奶牛前三把奶中優(yōu)勢病原菌的分離與藥敏分析

楊樹鑫，杜 軍，朱嬌玲

（1.寧夏吳忠市利通區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，寧夏 吳忠751100；2.寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川750021）

奶牛乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常見病之一，該病根據(jù)病原微生物的傳播特點分為兩類：第一類是接觸傳染性病原微生物，包括鏈球菌、金黃色葡萄球菌和支原體，這些病原菌殖于乳腺并通過擠奶工或擠奶機傳播；第二類為環(huán)境性病原體，主要包括革蘭陰性菌、凝固酶陰性葡萄球菌、環(huán)境鏈球菌、酵母等，此類病原菌主要由于奶牛乳房容易沾有大量細菌，這些細菌極易進入乳導管，在此生長繁殖[1-2]。目前對乳腺炎的研究重點主要集中于對患病奶牛病原菌的藥敏分析、病理特點[3]、炎癥因子、血清型和毒力因子[4]等的方面，極少有對擠奶和實驗前棄掉的前3把奶中的病原菌進行規(guī)范化的研究，而奶牛前3把奶中含有大量的細菌種類，這些細菌嚴重影響著鮮奶的品質(zhì)、幼畜的健康成長以及患病奶牛中病原菌的檢測和研究。因此本實驗對正常產(chǎn)奶奶牛前3把乳樣進行病原菌的分離、鑒定及藥敏分析，為奶牛乳腺炎的預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)控菌株：鏈球菌ATCC32210、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922，均購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

隨機對吳忠市6個規(guī)模化奶牛場采集奶樣，采集正常奶牛前3把奶中乳樣95份，用無菌試管接取5mL，加蓋封緊，標明牛號、采樣日期，樣品采集后，置于冰盒中，于12 h內(nèi)送到實驗室，并立即處理和檢測。

營養(yǎng)肉湯，普通營養(yǎng)瓊脂，高鹽甘露醇培養(yǎng)基，伊紅美藍培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，馬丁瓊脂培養(yǎng)基等，購自杭州天和微生物試劑有限公司；葡萄球菌選擇性瓊脂110，三糖鐵培養(yǎng)基，細菌微量生化鑒定管等，購自青島高科園海博生物技術有限公司。

藥敏紙片：頭孢唑啉（CZ）、阿莫西林（AMX）、卡那霉素（K）、環(huán)丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、四環(huán)素（TE）、青霉素（P）、阿米卡星（AN）、頭孢西?。‵OX）、慶大霉素（GM）、多西環(huán)素（DO）、磺胺甲硝唑/甲氧芐啶（SXT），均購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 平板菌落計數(shù)法 隨機從每個奶牛場抽取3個樣品，每個樣品取50μL乳樣于5mL肉湯培養(yǎng)基中37℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)18 h，然后將菌液依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，終體積為1mL，最后分別涂布于營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，每個稀釋梯度重復3次，隔天觀察菌落數(shù)目，選擇長有50～200個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量。計算公式如下：

每毫升樣品中菌落形成單位數(shù)（CFU）=同一稀釋度3次重復的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5。

1.2.2 病原菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 將采集的乳樣充分搖勻后，分別用接種環(huán)接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)24 h。然后于營養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍平板、麥康凱平板、甘露醇高鹽平板劃線37℃，24～48 h培養(yǎng)后，觀察細菌的培養(yǎng)特性。根據(jù)菌落的形態(tài)特征，將不同菌落的菌分別接種于肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，劃線于營養(yǎng)瓊脂平板上通過革藍染色區(qū)分出革藍陽性菌和革藍陰性菌，以及球菌和腸桿菌，通過觸媒試驗區(qū)分出葡萄球菌和鏈球菌，從而結(jié)合不同細菌在鑒別培養(yǎng)基中的生長情況初步判定細菌的類屬[5]。

1.2.3 病原菌的鑒定試驗

1.2.3.1 甘露醇發(fā)酵產(chǎn)酸試驗 將已分離純化好的葡萄球菌在葡萄球菌屬選擇培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h后，用0.04%溴麝香草酚藍指示劑滴加于菌落，如變?yōu)辄S色，即為陽性。

1.2.3.2 明膠液化試驗 將已分離純化好的葡萄球菌在葡萄球菌屬選擇培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24 h后，將硫酸銨飽和水溶液滴加于菌落，10min后，如圍繞菌落出現(xiàn)一清晰帶，即為陽性。

1.2.3.3 生化管鑒定試驗 將已分離并純化培養(yǎng)的各種細菌劃線于營養(yǎng)培養(yǎng)基上，18～24 h，37℃培養(yǎng)。挑取單個菌落于微量生化管內(nèi)，培養(yǎng)24～48 h，觀察生化管內(nèi)顏色的變化，并同時以鏈球菌ATCC32210、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922為質(zhì)控菌株。

1.2.4 藥敏試驗 將分離鑒定的革蘭陰性桿菌和葡萄球菌直接接種于普通肉湯培養(yǎng)基，鏈球菌接種于血清肉湯培養(yǎng)基，37℃，24 h培養(yǎng)。用培養(yǎng)基稀釋至0.5麥氏比濁度，將棉簽浸泡在菌液中10min后均勻涂布在培養(yǎng)基上，溫室下放置5min，使表面的菌液稍干燥，然后用無菌鑷子將13種藥敏紙片分別貼到平板上，在培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，判定試驗菌株對各種抗生素的敏感度。每株試驗3次，取其抑菌圈值的平均值[6]。

2 結(jié)果

2.1 牛奶中細菌總數(shù) 采用平板菌落計數(shù)法對6個奶牛場中前3把奶中的細菌總數(shù)進行測定，結(jié)果顯示，牛場1、牛場2、牛場3、牛場4、牛場5和牛場6中細菌總數(shù)分別達到2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、2×108CFU/mL、4×108CFU/mL、3.5×108CFU/mL和2.5×109CFU/mL。通過以上數(shù)據(jù)可知，這6個奶牛場中正常產(chǎn)奶牛前3把奶中的細菌數(shù)明顯高于鮮奶細菌總數(shù)（低于2×105CFU/mL）質(zhì)控指標[7]。

2.2 病原菌培養(yǎng)及形態(tài)特性

2.2.1 大腸埃希菌 在營養(yǎng)瓊脂平板上為白色大菌落，在麥康凱平板上形成中等大小、表面光滑、濕潤的紅色菌落，在伊紅美藍平皿上為黑色帶有金屬光澤菌落，在三糖鐵培養(yǎng)基上斜面和底部均為黃色，革蘭染色油鏡下為短桿狀單個或成對存在的革蘭陰性菌，則可初步判斷為大腸埃希菌[8]。

2.2.2 葡萄球菌 在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，在高鹽甘露醇培養(yǎng)基上凝固酶陽性菌形成金黃色、光滑、隆起的中等大小菌落，且通過甘露醇發(fā)酵產(chǎn)酸試驗、明膠液化試驗、凝固酶試驗和觸媒試驗均為陽性，則可初步確定為金黃色葡萄球菌。凝固酶陰性菌在高鹽甘露醇培養(yǎng)基上呈紅色、光滑、隆起的中等大小菌落，甘露醇發(fā)酵產(chǎn)酸試驗、明膠液化試驗和凝固酶試驗為陰性，觸媒試驗為陽性[9]。

2.2.3 鏈球菌 在營養(yǎng)瓊脂和麥康凱平板上生長不良，在馬丁瓊脂平板上生長良好，菌落為露滴狀、圓形、隆起、透明、表面光滑、濕潤的小菌落，凝固酶試驗和觸酶試驗均為陰性，革蘭染色后在油鏡下成雙或短鏈狀、長鏈狀排列則可初步判斷為鏈球菌[10]。

2.3 病原菌的生化特性 主要病原菌的生化特性結(jié)果見表1。結(jié)合不同菌株的生化特性、培養(yǎng)特性及形態(tài)特征，判定菌株的類型為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌。

表1 主要病原菌的生化鑒定結(jié)果

2.4 細菌的分離培養(yǎng)與鑒定 95份乳樣中有78份乳樣檢測出有細菌生長，共分離得到4種優(yōu)勢病原菌共102株，其中62株大腸埃希菌，檢出率為65.3%；33株金黃色葡萄球菌，檢出率為37.3%；鏈球菌7株，檢出率為6.9%。結(jié)果表明，這些分離菌廣泛存在于該地區(qū)奶牛場的正常牛群中。

2.5 藥敏試驗結(jié)果 通過K-B法測定分離菌株的耐藥情況顯示，所分離的菌株對臨床常用的抗菌藥存在一定程度的敏感性，且多數(shù)菌株僅對青霉素存在嚴重的耐藥性。耐藥率從高到低依次為：青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、磺胺甲氧嘧啶、卡那霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、頭孢西丁、多西環(huán)素、阿莫西林、頭孢唑啉（表2）。

結(jié)果判斷，依據(jù)《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準（第十七版信息增刊）》進行[11]。

6個牛場中臨床分離株的耐抗生素情況如圖1和表2所示，102株分離株對臨床常用抗生素多表現(xiàn)為耐1-2種抗生素，且對環(huán)丙沙星和頭孢唑啉存在一定程度的敏感性，其敏感率達到96.7%，但各菌株均對青霉素存在很大程度的耐藥性，其耐藥率達到了100%。

表2 抗生素對臨床分離菌株的敏感性

3 討論

奶牛乳腺炎嚴重危害著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，主要表現(xiàn)在產(chǎn)乳量，廢棄牛奶，治療成本以及勞動力等方面。近年來，隨著奶牛乳腺炎發(fā)病率的逐年增高，廢棄牛奶的量也越來越大，其主要原因是此類牛奶不但影響著奶牛自身的健康同時，也影響著鮮奶的品質(zhì)以及幼畜的健康成長。而通常在擠奶過程中，由于前3把奶中含有的細菌數(shù)比較高，且奶牛喜歡臥地反芻和休息，接觸地面（特別是當?shù)孛孑^污濁時）的奶牛乳房容易沾有大量細菌，而從乳頭開始到乳房內(nèi)部有一個乳導管，細菌容易進入乳導管，并在此生長繁殖。因此首先要棄掉前3把奶，然后用一定比例的消毒水噴灑乳頭，再用高溫消毒過的毛巾，一對一的擦干凈奶牛的乳房開始擠奶。并且對棄奶要用專門容器收集，這樣可以避免廢棄在地面上的牛奶污染環(huán)境，導致病原微生物傳播感染；也能更容易在專門的容器里觀察牛奶中是否有凝塊、絮狀或水樣奶，以及時發(fā)現(xiàn)臨床乳房炎，做到及時治療并防止患乳房炎的牛奶混入正常奶中。

圖1 不同細菌耐受抗生素種類分布

本試驗從6個規(guī)模化奶牛場中，隨機采集正常產(chǎn)奶奶牛前3把奶樣95份，對此95份乳樣進行細菌總數(shù)的測定，發(fā)現(xiàn)前3把奶中細菌的總數(shù)明顯高于鮮奶中細菌的總數(shù)，這提示著我們?nèi)绻缓侠淼目刂拼祟惒≡纳L和繁殖，將會增加奶牛患各種疾病的概率。通過對病原菌的分離鑒定中可以了解到，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌為前3把奶中的優(yōu)勢病原菌，這些病原菌通常是引起奶?；既橄傺缀推渌膊〉闹匾虏【鶾13]。所分離的102株病原菌藥敏試驗結(jié)果表明，環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、阿莫西林、多西環(huán)素、頭孢西丁、阿米卡星等藥物對這6個規(guī)模化奶牛場中前3把奶中優(yōu)勢病原菌具有高度的敏感性。在本試驗結(jié)果中，約100%的分離株對青霉素高度耐藥，這與6個奶牛場常用青霉素作為臨床治療藥物的結(jié)果相一致，且與張珠明對此地區(qū)的研究結(jié)果相似[14]。因此，可根據(jù)本試驗的結(jié)果選擇環(huán)丙沙星等抗生素類藥物用于治療該地區(qū)奶牛乳腺炎等疾病。同時通過此次試驗可以發(fā)現(xiàn)，雖然目前對引發(fā)奶牛乳腺炎的病原菌的研究較多，但為了更好的預防和控制奶牛乳腺炎的產(chǎn)生，需盡早對未患病的正常牛群中病原菌的分布特點、病原菌的種類及耐藥程度進行研究，從而在細菌未感染到奶牛乳房內(nèi)而將其殺死，降低奶牛乳房炎等疾病的發(fā)生。

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