金黃色葡萄球菌Fnb A配體結(jié)合區(qū)基因核酸疫苗的構(gòu)建與免疫試驗(yàn)

尹榮蘭 ，尹榮煥，白文林，李 琳，任清丹，許志林，李 衛(wèi)，許 堯，楊正濤，張乃生

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；3.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062）

奶牛乳腺炎是由多種因素引起的嚴(yán)重影響奶牛業(yè)發(fā)展的重要疾病，奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌疫苗是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，主要因?yàn)椋谝l(fā)奶牛乳腺炎的病原菌中，金黃色葡萄球菌存在最為廣泛。另外，目前對(duì)金黃色葡萄球菌的基因組結(jié)構(gòu)以及其主要表面蛋白和免疫反應(yīng)研究較為清楚。其中FnbP 就是重要的粘附素之一，大多數(shù)菌株表達(dá)兩個(gè)相似的FnbP 分子，即FnbA和FnbB，由兩個(gè)相近的基因編碼，目前分離到的大多數(shù)金黃色葡萄球菌都能夠與細(xì)胞外基質(zhì)上的纖維連結(jié)素特異性地結(jié)合[1]。FnbA分子結(jié)構(gòu)中的D區(qū)被稱作配體結(jié)合區(qū)，是主要的免疫優(yōu)勢(shì)表位，在研制金黃色葡萄球菌核酸疫苗中占有重要的作用。從30 多位有金黃色葡萄球菌感染病史病人的血清中分離得到IgG，證實(shí)這些IgG 片段均能與FnbP 特異性結(jié)合，采用FnbP 的重組缺失片段對(duì)抗原表位進(jìn)行定位后發(fā)現(xiàn)，不同的IgG 均優(yōu)先與配體結(jié)合區(qū)結(jié)合[2]。DNA疫苗是近年來出現(xiàn)的一種新型疫苗形式，能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，在預(yù)防和治療人和動(dòng)物的疾病中發(fā)揮重要的作用，因此，奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌DNA疫苗也成為當(dāng)今人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)[3]。

本試驗(yàn)基于基因疫苗的發(fā)展趨勢(shì)，擬以引起奶牛乳腺炎的主要病原微生物金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，以其表面的特異性粘附素FnbA配體結(jié)合區(qū)基因（即FnbA的D1-D3 區(qū)，命名為pFnbA）為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行奶牛乳腺炎基因疫苗的研制，設(shè)計(jì)引物對(duì)pFnbA基因進(jìn)行克隆，以pVAX1 為真核表達(dá)載體，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，在細(xì)胞體外模型進(jìn)行初步表達(dá)檢測(cè)后，將其作為核酸疫苗開展了動(dòng)物免疫試驗(yàn)研究，探討了核酸疫苗作為奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌候選疫苗可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體 金黃色葡萄菌菌株由吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院免疫實(shí)驗(yàn)室分離；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109 和載體pVAX1 由該室保存。pMD18-T 載體，購自TaKaRa 公司。

1.2 工具酶和試劑 Ex Taq DNA聚合酶，dNTP Mix，BamHI，EcoRI 等限制性內(nèi)切酶，購自TaKaRa 公司；細(xì)菌基因組DNA回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（lipofectamineTMReagent），購自Invitrogen 公司；兔抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院金寧一研究員惠贈(zèng)（購自Meridian Life Science，USA）；Mouse Th1/Th2 ELISA（Ready-SET-Go!），購自eBioscience 公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，購自Sigma 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c 雌性小鼠，6～8 周齡，購自長(zhǎng)春市生物制品研究所。

1.4 pFnbA基因的克隆 根據(jù)GenBank 收錄凝集因子pFnbA基因（Accession No.J04151）序列，利用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)特異性引物：

上游引物：5′-CCGGATCCGCCACCATGggcatcagaacaaaagacaact -3′；

下游引物：5′-CCGAATTCTTTActcagaggactcagt gtatcc -3′。

上下游引物5′端分別引入BamHI 酶切位點(diǎn)和EcoRI 酶切位點(diǎn)（劃線部分），其中上游引物引入Kozak 序列，見陰影部分。

金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書操作。PCR 反應(yīng)參數(shù)如下：94 ℃預(yù)變性5 min 后，94 ℃，60 s；50 ℃，45 s；72 ℃，60 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增的pFnbA基因經(jīng)回收后連入pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)JM109 中，提取質(zhì)粒初步鑒定后，進(jìn)行測(cè)序。

1.5 真核表達(dá)質(zhì)粒pV-pFnbA的構(gòu)建 將測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒pMD18-pFnbA和pVAX1 分別用BamHI 和EcoRI 雙酶切，回收目的片段后，以T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞JM109 中，命名為pV-pFnbA，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

1.6 體外表達(dá)檢測(cè) 經(jīng)過PEG8000 純化后的陽性重組子pV-pFnbA質(zhì)粒，用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染長(zhǎng)有60%～70%單層的HeLa 細(xì)胞玻片上，長(zhǎng)到72 h 后，100 %冷丙酮固定30 min，用PBS洗滌3次后，用含有10% BSA的PBS封閉2 h，用PBS洗滌3 次后，加入一抗（兔抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體），37 ℃作用2 h，用PBS洗滌3 次；接著加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（含0.105 % 伊文斯藍(lán)），37 ℃作用2 h 后，用PBS洗滌，于熒光顯微鏡下觀察和拍照，同時(shí)設(shè)pVAX1 空質(zhì)粒作陰性對(duì)照。

1.7 動(dòng)物分組及免疫 將30 只6～8 周齡雌性BALB/ c 小鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只，分別按100 μg/只腿部肌肉注射PBS對(duì)照組、空質(zhì)粒pVAX1 及pV-pFnbA疫苗組，免疫3 次，間隔14 d，每隔10 d 采血一次檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.8 ELISA抗體檢測(cè) 以大腸桿菌表達(dá)和純化的pFnbA重組蛋白作包被抗原，運(yùn)用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中抗體水平變化。

1.9 Th1/Th2 類細(xì)胞因子水平檢測(cè) 免疫小鼠眼眶采血后分離血清，用Mouse Th1/ Th2 ELISA試劑盒測(cè)定各細(xì)胞因子濃度。

1.10 T 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 小鼠3 免后10 d 處死取脾，測(cè)定T 細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 活性基因pFnbA的克隆與獲得 測(cè)序結(jié)果表明，pFnbA基因全長(zhǎng)370 bp，對(duì)pFnbA基因通過GenBank 的Blastn 進(jìn)行序列比較分析，表明pFnbA基因DNA序列非常保守，是構(gòu)建金黃色葡萄球菌疫苗和進(jìn)行分子生物學(xué)診斷的理想靶序列。

2.2 pV-pFnbA的構(gòu)建與鑒定 質(zhì)粒pV-pFnbA經(jīng)BamHI 和EcoRI 雙酶切，得到約3 kb 的pVAX1載體片段和400 bp 左右的目的基因片段（圖1），表明成功構(gòu)建出含有pFnbA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pV-pFnbA。

圖1 pV-pFnbA質(zhì)粒的酶切鑒定

圖2 核酸疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的熒光照片

2.3 目的基因的體外表達(dá)檢測(cè) 利用間接免疫熒光法對(duì)外源基因進(jìn)行檢測(cè)，將處理好的細(xì)胞玻片置于熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pV-pFnbA的細(xì)胞玻片上有明顯的黃綠色熒光（圖2A），而對(duì)照細(xì)胞則無特異性熒光（圖2B），說明真核表達(dá)質(zhì)粒能在體外進(jìn)行表達(dá)，并具有抗原性。

2.4 ELISA抗體水平 小鼠分組免疫后，采用間接ELISA方法測(cè)定小鼠血清中特異性抗體水平的變化，結(jié)果如表1 和圖3 所示。由表1 和圖3 可以看出，所構(gòu)建的核酸疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，且抗體水平高于pVAX1 對(duì)照組及PBS組(P＜0.01)，在第10 d 后采血時(shí)免疫組的抗體水平呈快速升高。

表1 免疫小鼠ELISA抗體檢測(cè)

圖3 血清中ELISA抗體檢測(cè)

2.5 Th1/Th2類細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 利用（Mouse Th1/Th2 ELISAReady-SET-Go!kit，eBioscience）鼠類細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒對(duì)各免疫組小鼠的細(xì)胞因子濃度（包括Th1 類細(xì)胞因子IL2、IFN-γ和Th2 類細(xì)胞因子IL-4、IL-10）進(jìn)行了測(cè)定，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)直線回歸方程，計(jì)算樣品Th1/Th2 類細(xì)胞因子含量，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 可以看出，免疫組細(xì)胞因子含量均升高（P＜0.05）。同時(shí)，也說明DNA疫苗對(duì)無論對(duì)Th1 類細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ）還是Th2 類細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）的分泌都有明顯的刺激作用，但主要以Th1 類細(xì)胞因子為主。

圖4 細(xì)胞因子含量檢測(cè)

2.6 T 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 3 免后10 d 捕殺小鼠取脾臟制備T 淋巴細(xì)胞懸液，分別用制備的重組蛋白和刀豆蛋白A（ConA）進(jìn)行刺激，檢測(cè)淋巴細(xì)胞特異性與非特異性刺激指數(shù)，結(jié)果如圖5 所示。由結(jié)果可以看出，免疫組與對(duì)照組相比，其特異性與非特異性刺激指數(shù)均有明顯提高且相差顯著（P＜0.05）。表明DNA疫苗能刺激T 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)以細(xì)胞免疫為主的免疫應(yīng)答。

圖5 脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

3 討論

奶牛乳腺炎是由多種因素引起的嚴(yán)重影響奶牛業(yè)發(fā)展的重要疾病，由金黃色葡萄球菌引發(fā)的奶牛乳腺炎在世界范圍內(nèi)都造成了巨大的損失，研制新型疫苗是最終預(yù)防和控制奶牛乳腺炎發(fā)生的必然趨勢(shì)[4]。

Fnbp是金黃色葡萄球菌粘附于寄主細(xì)胞的最主要的黏附因子之一，能夠介導(dǎo)金黃色葡萄球菌結(jié)合于細(xì)胞表面的纖維粘連素（Fn），使細(xì)菌粘附于寄主細(xì)胞表面，促進(jìn)細(xì)菌對(duì)寄主組織的入侵[5]。Aart Lammers 等的研究表明，缺乏纖連素結(jié)合蛋白表達(dá)的金黃色葡萄球菌菌株不能凝集細(xì)胞，并且粘附、侵入牛乳腺細(xì)胞的能力顯著降低[6]。通過對(duì)奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌FnbA和FnbB基因進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)95%以上金黃色葡萄球菌存在黏附素基因FnbA，而FnbB基因僅10%，證實(shí)了FnbA在金黃色葡萄球菌侵襲奶牛乳腺的過程中起到了重要作用，其中由3個(gè)重復(fù)的D區(qū)（D1-D3）形成的結(jié)構(gòu)域是主要的配基結(jié)合區(qū)域，研究表明用該區(qū)免疫后產(chǎn)生的抗體能有效阻斷配體結(jié)合區(qū)與Fn 的結(jié)合[7]。Sun等使用FnbA配體結(jié)合區(qū)的短片段（FnbA的D1-D3區(qū)）免疫后證實(shí)，由此產(chǎn)生的抗體能有效阻斷配體結(jié)合區(qū)與Fn 的結(jié)合。因此，F(xiàn)nbAD1-D3 對(duì)于金黃色葡萄球菌粘附并侵入牛乳腺細(xì)胞是必須的和重要的[2]。Lulzim Shkreta 等報(bào)道在感染金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎中，這兩種序列是FnbA的D121-34；D320-33 和ClfA的氨基酸221-550 序列，用構(gòu)建的DNA疫苗免疫懷孕7個(gè)月的奶牛，結(jié)果表明，免疫的牛產(chǎn)生了抗D1、D3 和ClfA的功能性抗體，表明pFnbA和ClfA的蛋白免疫牛有比較好的免疫激發(fā)條件[8]。

本試驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，通過克隆其主要抗原基因pFnbA，構(gòu)建了候選重組核酸疫苗質(zhì)粒，小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，所構(gòu)建核酸疫苗重組體能刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，但主要是細(xì)胞免疫，為進(jìn)一步探討金黃色葡萄球菌核酸疫苗的應(yīng)用提供了原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為研制奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌的新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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