克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及應(yīng)用

趙貴明，劉 洋，陳 穎，楊海榮，趙勇勝，王 娉

克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及應(yīng)用

趙貴明，劉 洋，陳 穎*，楊海榮，趙勇勝，王 娉

（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123）

應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)建立了克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)，用于該菌屬內(nèi)種和亞種的高通量鑒定及菌株分型。在優(yōu)化培養(yǎng)條件、樣品處理方法及確定MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)指紋圖譜采集參數(shù)的基礎(chǔ)上，將采集的8 種參考菌株蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)Biotyper軟件構(gòu)建克羅諾桿菌的MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)，再用相近腸桿菌及該屬分離株驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明：應(yīng)用建立的克羅諾桿菌的MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)135 株克羅諾桿菌分離株進(jìn)行分析，鑒定分值均不小于2.0，達(dá)到了種水平鑒定要求，通過(guò)聚類(lèi)分析，可進(jìn)一步分型。構(gòu)建的MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)為克羅諾桿菌高通量鑒定與分型提供了一種新的手段。

克羅諾桿菌；MALDI-TOF-MS；數(shù)據(jù)庫(kù)；鑒定；分型

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）原名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）[1]，是一種革蘭氏陰性食源性條件致病菌[2]，廣泛存在于人和動(dòng)物腸道、土壤、水及日常食品中[3]，極易污染嬰幼兒乳粉，引起早產(chǎn)兒、新生兒腦膜炎、致死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥等疾病[4-5]。鑒于該種菌表現(xiàn)出的生物多樣性，2008年Iversen等[6]根據(jù)最新實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議將阪崎腸桿菌重新劃分為一個(gè)新屬，即克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.），屬下包括1 個(gè)基因種（C. genomospecies）、5 個(gè)新種，分別為阪崎克羅諾桿 菌（C. sakazakii）、丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌（C. malonaticus）、蘇黎世克羅諾桿菌（C. turicensis）、穆汀斯克羅諾桿菌 （C. muytjensii）、都柏林克羅諾桿菌（C. dubli nensis），其中都柏林克羅諾桿菌包括3 個(gè)亞種，分別為都柏林克羅諾桿菌都柏林亞種（C. dublinensis subsp. dubl i nensi s）、都柏林克羅諾桿菌乳粉亞種（C. dublinensis subsp. lactaridi）和都柏林克羅諾桿菌洛桑亞種（C. dublinensis subsp. lausannensis）。目前鑒定克羅諾桿菌的方法包括生化反應(yīng)方法[7]、分子生物學(xué)方法（普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)[8]、實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)[9]、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增）等[10]，但是傳統(tǒng)的生化方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣；分子檢測(cè)方法雖靈敏但獲得結(jié)果至少需要4 h。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionisation timeof-f l ight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近些年新發(fā)展起來(lái)的鑒定微生物的新方法[11]，不僅用于不同領(lǐng)域中微生物的鑒定[12-14]，還用于微生物的分析[15-16]。在微生物鑒定方面，它不同于傳統(tǒng)生化方法需通過(guò)觀察細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)糖醇類(lèi)物質(zhì)的利用情況得出鑒定結(jié)果，也無(wú)需像分子生物學(xué)方法那樣先提取核酸，再進(jìn)行擴(kuò)增才能獲得鑒定結(jié)果，可以將待鑒定細(xì)菌培養(yǎng)物直接點(diǎn)在靶板上，通過(guò)檢測(cè)微生物的特征性生物標(biāo)識(shí)物（主要集中在2～20 kD，受生長(zhǎng)環(huán)境和狀態(tài)影響很小的持續(xù)高表達(dá)蛋白），獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)組指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，一個(gè)樣品從菌落到取得結(jié)果只需5 min，1.5 h可以分析約100 個(gè)樣品，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的快速、準(zhǔn)確鑒定[17]。已商業(yè)化的用于細(xì)菌鑒定的MALDITOF-MS不僅操作方法簡(jiǎn)單、通量大、重現(xiàn)性高，而且配備了相應(yīng)的細(xì)菌鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)[18]，但是，由于克羅諾桿菌分類(lèi)學(xué)發(fā)生變化，目前的數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有與重新分類(lèi)的克羅諾桿菌屬相匹配的分析數(shù)據(jù)庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)擬利用Biotyper軟件應(yīng)用MALDI-TOF-MS采集分析克羅諾桿菌屬蛋白質(zhì)質(zhì)量圖譜構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，解決克羅諾桿菌的快速鑒定與分型問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

表1 參考菌株Table 1 Reference strains

共174株菌株，均來(lái)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院微生物菌種保藏管理中心（Inspection & Quarantine Culture Collection，IQCC），參考菌株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)、德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物集存庫(kù)（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）和英國(guó)國(guó)家模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（National Collection of Type Cultures，NCTC），135 株克羅諾桿菌分離菌株均經(jīng)過(guò)SN/T 1632—2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗(yàn)方法》第1部分：分離與計(jì)數(shù)方法、第3部分：熒光PCR方法驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)菌株信息見(jiàn)表1和表2。

表2 克羅諾桿菌分離菌株Table 2 Cronobacter spp. isolates

1.1.2 試劑

甲酸（formicacid，F(xiàn)A）、乙腈（acetonitrile，ACN）和無(wú)水乙醇（色譜純） 美國(guó)Fisher公司；三氟乙酸（trifluoracetic acid，TFA）（色譜純） 德國(guó)Merck公司；標(biāo)準(zhǔn)品和基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，HCCA） 德國(guó)Bruker公司；腦心浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion medium，BHI）、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）和營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA） 美 國(guó)BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AutoflexIII生物質(zhì)譜儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件的確定

將克羅諾桿菌的模式菌株阪崎克羅諾桿菌ATCC29544分別接種于TSA、NA兩種培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)18、24、48 h。將不同培養(yǎng)條件下采集的ATCC29544質(zhì)譜圖與MALDI Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)相比對(duì)，獲得最高匹配度鑒定結(jié)果、譜圖基線平滑、信噪比高、蛋白質(zhì)峰多的條件為最佳培養(yǎng)條件。

1.3.2 樣品處理方法的確定

直接涂抹法：用無(wú)菌棉棒直接挑取單菌落，涂于樣品靶板上，室溫條件下晾干，再覆蓋1.0 μL基質(zhì)溶液，晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

甲酸-乙腈提取法：挑取適量（約5～10 mg）菌落樣品于1.5 mL離心管中，加入300 μL純凈水，混勻，再加入900 μL無(wú)水乙醇，混勻；12 000 r/min離心2 min，棄去上清液；加入50 μL 70%甲酸，仔細(xì)混勻，再加入50 μL乙腈，仔細(xì)混勻，12 000 r/min離心2 min，吸取1 μL上清液點(diǎn)在靶板上，自然晾干后再點(diǎn)1 μL基質(zhì)覆蓋，晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.3 培養(yǎng)基對(duì)質(zhì)譜圖背景信號(hào)的影響

選取兩種培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)時(shí)間下無(wú)微生物生長(zhǎng)的區(qū)域，用無(wú)菌棉拭子接觸培養(yǎng)基表面進(jìn)行取樣，后續(xù)處理方法相同，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3.4 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)采集

儀器參數(shù)：Smartbeam激光器；波長(zhǎng)355 nm；每個(gè)樣品譜圖累積400 個(gè)激光脈沖信號(hào)；質(zhì)量范圍m/z 2～20 kD；延遲提取時(shí)間200 ns；加速電壓20 kV；提取電壓18.6 kV；聚焦電壓6.5 kV。每個(gè)樣品采集30 張蛋白質(zhì)量圖譜，以獲得可靠鑒定結(jié)果。

1.3.5 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)建立

選擇最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)8 株參考菌株，每株參考菌株選3 個(gè)菌落作為平行試樣，每個(gè)平行試樣重復(fù)點(diǎn)樣3 次，每個(gè)靶點(diǎn)單獨(dú)采集8 張蛋白質(zhì)量圖譜，每個(gè)平行試樣選取1 個(gè)靶點(diǎn)作為最終采集數(shù)據(jù)（盡量消除因樣品制備可能帶來(lái)的影響），每個(gè)參考菌株共收集24 張質(zhì)譜圖，每張質(zhì)譜圖都與Biotyper軟件中的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定結(jié)果均為克羅諾桿菌，再通過(guò)Biotyper軟件，將采集的質(zhì)量圖譜匯總生成克羅諾桿菌的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.3.6 MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證

將28 株腸桿菌科其他菌、1 株糞腸球菌、1 株金黃色葡萄球菌、1 株單增李斯特氏菌和135 株克羅諾桿菌屬分離株，采用相同培養(yǎng)條件進(jìn)行質(zhì)譜分析，用Biotyper數(shù)據(jù)庫(kù)和自建克羅諾桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)獲得鑒定分值，根據(jù)分值驗(yàn)證克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性。

1.3.7 MALDI-TOF-MS結(jié)果判定

所采集的質(zhì)譜圖與Biotyper軟件中標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，鑒定分值≥2.0表示可鑒定到種水平，其中2.300～3.000之間表示菌種鑒定的可信度較高，在1.700～1.999之間表示可屬鑒定到屬，在0.000～1.699之間表示不可信的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳培養(yǎng)條件的確定

微生物在不同的培養(yǎng)基中攝取不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此生長(zhǎng)特性也各異；培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)[19]。阪崎克羅諾桿菌ATCC29544在NA、TSA兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)均良好，不同培養(yǎng)時(shí)間所獲得的質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配值均在2.3以上，但在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h時(shí)獲取的蛋白指紋圖譜與其他培養(yǎng)條件的相比，相對(duì)峰強(qiáng)度高、信噪比高、離子峰多，因此，確定最佳培養(yǎng)條件為在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h。見(jiàn)圖1。

圖1 不同培養(yǎng)條件對(duì)阪崎克羅諾桿菌（ATCC29544）蛋白指紋圖譜的影響Fig.1 Effect of different culture conditions on protein mass spectrometric profiles of C. sakazakii

2.2 樣品最適處理方式的確定

仍以阪崎克羅諾桿菌ATCC29544作為實(shí)驗(yàn)菌株，在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h之后分別用直接涂抹法和甲酸-乙腈法對(duì)樣品進(jìn)行處理。由圖2可知，兩種方法所得圖譜中蛋白離子峰的強(qiáng)度一致，但甲酸-乙腈法所得圖譜的離子峰信噪比較高，系統(tǒng)可標(biāo)識(shí)出更多的離子峰，包含了更多的蛋白標(biāo)志物，這可能是因?yàn)榧姿?乙腈法中水和乙醇能洗掉培養(yǎng)基內(nèi)的雜質(zhì)[20]，兩種溶劑混合作用將菌體表面和細(xì)胞內(nèi)的高峰強(qiáng)度的蛋白提取出來(lái)，最終選擇甲酸-乙腈法為樣品最適處理方式。見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理方法對(duì)細(xì)菌蛋白指紋圖譜的影響Fig.2 Effect of different sample treatments on protein mass spectrometric profiles

2.3 培養(yǎng)基對(duì)質(zhì)譜圖信號(hào)的影響

選取不同培養(yǎng)條件下未生長(zhǎng)微生物的區(qū)域進(jìn)行蛋白質(zhì)量圖譜的采集，單純的培養(yǎng)基峰信號(hào)集中在m/z 2 000～4 000之間，峰強(qiáng)度在100～500之間，與微生物蛋白質(zhì)峰相比，這些峰信號(hào)不在微生物的離子峰中，且相對(duì)峰強(qiáng)度低，因此培養(yǎng)基本身不影響MALDI-TOF-MS對(duì)微生物蛋白質(zhì)量圖譜的采集（圖略）。

2.4 克羅諾桿菌模式菌株MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

使用Biotyper軟件將已采集的8 株克羅諾桿菌參考菌株的蛋白質(zhì)量圖譜匯總，建立克羅諾桿菌參考菌株的標(biāo)準(zhǔn)蛋白指紋圖譜。每株克羅諾桿菌參考菌株共采集70個(gè)離子峰，以75%出現(xiàn)的離子峰為屬特有離子峰，與數(shù)據(jù)庫(kù)中陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌（生物學(xué)特性與克羅諾桿菌相似）的離子峰相比對(duì)，得到6個(gè)不同離子峰：m/z 3 366.3±0.6、3 413.8±1.2、3 537.6±1.7、4 385.9±0.9、4 623.7±3.0、4 697.9±0.7，作為判別克羅諾桿菌屬的參考生物標(biāo)識(shí)物。以37.5%出現(xiàn)的離子峰為種特有離子峰，得到23 個(gè)種特有的離子峰：m/z 3 064.9、3 156.2、3 243.25±2.0、3 275.7±0.5、3 299.5±1.5、3 352.7±0.5、3 463.4、3 564.3、3 675.7、3 795.3±0.9、4 613.9±0.6、5 553.1、5 799.2、5 855.1、6 535.8、6 548.6、7 022.1±0.7、7 036.2±0.4、7 233.6、8 081.2、9 225.0±0.7、9 234.3±1.2、9 249.8±0.8，可區(qū)分克羅諾桿菌屬內(nèi)不同種以及同一種內(nèi)的不同亞種[21]?？肆_諾桿菌參考菌株MALDITOF-MS數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換出的蛋白質(zhì)譜條碼見(jiàn)圖3。

圖3 8株克羅諾桿菌參考菌株MALDI-TOF蛋白質(zhì)譜條碼Fig.3 MALDI TOF protein mass spectral barcodes of 8 reference strains of Cronobancter spp.

2.5 MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)的驗(yàn)證

采用所構(gòu)建的克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)分析31 株腸桿菌科其他菌的蛋白質(zhì)質(zhì)量，所得分值均小于1.7，而與Biotper數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，鑒定分值均不小于2.0，鑒定結(jié)果與預(yù)期相同（表1）。該結(jié)果表明所建立的克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)能夠用于克羅諾桿菌屬和種水平的鑒定。

2.6 MALDI-TOF-MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)克羅諾桿菌分離株的鑒定與分型

采用所建立的克羅諾桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)135 株克羅諾桿菌分離株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明所有被測(cè)菌株均能鑒定到種的水平，其中阪崎克羅諾桿菌101 株、克羅諾桿菌基因種12 株、丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌9株、都柏林克羅諾桿菌7 株、蘇黎世克羅諾桿菌4 株、穆汀斯克羅諾桿菌2 株。

圖4 135株克羅諾桿菌的聚類(lèi)分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram for 135 strains of Cronobancter spp.

將135 株克羅諾桿菌分離菌株的蛋白質(zhì)質(zhì)量圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖4），選擇相似度0.8的差異水平時(shí)，可被分為6 類(lèi)，用a～f類(lèi)群表示，a類(lèi)有5 株；b類(lèi)有26 株，其中2 株來(lái)源于乳粉，1 株來(lái)源于香芋奶棒，1 株來(lái)源于凍熟辣粉整肢蝦，1 株來(lái)源于出口紅燒牛肉面；c類(lèi)有9 株，其中3 株來(lái)源于洋蔥圈，1 株來(lái)源于乳粉；d類(lèi)有24 株，其中2 株來(lái)源于乳粉，1 株來(lái)源于洋蔥圈，1 株來(lái)源于凍熟辣粉整肢蝦；e類(lèi)有8 株，其中4 株來(lái)源于乳粉，1 株來(lái)源于辣粉整肢蝦，1 株來(lái)源于環(huán)境；f類(lèi)有63 株，其中25 株來(lái)源于乳粉，4 株來(lái)源于工廠終產(chǎn)品，3 株來(lái)源于方便面。根據(jù)以上分析，樣品菌株的分型與其對(duì)應(yīng)的來(lái)源及種類(lèi)并無(wú)明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明克羅諾桿菌在自然界的分布為隨機(jī)分布。

3 討 論

基質(zhì)、培養(yǎng)條件、菌體處理方法被認(rèn)為是影響MALDI-TOF-MS分析微生物的3 個(gè)主要因素。在培養(yǎng)條件優(yōu)化方面，NA、TSA兩種培養(yǎng)基對(duì)克羅諾桿菌屬的蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果沒(méi)有明顯影響，這說(shuō)明克羅諾桿菌對(duì)生長(zhǎng)條件的要求較為寬泛，但從譜圖中可以看出從兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的克羅諾桿菌獲得的質(zhì)譜圖的特征峰強(qiáng)度和數(shù)量方面略有差異，因此，要根據(jù)待鑒定菌株的實(shí)際情況選擇最佳的培養(yǎng)條件。在實(shí)驗(yàn)樣品處理方面，直接涂抹法快速易操作，但易受菌體其他代謝物干擾；甲酸-乙腈提取法可以將細(xì)菌內(nèi)部和表面的蛋白質(zhì)提取出來(lái)，盡管本實(shí)驗(yàn)兩種方法所得圖譜中蛋白離子峰的強(qiáng)度一致，但甲酸-乙腈法所得圖譜的離子峰的信噪比較高，包含了更多的蛋白標(biāo)志物。

趙貴明等[22]曾用MALDI-TOF-MS對(duì)32 株克羅諾桿菌進(jìn)行過(guò)與分型實(shí)驗(yàn)，鑒定到種、屬水平分別為56.2%和37.5%，在實(shí)驗(yàn)中提出了利用Biotyper開(kāi)放型數(shù)據(jù)庫(kù)的特點(diǎn)建立克羅諾桿菌MALDI-TOF-MS數(shù)據(jù)庫(kù)以提高克羅諾桿菌種鑒定水平的建議[23]，本實(shí)驗(yàn)將135 株克羅諾桿菌全部鑒定到種水平的結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)自建數(shù)據(jù)庫(kù)是提高鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性的方法之一。通過(guò)對(duì)鑒定菌株蛋白質(zhì)質(zhì)量圖譜聚類(lèi)分析，選擇不同差異水平，可以在種以下對(duì)菌株進(jìn)一步分型，這對(duì)克羅諾桿菌的快速溯源具有重要參考價(jià)值。

MALDI-TOF-MS除用于常規(guī)細(xì)菌的快速高通量鑒定外，還用于對(duì)較難鑒定菌株的快速識(shí)別，如對(duì)臨床標(biāo)本分離的544 株（79 個(gè)種）厭氧菌鑒定中，332 株（61%）可一次獲得鑒定結(jié)果[24]；對(duì)高毒性和耐藥菌株的準(zhǔn)確識(shí)別，如應(yīng)用MALDI-TOF-MS分析了85 株經(jīng)spa基因分型方法確定的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，結(jié)果60 株菌得出15 種質(zhì)量圖譜，經(jīng)聚類(lèi)分析后與分子分型方法相比不僅結(jié)果一致，而且區(qū)分更細(xì)[25]。因此，筆者認(rèn)為在細(xì)菌鑒定工作中，如果應(yīng)用MALDI-TOF-MS先行鑒定，再采用分子生物學(xué)技術(shù)如16S rRNA依據(jù)MALDI-TOF-MS給出的排序結(jié)果優(yōu)先分析，將是現(xiàn)階段提高細(xì)菌鑒定效率的理想組合。

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Establishment and Application of an Analytical Database for Cronobacter spp. by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry

ZHAO Gui-ming, LIU Yang, CHEN Ying*, YANG Hai-rong, ZHAO Yong-sheng, WANG Ping
(Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

The purpose of this study was to establish an analytical database for high throughput identification and subtyping of 8 species of Cronobacter spp. by a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF-MS) method. Under the optimized culture and sample treatment conditions by using the established MALDI-TOFMS protein fingerprint acquisition parameters, the acquired characteristic protein mass spectrometric profiles of 8 reference strains were used to build a MALDI-TOF-MS database with Biotyper software, and the accuracy of the database was validated by comparison with data from related enterobacteriaceae strains and isolates of the genus Cronobacter. The MALDI-TOF-MS database was applied to analyze 135 isolates of Cronobacter spp. with an identification score no smaller than 2.0, which reached the requirement for identification at the species level. Further subtyping was achieved by cluster analysis. This MALDI-TOF-MS database may provide a new approach for high throughput identification and subtyping of Cronobacter strains.

Cronobacter spp.; MALDI-TOF-MS; database; identification; subtyping

TS207.4

A

1002-6630（2014）08-0105-06

10.7506/spkx1002-6630-201408020

2014-03-25

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD29B02）

趙貴明（1963—），男，研究員，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：zhcaiq@163.com

*通信作者：陳穎（1972—)，女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：chenyingcaiq@163.com