IGF-1 通過(guò)PI3K/Akt 通路抑制MPP+ 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究

黃露麒，王萬(wàn)銘

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病，其神經(jīng)病理變化主要以中腦黑質(zhì)致密帶多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的丟失為主要特征。目前研究認(rèn)為，DA 能神經(jīng)元的丟失可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。IGF-1 是由70 個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽物質(zhì)，是一類促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、具有胰島素樣代謝效應(yīng)的因子，可調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖，并被認(rèn)為具有抑制凋亡的作用，是一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑［1］。但是，IGF-1 對(duì)于MPP+誘導(dǎo)處理的PC12 細(xì)胞是否有保護(hù)作用，這一保護(hù)作用是通過(guò)那些信號(hào)通路尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MPP+處理PC12 細(xì)胞，制備PD 細(xì)胞模型，研究IGF-1 對(duì)MPP+所致PC12 細(xì)胞凋亡的抑制作用及其潛在的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 IGF-1 購(gòu)自以色列Prospec公司，MPP+、MTT、AKT 以及P-AKT 抗體、丫啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)染料均購(gòu)自sigma 公司，DMEM/F12 培養(yǎng)基以及馬血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，胎牛血清購(gòu)自北京四季青公司，BCA 試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，ECL 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和處理 未分化的PC12 細(xì)胞株(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物所)以含2.5%胎牛血清，15%馬血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，選擇指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分別接種于96 孔板(密度3×104個(gè)/ml)和24 孔板(密度2×105個(gè)/ml)用于細(xì)胞狀態(tài)的檢查以及提取蛋白。細(xì)胞處理分組如下:空白對(duì)照組;IGF-1 組:100 nmol/L 的IGF-1 處理4 h;MPP+組:給予250 μmol/L 的MPP+處理4 h;IGF-1+MPP+組:250 μmol/L 的MPP+與濃度為100 nmol/L 的IGF-1 共同處理4 h;MPP++IGF-1+LY294002 組:預(yù)先給予PI3K 抑制劑LY294002 處理1 h 以后再給予MPP++IGF-1 處理。之后檢測(cè)通路活性以及細(xì)胞狀態(tài)。

1.3 MTT 實(shí)驗(yàn)方法 調(diào)節(jié)PC12 細(xì)胞密度至4×104/孔(100 μl/孔)接種于96 孔板中，置37 ℃含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。藥物處理組每組設(shè)六復(fù)孔，每孔加5 mg/ml MTT10 μl，37 ℃孵育4 h后，每孔加150 μl DMSO 使MTT 被還原而成的甲臢溶解，用平板搖床搖勻，用酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)570 nm、參考波長(zhǎng)540 nm 處檢測(cè)每孔的光密度。各重復(fù)孔的OD 值取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A570 值-空白對(duì)照組A570 值)/(對(duì)照組A570 值-空白對(duì)照組A570 值)×100%。

1.4 AO-EB 實(shí)驗(yàn)方法 將培養(yǎng)的PC12 細(xì)胞均勻種在24 孔板中，處理24 h 后提取細(xì)胞，以PBS洗兩次，以多聚甲醛固定10 min，再PBS 洗，去上清。加入100 μl PBS，輕輕懸起細(xì)胞充分混勻，將AO-EB 兩種染料等體積混合，加入細(xì)胞懸液中，使終濃度為100 μg/ml，靜置2 min 后滴片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot 實(shí)驗(yàn)方法 按AO-EB 實(shí)驗(yàn)時(shí)的分組方式處理細(xì)胞，每組設(shè)3 復(fù)孔，處理4 h 以后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白(20 μg)進(jìn)行10% 的SDSPAGE，100 V 恒壓電泳1 h，250 mmA 恒流轉(zhuǎn)膜(硝酸纖維素膜)1 h 后用含5%脫脂奶粉的TBST 封膜30 min，一抗孵育過(guò)夜，以TBST 洗3 次每次5 min，加二抗孵育1 h，再用TBST 洗3 次，在NC 膜上均勻涂布ECL，孵育1 min 后在暗盒中覆蓋X 光膠片曝光。膠片經(jīng)掃描、編輯后輸出。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Duncan 檢驗(yàn)。P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1 抑制MPP+對(duì)PC12 細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡作用 MTT 的結(jié)果顯示，MPP+(250 μmol/L)處理24 h 后，MPP+的毒性作用使得細(xì)胞存活率降至43.1%，與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)給予100 nmol/L 的IGF-1 處理以后，細(xì)胞存活率為82.85%，顯著抑制了由MPP+誘導(dǎo)的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。加入PI3K 抑制劑LY294002 后，阻斷了IGF-1 對(duì)PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用，細(xì)胞存活率為56.26%，較IGF-1+MPP+組下降(見(jiàn)圖1)。

2.2 AO-EB 染色檢測(cè)IGF-1 對(duì)MPP+所致PC12 細(xì)胞凋亡的抑制作用 與對(duì)照組相比，MPP+處理組凋亡細(xì)胞明顯增多，表現(xiàn)為細(xì)胞被染成橘紅色，細(xì)胞核固縮，致密深染，核分葉現(xiàn)象多見(jiàn)，并有典型凋亡小體的形成。正常組細(xì)胞核染色呈圓形或橢圓形，形態(tài)良好呈綠色。MPP++IGF-1 組的橘紅色凋亡細(xì)胞明顯減少，正常形態(tài)綠色細(xì)胞明顯增多。加入PI3K 抑制劑LY294002 后，細(xì)胞凋亡較IGF-1+MPP+組增加(見(jiàn)圖2)。

2.3 MPP+致PC12 細(xì)胞損傷模型中IGF-1 促進(jìn)AKT 的磷酸化 正常對(duì)照組p-Akt 處于較低水平，MPP+(250 μmol/L)處理后，p-Akt 的表達(dá)增加，IGF-1和MPP+共同處理PC12 細(xì)胞4 h 后，p-Akt 表達(dá)明顯增高，且高于MPP+處理組，而LY294002+IGF-1+MPP+共同處理組p-Akt 表達(dá)增高不明顯(見(jiàn)圖3)。

圖1 IGF-1 抑制MPP+對(duì)PC12 細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡作用

圖2 AO-EB 染色檢測(cè)IGF-1 對(duì)MPP+所致PC12 細(xì)胞凋亡的抑制作用

圖3 IGF-1 促進(jìn)MPP+致PC12 細(xì)胞損傷模型中的Akt 的磷酸化

3 討論

帕金森病是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病，目前病因尚不完全明確。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)被認(rèn)為是環(huán)境毒素之一。MPP+是MPTP 通過(guò)MAO-B 的代謝產(chǎn)物，其細(xì)胞毒性作用可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)以MPP+誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞構(gòu)建帕金森病細(xì)胞模型，并加入IGF-1 予以干預(yù)。

IGF-1 是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有IGF-1 受體的大量表達(dá)，如皮質(zhì)、海馬、紋狀體、丘腦等部位［2］。IGF 能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，抑制其凋亡，參與神經(jīng)元的保護(hù)，在神經(jīng)系統(tǒng)中有著重要的營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用［3］。IGF-1 在神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)、分化、修復(fù)和再生中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入IGF-1 后，MPP+導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡顯著減少。那么在其對(duì)MPP+誘導(dǎo)的毒性作用所起到的防護(hù)機(jī)制中，有哪些可能的信號(hào)通路發(fā)揮了作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肌酸肌醇3 激酶(PI3K)/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、以及部分重要基因的表達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)重要的促細(xì)胞存活途徑［4］。PI3K 通路可以被IGF-1R 誘導(dǎo)激活，使其下游蛋白激酶Akt 發(fā)生磷酸化。Akt 也稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。磷酸化的Akt 可通過(guò)各種途徑調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的活化狀態(tài)，從而起到抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。Akt 的羧基末端的磷酸化是Akt 激活的必要條件，Akt 激活后可抑制或者促進(jìn)下游靶蛋白的活性，產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生存的效應(yīng)［5］。PKB/Akt 在促進(jìn)各種類型細(xì)胞生存中起中心環(huán)節(jié)作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)以及促紅細(xì)胞生成素(erythropoiet in，EPO)等均可通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)多個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞系的存活，其刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與生存的反應(yīng)中均有PKB/Akt 的高表達(dá)和活化［6］。PKB/Akt 是體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同中繼站，尤其是PKB/Akt 是PI-3K 最主要的靶酶，與多種細(xì)胞活動(dòng)、物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，特別是抑制細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。

因此，我們認(rèn)為PI3K-Akt 通路可能參與了IGF-1 的保護(hù)機(jī)制。通過(guò)蛋白免疫印記法發(fā)現(xiàn):以MPP+處理細(xì)胞后，p-Akt 的表達(dá)開(kāi)始增加，以IGF-1 和MPP+共同處理PC12 細(xì)胞后，在細(xì)胞生存率增高的同時(shí)，p-Akt 表達(dá)明顯高于MPP+處理組，凋亡細(xì)胞明顯減少。而加入抑制劑LY294002 處理后，IGF-1+MPP+共同處理組p-Akt 表達(dá)增高不明顯，凋亡細(xì)胞較IGF-1+MPP+處理組增多。因此，我們推測(cè)LY294002 通過(guò)抑制Akt 的磷酸化，使Akt 的活性被抑制，從而對(duì)抗了IGF-1 的保護(hù)作用。

近年來(lái)有研究證實(shí)，PI3K/Akt 通路與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，其可能涉及以下幾種機(jī)制:(1)促使凋亡相關(guān)因子磷酸化，抑制其活性，催化BDA 和caspase-3、caspase-9 磷酸化使之失活，抑制caspase促細(xì)胞凋亡的作用［7］;(2)抑制糖原合成激酶-3(GSK-3)活性。導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白β-catenin 降解及細(xì)胞粘附受抑制，加速細(xì)胞凋亡［8］;(3)防止線粒體釋放凋亡因子，抑制其釋放細(xì)胞色素C 及凋亡誘導(dǎo)因子AIF、參加執(zhí)行細(xì)胞凋亡過(guò)程［9］;(4)抑制促凋亡基因表達(dá)、Akt 的生存因子可以依賴或不依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)而達(dá)到抗凋亡的作用;(5)調(diào)節(jié)Bcl-2 家族成員活化［10］。同時(shí)，Akt 還可活化CaM 依賴蛋白激酶信號(hào)途徑，促進(jìn)細(xì)胞生存。

綜上所述，IGF-1 能夠抑制MPP+誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡，其保護(hù)機(jī)制可能與PI3K-Akt 通路相關(guān)，這可能為帕金森病治療藥物的研究提供進(jìn)一步的依據(jù)。

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