慢性乙型肝炎患者腸源性內(nèi)毒素血癥中免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)變化的研究*

王建紅李紅趙龍鳳

慢性乙型肝炎患者腸源性內(nèi)毒素血癥中免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)變化的研究*

王建紅①李紅②趙龍鳳②

目的：研究慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者腸源性內(nèi)毒素血癥（intestinal endotoxemia，IETM）中與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）、Th17細(xì)胞相關(guān)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)變化。方法：應(yīng)用ELISA法分別對(duì)80例CHB患者和20例健康對(duì)照者的血漿IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-23及內(nèi)毒素水平進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)測(cè)定的內(nèi)毒素水平，將CHB患者分為內(nèi)毒素陽(yáng)性組和內(nèi)毒素陰性組。結(jié)果：CHB患者血漿IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-23水平均明顯高于健康對(duì)照組（Z值分別為5.265、6.859、6.894、5.028、6.877，均P＜0.01）。內(nèi)毒素陽(yáng)性組患者明顯高于內(nèi)毒素陰性組和健康對(duì)照組（H值分別為45.833、48.423、48.984、75.184、75.814，均P＜0.01）。結(jié)論：CHB患者IETM時(shí)血漿中與Treg、Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平進(jìn)一步增高。

乙型肝炎； 慢性； 腸源性內(nèi)毒素血癥； 細(xì)胞因子

乙型肝炎病毒（HBV）是一種在世界范圍廣泛流行、嚴(yán)重危害人類健康的傳染病[1]。HBV感染后致肝臟損害主要由機(jī)體對(duì)HBV免疫應(yīng)答介導(dǎo)[2]。目前，HBV感染后慢性化進(jìn)程中免疫應(yīng)答的確切機(jī)制還不清楚，但可以肯定的是細(xì)胞免疫在其中起重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）、Th17細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的兩類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，兩者密切相關(guān)，來(lái)源與同一初始CD4+T淋巴細(xì)胞群，在分化和功能上既相互聯(lián)系，又相互制約[3]。Treg/Th17細(xì)胞失衡可導(dǎo)致多種慢性感染性疾病、自身免疫疾病及腫瘤等的發(fā)生、發(fā)展。已有研究報(bào)道，慢性乙型肝炎（CHB）患者體內(nèi)亦存在Treg/Th17失衡，參與HBV感染慢性化的進(jìn)程[4-5]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者體內(nèi)長(zhǎng)期持續(xù)患有腸源性內(nèi)毒素血癥（intestinal endotoxemia，IETM）時(shí)可以導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能低下，造成HBV難以清除[6]。那IETM與Treg/Th17平衡關(guān)系如何呢？本研究通過(guò)檢測(cè)內(nèi)毒素水平，將CHB患者分為內(nèi)毒素陽(yáng)性組和內(nèi)毒素陰性組，通過(guò)比較兩組患者外周血Treg、Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的的水平，間接探討IETM中CHB患者外周血Treg/Th17平衡的改變。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年2月-2013年11月在本院住院的80例CHB患者，其中男58例，女22例，年齡18～69歲，平均（30±6）歲。CHB患者診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）[7]，近半年均未服用過(guò)抗病毒及免疫調(diào)節(jié)劑藥物，排除其他肝炎病毒感染及其他原因引起的肝損害。同時(shí)選取20例健康對(duì)照者，男14例，女6例，年齡20～55歲，平均（25±9）歲，肝功能正常，HBV血清學(xué)標(biāo)志物陰性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，所有患者均簽署知情同意書(shū)。兩組研究對(duì)象一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測(cè)方法 抽取受試對(duì)象晨間空腹靜脈血1 mL，離心分離血清，-20 ℃保存。待所有樣本收集完全后，取凍存血清，ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)血漿IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17、IL-23及內(nèi)毒素水平。根據(jù)檢測(cè)的內(nèi)毒素水平，將CHB患者分為內(nèi)毒素陽(yáng)性組和陰性組，內(nèi)毒素陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)為健康者內(nèi)毒素水平95%可信區(qū)間的上限值36.68 pg/mL，＞36.68 pg/mL為內(nèi)毒素陽(yáng)性組，≤36.68 pg/mL為內(nèi)毒素陰性組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示；采用兩個(gè)樣本比較的Mann-Whitney U檢驗(yàn)或多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康者與CHB患者內(nèi)毒素、IL-10、TGF-β水平的比較 80例CHB患者中，45例發(fā)生IETM，占56.25%。內(nèi)毒素陽(yáng)性組與陰性組的年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與健康者比較，CHB患者內(nèi)毒素水平明顯升高（P＜0.01），且IL-10、TGF-β水平均明顯升高（Z值分別為5.265、6.859）。內(nèi)毒素陽(yáng)性組IL-10、TGF-β水平均較陰性組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.2 健康者與CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平的比較 與健康者比較，CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平均明顯升高（Z值分別為6.894、5.028、6.877）。內(nèi)毒素陽(yáng)性組IL-6、IL-17、 IL-23水平均較陰性組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表1 健康者與CHB患者內(nèi)毒素、IL-10、TGF-β水平的比較（±s）

表1 健康者與CHB患者內(nèi)毒素、IL-10、TGF-β水平的比較（±s）

*與健康對(duì)照組比較，P＜0.01；△與內(nèi)毒素陰性組比較，P＜0.01

組別 內(nèi)毒素（pg/mL） IL-10（pg/mL） TGF-β（ng/mL）健康對(duì)照組（n=20） 36.91±6.66 60.22±9.73 46.03±2.00 CHB組（n=80） 41.03±6.69* 80.82±15.15* 66.13±8.87*內(nèi)毒素陰性組（n=35） 33.82±1.80* 71.54±8.75* 57.03±4.11*內(nèi)毒素陽(yáng)性組（n=45） 46.63±2.08*△ 88.03±15.22*△ 73.21±3.32*△H值 70.975 45.833 48.423 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 健康者與CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平的比較（±s） g/mL

表2 健康者與CHB患者IL-6、IL-17、IL-23水平的比較（±s） g/mL

*與健康對(duì)照組比較，P＜0.01；△與內(nèi)毒素陰性組比較，P＜0.01

組別 IL-6 IL-17 IL-23健康對(duì)照組（n=20） 71.69±2.40 70.22±2.68 3233.89±124.77 CHB組（n=80） 98.96±10.31* 82.20±9.73* 4002.85±412.28*內(nèi)毒素陰性組（n=35） 96.31±8.94* 72.87±4.39* 3558.88±93.25*內(nèi)毒素陽(yáng)性組（n=45） 101.03±10.92*△ 89.46±5.66*△ 4348.16±140.47*△H值 48.984 75.184 75.814 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

TGF-β不僅是Treg分泌的發(fā)揮抑制作用的主要細(xì)胞因子，體外研究還表明相對(duì)較低濃度的TGF-β主要促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化，而高濃度的TGF-β則主要促進(jìn)Treg的分化而抑制Th17細(xì)胞的分化[8]。IL-10是Treg分泌的另一主要細(xì)胞因子，它可調(diào)控IL-12的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)[3]。有研究表明，CHB患者血漿TGF-β、IL-10水平明顯升高，且與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[3]。本研究發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組比較，CHB患者TGF-β、IL-10水平亦均明顯升高，按內(nèi)毒素水平分組后，內(nèi)毒素陽(yáng)性組二者均明顯高于內(nèi)毒素陰性組，初步提示內(nèi)毒素可影響CHB患者TGF-β、IL-10的表達(dá)水平，二者可能參與了IETM的病變過(guò)程。

IL-6聯(lián)合TGF-β可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子ROR?t的表達(dá)和STA-T3通路的活化，從而可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化與增殖[9]。在關(guān)于糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-6不僅可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化與增值，且可以抑制Treg的分化，使Treg/Th17平衡向Th17方向偏移[10]。IL-23屬于IL-12家族，主要由mDC細(xì)胞分泌，是維持Th17細(xì)胞分化及功能發(fā)揮的細(xì)胞因子，IL-23缺乏使其存活及增殖受限[11]。IL-17是Th7細(xì)胞分泌的主要致炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌IL-6、IL-8、前列腺素E2，增強(qiáng)TNF-α的功能及細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，在炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[12]。IL-23/IL-17信號(hào)通路參與多種炎性疾病，有研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎的病變中亦有IL-23/IL-17信號(hào)通路的參與[13]。本發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組比較，CHB患者血漿IL-6、IL-23、IL-17水平均明顯升高，按內(nèi)毒素水平分組后，內(nèi)毒素陽(yáng)性組三者均明顯高于內(nèi)毒素陰性組，初步提示CHB患者IETM時(shí)IL-6、IL-23、IL-17的表達(dá)水平亦發(fā)生了變化，它們亦可能參與了IETM的病理生理過(guò)程。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者IETM時(shí)與Treg、Th17細(xì)胞密切相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)均升高，初步提示Treg、Th17細(xì)胞可能都參與了IETM的病變過(guò)程，下一步筆者將直接研究CHB患者IETM時(shí)外周血Treg、Th17細(xì)胞表達(dá)的變化，為通過(guò)降低內(nèi)毒素水平來(lái)改善CHB患者病情提供免疫治療方面的新視角。

[1]林格.核苷類抗乙肝病毒藥物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（26）：186-188.

[2]鐘大妮，李國(guó)堅(jiān)，吳繼周，等.廣西地區(qū)乙肝病毒基因分型與臨床表現(xiàn)及機(jī)體免疫功能關(guān)系的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10 （2）：1-3.

[3] Weaver C T，Hatton R D.Interplay between the Th17 and Treg cell lineages：a （co-） evolutionary perspective[J].Nat Rev Immunol，2009，9（12）：883-889.

[4] Xue-Song L，Cheng-Zhong L，Ying Z，et al.Changes of Treg and Th17 cells balance in the development of acute and chronic hepatitis B virus infection[J].BMC Gastroenterol，2012，12（1）：43.

[5] Su Z J，Yu X P，Guo R Y，et al.Changes in the balance between Treg and Th17 cells in patients with chronic hepatitis B[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2013，76（4）：437-444.

[6]趙龍鳳，李紅，王勤英，等.慢性肝炎患者內(nèi)毒素血癥與免疫功能的關(guān)系[J].中華傳染病雜志，2004，22（1）：45-47.

[7]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[J].中華臨床感染病雜志，2011，4（1）：1-13.

[8] Zhou L，Lopes J E，Chong M M，et al.TGF-β-induced Foxp3 inhibits Th17 cell differentiation by antagonizing RORγ function[J]. Nature，2008，453（7192）：236-240.

[9] Mangan P R，Harrington L E，O’Quinn D B，et al.Transforming growth factor-β induces development of the TH17 lineage[J].Nature，2006，441（7090）：231-234.

[10] Monika R S，Skrzypkowska M，Mymliwska J，et al.The serum IL-6 profile and Treg/Th17 peripheral cell populations in patients with type 1 diabetes[J].Mediators Inflamm，2013，20（13）：20 524.

[11] Volpe E，Servant N，Zollinger R，et al.A critical function for transforming growth factor-β，interleukin 23 and proinflammatory cytokines in driving and modulating human TH-17 responses[J]. Nature Immunol，2008，9（6）：650-657.

[12] Qu N，Xu M，Mizoguchi I，et al.Pivotal roles of T-Helper 17-Related cytokines，IL-17，IL-22，and IL-23，in inflammatory diseases[J].Clin Dev Immuno，2013，25（13）：968 549.

[13] Wang Q，Zhou J，Zhang B，et al.Hepatitis B virus induces IL-23 production in antigen presenting cells and causes liver damage via the IL-23/IL-17 axis[J].Plos Pathog，2013，9（6）：e1003410.

Change of Immunological Cytokines Expression in Chronic Hepatitis B Patients with Intestinal Endotoxemia/

WANG Jian-hong，LI Hong，ZHAO Long-feng.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：020-022

Objective：To investigate the change of the Treg/Th17-related cytokines in chronic hepatitis B patients with intestinal endotoxemia.Method：The serum levels of Treg/Th17-related cytokines and endotoxin（ET）in 80 patients with chronic hepatitis B（CHB） and 20 healthy controls（NC） were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. According to serum ET levels，all CHB patients were divided into two groups： ET positive and ET negative.Result：Compared to NC，the serum concentration of IL-10，TGF-β，IL-6，IL-17，IL-23 were all significantly increased in CHB patient groups（Z=5.265，6.859，6.894，5.028，6.877，all P＜0.01）.The levels of IL-10，TGF-β，IL-6，IL-17，IL-23 in ET positive group were significantly higher than ET negative group and NC（H=45.833，48.423，48.984，75.184，75.814，all P＜0.01）.Conclusion：The Treg/Th17-related cytokines were increased in CHB patients with intestinal endotoxemia.

Hepatitis B； Chronic； Intestinal endotoxemia； Cytokines

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.007

2014-01-16） （本文編輯：歐麗）

山西省高等學(xué)?？萍柬?xiàng)目（20121123）；省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金項(xiàng)目（3）；山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）項(xiàng)目（2013011054-3）

①山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001

②山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

李紅

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China