北平頂猴伯特絳蟲的分子鑒定及驅(qū)蟲效果試驗

王 蕓，袁飛舟，徐彩銀，黃東體，孔令富，吳志蕾，呂龍寶

（1.中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明650223；2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南 昆明650201）

伯特絳蟲主要感染猴和其他靈長類動物，近年來對人類感染也呈流行趨勢[1]，極大威脅著人類的生命健康安全。然而在靈長類動物中，通過常規(guī)的糞檢，蟲卵形態(tài)易被誤認為是糞渣，很難確定伯特絳蟲的感染情況。分子鑒定方法由于其特異性強的優(yōu)點在寄生蟲鑒定領(lǐng)域越來越受到重視,近年來進展迅速。本研究所2012年從元江引進了250只北平頂猴繁殖種群，在隔離檢疫及過度期飼養(yǎng)過程中，我們發(fā)現(xiàn)北平頂猴有疑似感染伯特絳蟲的癥狀，但常規(guī)的形態(tài)學方法難以確定感染。本研究的目的是建立分子生物學方法鑒定伯特絳蟲，并探討藥物治療伯特絳蟲的效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 主要分子生物學試劑，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司；Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒，購自BioTeke生物公司；DNA純化回收試劑盒，購自BioTeke生物公司；TECHNE TC-3000G型PCR儀和凝膠圖象分析系統(tǒng)，購自韓國UVITEC公司；TG16-WS臺式高速離心機，購自上海安亭科學儀器廠；DM1000型顯微鏡，購自德國LEICA公司；吸絳滅注射液，購自吉林省華牧動物保健品有限公司。內(nèi)外蟲螨凈，購自商丘市華康動物藥業(yè)有限公司。

1.2 蟲體樣品收集和鑒定 直接從動物糞便中觀察到并收集鏡檢寄生蟲的蟲體節(jié)片，保存于4℃?zhèn)溆?。另取?jié)片固定于70%酒精，顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.1 形態(tài)學鑒定 將發(fā)現(xiàn)的白色節(jié)片，固定保存。鏡檢發(fā)現(xiàn)節(jié)片周圍有大量的不規(guī)則卵圓形蟲卵，這和用飽和食鹽水漂浮法處理動物糞便，顯微鏡下檢查發(fā)現(xiàn)的未知蟲卵一致，僅僅通過形態(tài)鑒別暫時還不能確定其種屬，則通過下一步的分子生物學方法進行特異性鑒定。

1.2.2 分子生物學鑒定 將采集的蟲體樣品約50 mg剪碎,用DNA抽提試劑盒提取DNA，使用引物：BD1：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′，DB2（BD）：5′-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3′進行基因擴增。擴增條件為：94℃變性5min（94℃，30 s；51℃，30 s；72℃，1min），30個循環(huán)，72℃延伸10min，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收純化；純化片段連入pUM-T載體轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，搖菌后送往華大基因科技服務有限公司測序。測序結(jié)果錄入NCBI進行比對鑒定。

1.3 驅(qū)蟲 對檢出并鑒定為伯特絳蟲感染的北平頂猴進行驅(qū)蟲，采用吡喹酮注射液，1次劑量按每公斤體重5mg，分點進行肌肉注射。連用2日；兩周后采取新鮮糞便再次進行寄生蟲直接涂片檢測，對檢出仍有蟲卵的動物按照以上方法再進行驅(qū)蟲直至不能檢出伯特絳蟲蟲卵。所有感染伯特絳蟲的北平頂猴在治療后1年再次檢測伯特絳蟲感染率。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學鑒定 在動物糞便中發(fā)現(xiàn)的蟲卵和節(jié)片如圖1所示?？梢娤x卵為不規(guī)則的卵圓形，卵蓋稍厚（圖1A）。白色節(jié)片如圖所示（圖1B），節(jié)片長短不一，從3mm～20mm不等，節(jié)片放在玻片上滴加生理鹽水后，會不停的蠕動，變寬或拉長。

圖1 伯特絳蟲的形態(tài)學鑒定

2.2 分子鑒定

2.2.1 PCR擴增電泳圖片 以提取的總DNA為模板設(shè)計引物經(jīng)過PCR擴增其ITS基因片段，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖2可看出擴增出了大小將近500 bp的基因片段。其中左側(cè)的Marker為DL2 000。

圖2 絳蟲ITS基因電泳結(jié)果

2.2.2 ITS基因測序峰值結(jié)果 見圖3。

圖3 ITS基因測序峰值

2.2.3 菌液PCR 見圖4。

圖4 菌液PCR

2.2.4 ITS基因堿基序列：

CTTCTTCTAAGGTATCGGTCAATTGTGATCAA ATGTTGGTGTGAGTACCGATATCTGTGGTAATAGT AGTTAGTTAAGTAGTAAAGGAGGAGGAGGAGTAG TAGTAGTACGTCAAATCATACATTATTACCTACCT TCGGTGGGGTGCCTAGTCTGCCTAACACCTTGGTG GTGTGCCCGTGTATTTCTTGCTGTTGCTGCTGTTGC ATGAAATGCACCGGTCCATACCCGGGCGGTAGAG TAGTGCACTAGTAGTTGCCACTGCCACTCCTGTTA CCTTCTTTTATTGTGTACATTTTATTGTGCGGTACA TGGGGTAACGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGAGTGTATATGAGTGTGAGAGAAAAAAT ATGTGTGGGGGGCTCTATTGTGTGCGCTCTATAAA CACCCCCCCCCCCC

圖5 與黑猩猩伯特絳蟲屬DNA序列比對

圖6 與日本野生獼猴伯特絳蟲屬DNA序列比對

2.2.5 ITS基因在NCBI上的序列比對結(jié)果 對此基因片段進行測序并將所得序列在NCBI上進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列與黑猩猩上攜帶的伯特絳蟲屬相應區(qū)域DNA序列和日本野生獼猴上攜帶的伯特絳蟲屬相應區(qū)域DNA序列具有較高的相似度，分別為96%和92%，結(jié)合觀察到的動物表現(xiàn)感染伯特絳蟲的癥狀一致，說明北平頂猴感染的寄生蟲與黑猩猩以及日本野生獼猴感染的寄生蟲均為司氏伯特絳蟲屬（圖3）。

3 驅(qū)蟲效果

本研究一共檢測了250只北平頂猴，檢出82只感染伯特絳蟲。對檢出并鑒定為伯特絳蟲的北平頂猴用吡喹酮進行針對性驅(qū)蟲，第一次驅(qū)蟲后檢出仍然有45只（54.9%）有伯特絳蟲蟲卵，對檢出仍有伯特絳蟲的動物按照以上方法再次進行驅(qū)蟲后，有9只動物（20.0%）還有蟲卵。針對仍然檢出蟲卵的幾只動物按照以上方法再次進行驅(qū)蟲。第3次驅(qū)蟲后未檢出伯特絳蟲蟲卵。并于一年后再次對全群北平頂猴進行檢測，未再發(fā)現(xiàn)有伯特絳蟲。

4 討論

在胃腸道寄生蟲感染情況調(diào)查時，一般采用糞檢蟲卵的方法，由于缺乏對具體感染蟲種的了解，常常會對蟲卵做出錯誤鑒定，無法準確評估感染情況。我國可見賁昆龍[2]（1978）對靈長類動物攜帶寄生蟲種類進行整理，但這些研究年代已經(jīng)較為久遠，在對實驗動物要求不斷提高的背景下，其使用的指導性有待于進一步加強。與國內(nèi)相比，國外對靈長類動物胃腸道寄生蟲病的研究較為詳盡[3-7]。但各地物種情況與生長環(huán)境不同，國外的調(diào)查研究難以供現(xiàn)階段我國靈長類動物馴養(yǎng)管理人員借鑒。

2006年國內(nèi)首次報道司氏伯特絳蟲感染人類[8]，方法只是常規(guī)形態(tài)學方法，沒有涉及分子生物學的判定方法。此外，在2011年有報道患伯特絳蟲病的黑猩猩的診斷以及治療，也是使用常規(guī)形態(tài)學檢測[9]。

國外也有伯特絳蟲感染人的報道。2010年報道了一位女孩感染伯特絳蟲，其診斷方法是常規(guī)形態(tài)學鑒定[10]。在同年又有報道顯示，在阿拉伯務工回埃及的工人感染伯特絳蟲的報道[11]，以及在越南首次發(fā)現(xiàn)伯特絳蟲感染人的報道[12]，診斷方法同上。鑒于伯特絳蟲對人類自身安全的極大危害，而常規(guī)的形態(tài)鑒別方法可靠性低，迫切需要一種特異性高、更為可靠的鑒別方法。在2011年報道了用分子生物學方法對猴、靈長類和人伯特絳蟲病進行了判定和研究，并且比較了它們之間的進化關(guān)系[13]，這為建立一個有效的快速準確的診斷方法打下了堅實的理論基礎(chǔ)。

在本研究中，通過對250只新引進的北平頂猴進行胃腸道寄生蟲檢測，首先采用糞檢蟲卵的方法，檢出一種數(shù)量最多的卵圓形未知蟲卵，通過了兩輪檢測及內(nèi)外蟲螨凈進行驅(qū)蟲后，仍能檢出該蟲卵，后在檢出該蟲卵的動物糞便中發(fā)現(xiàn)未知蟲體節(jié)片并進行分子鑒定，基因序列分析，成功的將其鑒定為司氏伯特絳蟲。并對其采用吡喹酮注射液進行針對性驅(qū)蟲，取得了比較理想的效果。由于在過去的馴養(yǎng)繁殖過程中養(yǎng)殖場在定期驅(qū)蟲及平時的環(huán)境衛(wèi)生消毒方面做得比較好，未發(fā)現(xiàn)過該種蟲卵也未見相關(guān)的報道。本次研究及蟲種鑒定為云南各靈長類動物馴養(yǎng)場腸道寄生蟲檢測提供了檢測依據(jù)。

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