

[71]Mocellin S,Nitti D.TNF and cancer:the two sides of the coin.Front Biosci,2008,13:2774–2783.

[72]Igaki T,Pastor-Pareja JC,Aonuma H,Miura M,Xu T.Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling inDrosophila.Dev Cell,2009,16(3):458–465.

[73]Cordero JB,Macagno JP,Stefanatos RK,Strathdee KE,Cagan RL,Vidal M.Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.Dev Cell,2010,18(6):999–1011.

[74]Furnari FB,Fenton T,Bachoo RM,Mukasa A,Stommel JM,Stegh A,Hahn WC,Ligon KL,Louis DN,Brennan C,Chin L,DePinho RA,Cavenee WK.Malignant astrocytic glioma:genetics,biology,and paths to treatment.Genes Dev,2007,21(21):2683–2710.

[75]Read RD,Cavenee WK,Furnari FB,Thomas JB.A drosophila model for EGFR-Ras and PI3K-dependent human glioma.PLoS Genet,2009,5:e1000374.

[76]Witte HT,Jeibmann A,Kl?mbt C,Paulus W.Modeling glioma growth and invasion inDrosophilamelanogaster.Neoplasia,2009,11(9):882–888.

[77]Charytonowicz E,Cordon-Cardo C,Matushansky I,Ziman M.Alveolar rhabdomyosarcoma:is the cell of origin a mesenchymal stem cell?Cancer Lett,2009,279(9):126–136.

[78]Keller C,Hansen MS,Coffin CM,Capecchi MR.Pax3:Fkhrinterferes with embryonicPax3andPax7function:implications for alveolar rhabdomyosarcoma cell of origin.Genes Dev,2004,18(21):2608–2613.

[79]Keller C,Arenkiel BR,Coffin CM,El-Bardeesy N,DePinho RA,Capecchi MR.Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice:cooperativity of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function.Genes Dev,2004,18(21):2614–2626.

[80]Maqbool T,Jagla K.Genetic control of muscle development:learning from Drosophila.J Muscle Res Cell Motil,2007,28(7–8):397–407.

[81]Galindo RL,Allport JA,Olson EN.ADrosophilamodel of the rhabdomyosarcoma initiator PAX7–FKHR.Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(36):13439–13444.

[82]Peczkowska M,Januszewicz A.Multiple endocrine neoplasia type 2.Familial Cancer,2005,4(1):25–36.

[83]Falchetti A,Marini F,Luzi E,Tonelli F,Brandi ML.Multiple endocrine neoplasms.Best Pract Res Clin Rheumatol,2008,22(1):149–163.

[84]Hahn M,Bishop J.Expression pattern ofDrosophilaret suggests a common ancestral origin between the metamorphosis precursors in insect endoderm and the vertebrate enteric neurons.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(3):1053–1058.

[85]Read RD,Goodfellow PJ,Mardis ER,Novak N,Armstrong JR,Cagan RL.ADrosophilamodel of multiple endocrine neoplasia type 2.Genetics,2005,171(3):1057–1081.