結(jié)核病DNA疫苗的研究進(jìn)展

張曉燕，余 琦，白雪娟，梁 艷，李 寧※(綜述)，吳雪瓊(審校)

(1.中國人民解放軍第三○九醫(yī)院病理科,北京 100091; 2.鄭州金域臨床檢驗(yàn)中心，鄭州 450000)

全世界約20億人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年結(jié)核病新增病例870萬，將近140萬人死于此病[1]。隨著耐多藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病和人類免疫缺陷病毒感染患者的逐漸增多，結(jié)核病控制形勢(shì)越來越嚴(yán)峻[2]。從1923年開始，卡介苗就已經(jīng)加入世界衛(wèi)生組織擴(kuò)大免疫計(jì)劃之中，至今卡介苗的接種量超過30億劑，并且每年有將近1億的新生兒仍在接種此疫苗，這使其成為臨床應(yīng)用最為廣泛的結(jié)核疫苗，也是目前唯一可用于人類預(yù)防結(jié)核病的疫苗[3]?？ń槊缈梢杂行ьA(yù)防新生兒及兒童嚴(yán)重的結(jié)核病(如結(jié)核性腦膜炎和粟粒性結(jié)核)，但對(duì)于成人肺結(jié)核疾病的預(yù)防效果非常弱，其免疫保護(hù)效率為0%～80%[4-7]。因此，研發(fā)新型的結(jié)核疫苗以替代或加強(qiáng)卡介苗勢(shì)在必行。

1 DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)

DNA疫苗是一種最常見的基因疫苗，將含編碼某種外源蛋白基因的質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入動(dòng)物組織機(jī)體內(nèi)，外源基因于體細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物為病原體的有效抗原成分，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，分別介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。DNA疫苗作為第三代疫苗，與第一代疫苗(減毒、滅活疫苗)及第二代疫苗(亞單位疫苗)相比，具有以下優(yōu)勢(shì)[8]：制備簡便，成本低廉；穩(wěn)定性及安全性更好；可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中或?qū)⒉煌目乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價(jià)核酸疫苗；可持續(xù)誘導(dǎo)體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答；預(yù)防和治療作用兼顧。

2 結(jié)核病DNA疫苗

1994年英國Lowrie等[9]首先報(bào)道將編碼麻風(fēng)分枝桿菌熱激蛋白 (heat shock proteins,HSP)65基因的重組質(zhì)粒DNA肌內(nèi)注射免疫小鼠，然后用結(jié)核分枝桿菌攻擊，結(jié)果細(xì)胞免疫功能顯著增強(qiáng)，肝臟菌落形成單位顯著減少，表明DNA疫苗與常規(guī)卡介苗有相似的保護(hù)作用。從此，DNA疫苗成為防治結(jié)核病研究的新熱點(diǎn)。

1998年隨著英國Sanger中心和法國Paeteur研究所科學(xué)家對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的全基因組測(cè)序工作的圓滿完成，為尋找結(jié)核DNA疫苗的研究提供了極好的機(jī)遇[10-11]。結(jié)核分枝桿菌全基因組序列由4 411 529 bp組成，包括4411個(gè)基因，具有潛在編碼能力的基因約有3977個(gè)，約占90.2%。結(jié)核DNA疫苗所插入的目的基因應(yīng)選擇具有免疫保護(hù)性的抗原序列，從中篩選保護(hù)力強(qiáng)的作為候選基因。在這二十幾年中，有許多結(jié)核病DNA疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了較理想的效果，主要包括Ag85復(fù)合物、6×103早期分泌性抗原靶(6×103Da early secretory antigenic target,ESAT6)、結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白64(mycobacterium tuberculosis secreted proteins 64,MPT64)、HSP65、HSP70等。也有一些新型的結(jié)核病DNA疫苗取得了一定的成果。

2.1傳統(tǒng)的結(jié)核病DNA疫苗

2.1.1Ag85復(fù)合物 Ag85復(fù)合物是結(jié)核分枝桿菌和卡介苗中的主要分泌性蛋白，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv株中占分泌蛋白總量的30%，是一組重要的分枝桿菌分泌蛋白。Ag85復(fù)合物是由Ag85A、Ag85B、Ag85C三個(gè)亞單位組成，有研究表明Ag85A和Ag85B的可誘導(dǎo)較強(qiáng)的Th1免疫反應(yīng)，干擾素γ、白細(xì)胞介素2和腫瘤壞死因子α顯著升高，而Ag85C卻無此效應(yīng)[8]。Ag85A是一種纖維連接蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量是32×103，三者中分泌量較高。Wang等[12]在研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表明，Ag85A DNA疫苗能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)：Th1型細(xì)胞因子(干擾素γ和白細(xì)胞介素2)的顯著分泌，并且在調(diào)節(jié)大量免疫細(xì)胞激活及誘導(dǎo)細(xì)胞毒性細(xì)胞在清除病毒或者細(xì)菌中發(fā)揮重要的作用，本實(shí)驗(yàn)室用生理鹽水、空載體組、微卡菌苗、Ag85A DNA疫苗分別肌內(nèi)注射免疫小鼠，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定產(chǎn)生的干擾素γ高于其他組，白細(xì)胞介素4最低。Liang等[13]通過構(gòu)建多重耐藥結(jié)核病菌株的小鼠模型，用不同組疫苗治療，最后單獨(dú)使用Ag85A DNA疫苗組與利福平或吡嗪酰胺聯(lián)合治療組降低了肺、脾的細(xì)菌載量，表明Ag85A DNA疫苗對(duì)多重耐藥結(jié)核病菌株也有一定的治療作用。

Ag85B抗原具有較高的免疫原性，免疫接種Ag85B抗原，可以保護(hù)小鼠和豚鼠避免結(jié)核分枝桿菌引起的相關(guān)炎性反應(yīng)[14]。用Ag85B DNA疫苗免疫小鼠，結(jié)果顯示由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素γ顯著增高，并且控制了巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌的增長，對(duì)感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠起到了保護(hù)性作用[15]。

2.1.2ESAT-6、MPT64 ESAT6和MPT64都是結(jié)核分枝桿菌早期分泌濾液蛋白中的主要成分，也是重要的T細(xì)胞抗原。Kamath等[16]將MPT64、Ag85B和ESAT-6這3種分泌性抗原基因分別導(dǎo)入pJW4303載體中，構(gòu)建成pJI23(DNA-64)、pJI30(DNA-85B)和pJIE6(DNA-E6)重組質(zhì)粒，并且以PBS、pJW4303載體和卡介苗作為對(duì)照組，分別肌內(nèi)注射免疫C57BL/6J鼠3次，每3周1次，MPT64、Ag85B DNA疫苗組的小鼠脾淋巴細(xì)胞明顯增殖并產(chǎn)生高水平干擾素γ，但不產(chǎn)生白細(xì)胞介素4，隨后第3次免疫小鼠后4周用結(jié)核分枝桿菌氣霧攻擊后，小鼠肺菌落計(jì)數(shù)顯示，Ag85B DNA疫苗的保護(hù)力最強(qiáng)，其次為ESAT6 DNA疫苗，MPT64 DNA疫苗次之，但三者均比卡介苗的保護(hù)力差。吳雪瓊等[17]用生理鹽水(A)、載體JW4303質(zhì)粒(B)和卡介苗(C)為對(duì)照，MPT64 DNA疫苗組(D)和ESAT6 DNA(E)疫苗組免疫小鼠，最后1次DNA免疫后3周腹腔內(nèi)注射結(jié)核分枝桿菌H37Rv株菌懸液，結(jié)核分枝桿菌攻擊5周后，B、C、D和E組脾菌落數(shù)均顯著少于A組；結(jié)核分枝桿菌攻擊10周后，從肺菌落數(shù)由低到高依次是C

2.1.3HSP65、HSP70 HSP65、HSP70都屬于HSP家族，在結(jié)構(gòu)上都是高度保守的蛋白質(zhì)，并且在結(jié)核分枝桿菌感染過程中，是機(jī)體對(duì)抗其入侵的重要的免疫保護(hù)性抗原，它們既能增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，又保持了分枝桿菌抗原特性與免疫佐劑的作用，并且還具有分子伴侶的作用，可協(xié)助表達(dá)蛋白質(zhì)的折疊，在結(jié)核分枝桿菌感染的后期發(fā)揮作用。Lowrie等[9]最先報(bào)道以麻風(fēng)分枝桿菌HSP65質(zhì)粒DNA免疫小鼠，然后用結(jié)核分枝桿菌或卡介苗攻擊，結(jié)果顯示，HSP65質(zhì)粒DNA能顯著增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，肝臟菌落計(jì)數(shù)顯著減少。Lowrie等[18]首次將HSP65、HSP70 DNA疫苗用于治療BALB/c小鼠結(jié)核病模型中，實(shí)驗(yàn)以生理鹽水、空質(zhì)粒載體和卡介苗為對(duì)照組，用pcDNA3.0-HSP65和pcDNA3.0-HSP70重組質(zhì)粒免疫小鼠，HSP65、HSP70 DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的γ干擾素水平顯著高于對(duì)照組，產(chǎn)生的白細(xì)胞介素4也顯著低于其他各組(P<0.05)；從小鼠的脾、肺菌落計(jì)數(shù)來看HSP65 DNA疫苗組最低，HSP70 DNA疫苗次之，先將結(jié)核小鼠經(jīng)化療12周后做菌落計(jì)數(shù)，再用生理鹽水、空載體質(zhì)粒、HSP65 DNA疫苗間隔2周免疫小鼠3次，第24周用地塞米松治療1次，8周后再做菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，HSP65 DNA疫苗可使小鼠結(jié)核病化療后脾和肺內(nèi)殘余的菌數(shù)顯著減少。Silva等[19]用HSP65 DNA疫苗結(jié)合化療藥物治療BALB/c小鼠結(jié)核病，1個(gè)月就可顯著減少肺和脾結(jié)核分枝桿菌載量，6個(gè)月后肺中未檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)HSP65聯(lián)合化療藥物治療對(duì)結(jié)核分枝桿菌敏感株H37Rv和耐藥株同樣有效。

2.2新型的結(jié)核病DNA疫苗

2.2.1Rv3407 結(jié)核分枝桿菌RV3407基因由300 bp組成，編碼一個(gè)由99個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為11.0096×103。Rv3407蛋白是結(jié)核分枝桿菌在生長過程中分泌到細(xì)胞外的分泌蛋白，主要在結(jié)核分枝桿菌休眠期表達(dá)，是一種潛伏相關(guān)抗原，此抗原受兩種復(fù)蘇促進(jìn)因子的調(diào)控[20]。Schuck等[21]研究35個(gè)結(jié)核潛伏期相關(guān)抗原和ESAT6/培養(yǎng)濾液蛋白融合抗原、純蛋白衍生物刺激活動(dòng)性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子，結(jié)果顯示，其中7種結(jié)核潛伏期相關(guān)抗原(Rv3407、Rv1733c、Rv2003、Rv2005c、Rv0140、Rv1009和Rv2450c)能刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的反應(yīng)，尤其是Rv3407特異的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)在結(jié)核潛伏感染患者中可廣泛檢出，而在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中未檢出，在個(gè)體中檢測(cè)Rv3407特異的T淋巴細(xì)胞干擾素γ反應(yīng)可有效地鑒別結(jié)核病患者和結(jié)核潛伏感染者，其一致率達(dá)83%。

Mollenkopf等[22]對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv和卡介苗菌株的蛋白質(zhì)采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，從而挑選表達(dá)不同的蛋白質(zhì)基因作為候選的DNA疫苗(至少60個(gè)蛋白在兩菌株中表達(dá)不同[23])，鑒定了其中36個(gè)基因作為候選的結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗，通過應(yīng)用氣溶膠法制備的小鼠結(jié)核模型進(jìn)一步研究其保護(hù)效力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)候選者Rv3407 DNA疫苗具有強(qiáng)而的免疫保護(hù)效力，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的干擾素γ。此外，通過卡介苗初免、Rv3407 DNA疫苗加強(qiáng)的異源性初免加強(qiáng)策略，其產(chǎn)生的抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)效力優(yōu)于卡介苗單獨(dú)免疫。

劉蓉娜等[24]以基因重組卡介苗AERAS-422基因組為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增獲得長300 bp的Rv3407基因片段，成功地構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Rv3407，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，采用免疫熒光法及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)到Rv3407蛋白在293T細(xì)胞中有表達(dá)，表明該質(zhì)?？赏ㄟ^宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達(dá)蛋白抗原。Rv3407 DNA疫苗能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，為新型結(jié)核疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

2.2.2Rv1733c Rv1733c是結(jié)核分枝桿菌在休眠期表達(dá)量比較高的一種保守的跨膜蛋白[25]。Gillian等[26]在南非、岡比亞和烏干達(dá)這三個(gè)結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家中研究7個(gè)經(jīng)典的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原和51個(gè)休眠調(diào)節(jié)子編碼的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白抗原刺激人機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答情況，發(fā)現(xiàn)Rv1733c抗原是這三種人群中被識(shí)別頻率最高的一個(gè)潛伏相關(guān)蛋白抗原，并且應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)全血中分泌的干擾素γ量也較高。Bivas-Benita等[27]用PLGA-PEI np載入pV1J.ns-tPA質(zhì)粒載體中與Rv1733c連接，構(gòu)建了Rv1733c DNA疫苗，每間隔3周肌內(nèi)注射免疫BALB/c小鼠1次，共3次，第3次免疫后3周，再用Rv1733c蛋白加不完全弗氏佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，結(jié)果顯示，Rv1733c DNA疫苗組的脾淋巴細(xì)胞增殖顯著高于空載體組，干擾素γ水平也顯著增加；并且在最后用蛋白加強(qiáng)免疫后脾淋巴細(xì)胞的增殖和干擾素γ分泌都顯著增強(qiáng)。Roupie等[28]將8個(gè)休眠調(diào)節(jié)子基因編碼的結(jié)核分枝桿菌抗原(Rv1733c、Rv1738、Rv2029c、Rv2031c、Rv2032、Rv2626c、Rv2627c和Rv2628)與DNA載體pV1J.ns-tPA連接，分別肌內(nèi)注射免疫BALB/c和C57BL/6J小鼠，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)Rv1733c DNA疫苗組小鼠血清中可產(chǎn)生較高水平的免疫球蛋白G抗體，但脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的Th1型細(xì)胞因子干擾素γ和白細(xì)胞介素2較少。Rv1733c DNA疫苗能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，而Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的結(jié)果尚不一致，是否可作為新型結(jié)核疫苗的侯選者尚需進(jìn)一步研究。

2.2.3Rv3872 RD1(region of difference-1)區(qū)基因僅存在于致病性結(jié)核分枝桿菌基因組中，而在卡介菌中缺失。RD1區(qū)全長9.5 kb，有9個(gè)開放讀碼框(Rv3871～Rv3879c)，共編碼9個(gè)蛋白質(zhì)，其中Rv3872編碼蛋白為PE35，是PE蛋白家族成員之一。PE蛋白質(zhì)家族是一個(gè)富含甘氨酸的蛋白質(zhì)家族，該家族蛋白質(zhì)在結(jié)核抗原變異中扮演著非常重要的角色。Hanif等[29]將PE35基因克隆到DNA疫苗載體pUMVC6中，構(gòu)建成pUMVC6-PE35重組質(zhì)粒，肌內(nèi)注射BALB/c小鼠，3周后最后一次免疫接種，將小鼠處死，進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示，PE35 DNA疫苗組的脾淋巴細(xì)胞顯著增殖，并且分泌大量Th1型細(xì)胞因子干擾素γ，而Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素5和抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10未檢測(cè)到，此外，他們又合成6個(gè)不同的PE35多肽(P1-P6)，對(duì)PE35 T細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，多肽P1、P3、P4和P5均可刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，其中多肽P4(VSAQAATAFTSEGIQLLASNAQD)脾淋巴細(xì)胞增殖最顯著；多肽P1、P3和P6可刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ，其中多肽P6(GEAVQDVARTYSQIDDGAAGVFAE)產(chǎn)生的干擾素γ最多；所有多肽刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞均未檢測(cè)到白細(xì)胞介素5和白細(xì)胞介素10的分泌。這些結(jié)果表明，PE35 DNA疫苗主要誘導(dǎo) Th1型免疫，PE35不同的抗原表位可誘導(dǎo)產(chǎn)生不同強(qiáng)度的T細(xì)胞反應(yīng)，PE35 DNA疫苗可能作為一種新的結(jié)核病候選疫苗。

3 小 結(jié)

隨著耐多藥結(jié)核病及廣泛耐藥結(jié)核病患者逐漸增多，再加上高病死率的人類免疫缺陷病毒感染，因此選擇一種有效地控制和預(yù)防結(jié)核病發(fā)生的具有安全、經(jīng)濟(jì)、高效的結(jié)核疫苗就顯得至關(guān)重要。雖然結(jié)核DNA疫苗以其無比的優(yōu)勢(shì)已成為研究熱點(diǎn)，包括多價(jià)的DNA疫苗、卡介苗初免DNA疫苗加強(qiáng)免疫、DNA疫苗與細(xì)胞因子聯(lián)合免疫等，但其仍存在一些不可避免的問題，如抗原基因的選擇、載體的構(gòu)建、免疫途徑和免疫程序的選擇、免疫佐劑的使用、安全性、免疫耐受性等。隨著對(duì)結(jié)核桿菌致病的免疫機(jī)制的進(jìn)一步研究和闡述，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，相信這些問題都將解決，DNA疫苗會(huì)以其他疫苗無可比擬的優(yōu)勢(shì)給結(jié)核患者帶來希望。

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