VITEK-Ⅱ全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)在室間質(zhì)評(píng)中的應(yīng)用研究及對(duì)策

劉 杰，趙滿倉(cāng)，周海峰

(北京軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100700)

檢驗(yàn)科細(xì)菌室室間質(zhì)評(píng)是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室水平的重要手段，選用合適的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)是提高室間質(zhì)評(píng)成績(jī)的保證。近年來隨著自動(dòng)微生物檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展[1]，各級(jí)醫(yī)院逐步將VITEK系列應(yīng)用于細(xì)菌室的鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)[2]。VITEK-Ⅱ是一種由電腦控制的全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，它能分別或同時(shí)完成臨床微生物的鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)等。本室將北京檢驗(yàn)中心發(fā)放的76株質(zhì)控菌用VITEK-Ⅱ與傳統(tǒng)手工法API進(jìn)行對(duì)照鑒定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器及套試劑 VITEK-Ⅱ全自動(dòng)微生物分析儀及鑒定卡，API微生物鑒定條及配套試劑均購(gòu)自法國(guó)梅里埃生物公司。羊血瓊脂平板、伊紅美藍(lán)平板、SS瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、沙保羅瓊脂平板購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。

1.1.2 室內(nèi)質(zhì)控菌株 美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)質(zhì)控菌株大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、白色念珠菌(ATCC90028)購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 診斷血清 沙門菌屬診斷血清，志賀菌屬診斷血清，腸道致病性大腸埃希菌診斷血清，均由蘭州生物制品研究所生產(chǎn);腸道侵襲性、產(chǎn)毒性大腸埃希菌診斷血清，由成都生物制品研究所生產(chǎn)。

1.1.4 室間菌株 北京市檢驗(yàn)中心發(fā)放的2008年3月至2012年10月質(zhì)控菌共75個(gè)標(biāo)本76株質(zhì)控菌(其中菌株批號(hào)為2011-3-A2的為兩種細(xì)菌的混合菌標(biāo)本)。其中45株革蘭陰性桿菌，包括腸桿菌科細(xì)菌29株，非發(fā)酵菌14株，弧菌科1株，博德特菌屬1株;18株革蘭陽(yáng)性球菌，包括葡萄球菌8株，腸球菌3株，鏈球菌6株，片球菌屬1株;7株真菌;6株其他細(xì)菌，包括厭氧菌3株，革蘭陽(yáng)性桿菌3株。

1.2 方法

1.2.1 菌種準(zhǔn)備 ①凍干ATCC菌株:在凍干菌種管中加入0.2 mL新鮮牛肉湯或無(wú)菌小牛血清，充分搖勻，分別接種于血瓊脂、伊紅美藍(lán)平板、SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板(置于35.0℃)、沙保培養(yǎng)基(置于30.0℃)孵育24～28 h。②平板培養(yǎng)基菌株:根據(jù)標(biāo)本來源，如血、尿、膿、分泌物直接挑取單個(gè)菌落接種在羊血瓊脂平板、伊紅美藍(lán)平板、沙保羅瓊脂上。大便標(biāo)本接種在SS瓊脂平板、伊紅美藍(lán)平板、沙保羅瓊脂上，35℃下培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2 鑒定方法 ①傳統(tǒng)API方法:根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色接種相應(yīng)的API微生物鑒定條。②VITEK-Ⅱ鑒定法:按VITEK-Ⅱ儀器說明書，根據(jù)革蘭染色，配制成一定濃度的細(xì)菌懸液，分別填充GP等鑒定卡，然后上機(jī)封口進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性判斷 API和VITEK-Ⅱ用鑒定百比率(%Id，概率，指示出不同菌類的比較)和T值(Tindex，指示出在同一個(gè)菌類的相似程度)表示生化結(jié)果組合與資料庫(kù)內(nèi)的典型條目(Taxa)做出比較，來指示檢測(cè)可信度的評(píng)價(jià)。依據(jù)T值及%Id的組合，做出評(píng)語(yǔ):ⅠExcellent Identification%Id＞99.9及 T ＞0.75;ⅡVery good Identification%Id＞99.0及 T＞0.50;ⅢGood Identification%Id＞90.9 及 T ＞0.25;ⅣAcceptable Identification%Id＞80.0及T＞0;ⅤDoubtful profile出現(xiàn)如果，則其中一個(gè)測(cè)試非常違反典型生化結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩種方法所有鑒定的準(zhǔn)確度均為“Good Identification”以上，甚至為“Excellent Identification”。

2.1 45株革蘭陰性桿菌鑒定結(jié)果 API系列腸桿菌科接種API 20E，非發(fā)酵細(xì)菌接種非發(fā)酵API 20NE，18～24 h完成鑒定。VITEK-Ⅱ使用GN卡，3～10 h完成鑒定。其中2011-3-A2為大腸埃希菌/糞腸球菌混合菌、2008-2-A5為大腸埃希菌(ATCC35218)、2012-2-A5為肺炎克雷伯菌(ATCC1706)、2012-1-A5為肺炎克雷伯菌(ATCC1705 KPC陽(yáng)性)、2012-1-A3為陰溝腸桿菌(ATCC700323)。而沙門菌屬、志賀菌屬以及菌株批號(hào)為2009-1-A3的致病大腸埃希菌O111:K58需要用血清學(xué)凝集試驗(yàn)確認(rèn)，不視為鑒定錯(cuò)誤。腦膜炎敗血伊麗莎白菌，曾稱腦膜炎敗血黃桿菌或腦膜炎敗血金黃桿，不視為鑒定錯(cuò)誤。對(duì)革蘭陰性桿菌的鑒定結(jié)果，VITEK-32準(zhǔn)確42株，API準(zhǔn)確44株。

2.2 18株革蘭陽(yáng)性球菌的鑒定結(jié)果 API系列葡萄球菌接種API STAPE，鏈球菌接種 API STREP，18～24 h完成鑒定。VITEK-Ⅱ使用GP卡，3～8 h完成鑒定，其中 2012-2-A4為金黃色葡萄球菌(ATCC25923)(MSSA)、2012-1-A4為金黃色葡萄球菌(ATCC43300)(MRSA)、2011-3-A2為大腸埃希菌/糞腸球菌混合菌。有2株鏈球菌名稱不符的細(xì)菌(2009-3-A2和2011-1-A2)，但為同一菌屬，即牛鏈球菌復(fù)合群，API鑒定結(jié)果有一次錯(cuò)誤，VITEK-Ⅱ無(wú)錯(cuò)誤。

2.3 7株酵母類真菌的鑒定結(jié)果 API系列酵母菌及念珠菌接種API 20 C AUX，24～48 h完成鑒定。VITEK-Ⅱ使用YST卡，18 h完成鑒定，其中2010-3-A5為克柔假絲酵母菌(ATCC6528)。API和VITEK-Ⅱ鑒定結(jié)果均無(wú)錯(cuò)誤。

2.4 6株其他細(xì)菌的鑒定結(jié)果 API系列厭氧菌接種API 20 A，24～48 h完成鑒定。李斯特菌接種API Listeria、棒狀桿菌屬接種API Coryne、芽胞菌接種API 50CHB，均為18～24 h完成鑒定。VITEK-Ⅱ使用GP卡(李斯特菌)，3～8 h完成鑒定、ANC卡(厭氧菌-棒狀桿菌)6 h完成鑒定、BCL卡(需氧芽孢桿菌)14 h完成鑒定，API和 VITEK-Ⅱ鑒定結(jié)果均有一次錯(cuò)誤。

2.5 VITEK-Ⅱ與API鑒定率的比較 API的總鑒定率大于VITEK-Ⅱ(96.0%vs 94.7%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.935，P ＞0.05)。其中 API鑒定革蘭陰性桿菌的鑒定率大于VITEK-Ⅱ(97.8%vs 93.3%)，而 API鑒定革蘭陽(yáng)性球菌的鑒定率小于VITEK-Ⅱ(94.4%vs 100%)，其余均一致(表5)。

3 討論

1970年，法國(guó)梅里埃推出API微生物鑒定條成為細(xì)菌鑒定的國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)，是一種國(guó)際公認(rèn)的細(xì)菌鑒定手工檢索編碼[4]。API是目前涵蓋范圍最廣的細(xì)菌鑒定系列，但API畢竟是一個(gè)手工系統(tǒng)，因此梅里埃公司又研發(fā)了全自動(dòng)微生物鑒測(cè)儀VITEK-Ⅱ。

3.1 VITEK-Ⅱ的優(yōu)點(diǎn) 本研究結(jié)果可見，VITEK-Ⅱ在鑒定正確的數(shù)量上雖然較API少一株，但顯然VITEK-Ⅱ更加簡(jiǎn)化且耗時(shí)短。因?yàn)閂ITEK-Ⅱ鑒定儀與傳統(tǒng)鑒定法比較，功能多、速度快、無(wú)需附加試劑，每個(gè)試驗(yàn)卡有60個(gè)培養(yǎng)小孔，結(jié)果更準(zhǔn)確，可鑒定超過98%的臨床常見菌株，超過2000個(gè)對(duì)照表型和20000個(gè)最小抑菌濃度分布。

3.2 在質(zhì)控菌鑒定中存在的問題 沙門菌與志賀菌屬的菌株均需血清分型與證實(shí)。而API將一株腸炎沙門菌誤檢為傷寒沙門菌，但經(jīng)血清分型修正錯(cuò)誤。2011-2-A3的莫拉菌屬由于是革蘭陰性球桿菌，菌體小，革蘭染色不易脫色，常成雙或短鏈狀排列，類似奈瑟菌，容易染成革蘭陽(yáng)性球菌，而VITEK-Ⅱ誤用 GP鑒定卡誤報(bào)產(chǎn)單核李斯特菌。VITEK-Ⅱ?qū)?011-2-A2的腦膜敗血伊莉莎白菌(原名腦膜炎膿毒黃桿菌)誤鑒定成少動(dòng)鞘氨醇單胞菌;將2008-3-A2支氣管炎博德特菌(與百日咳博德特菌同屬)誤鑒定成木糖氧化無(wú)色桿菌，原因不明。由于API系列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)沒有片球菌屬[5]的分類資料，無(wú)法鑒定，誤鑒定為乳球菌屬。2011-2-A1的需氧芽孢桿菌，兩種方法均誤鑒定成李斯特菌，是因?yàn)樵撡|(zhì)控菌革蘭染色為陽(yáng)性桿菌，未見到芽孢，因此均錯(cuò)。對(duì)臨床上較少見的致病菌，如弧菌屬、棒狀桿菌屬、真菌等均獲正確鑒定。有2株鏈球菌名稱不符的細(xì)菌，但為同一菌屬，即牛鏈球菌復(fù)合群，因?yàn)椤芭ｆ溓蚓?馬腸鏈球菌復(fù)合群內(nèi)有7個(gè)種和亞種，即馬腸鏈球菌、解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種、解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種、解沒食子酸鏈球菌馬其頓亞種、嬰兒鏈球菌嬰兒亞種、嬰兒鏈球菌結(jié)腸亞種和不解乳鏈球菌”[3]。

3.3 原因分析及對(duì)策 要保證在細(xì)菌室間質(zhì)評(píng)中的獲得好成績(jī)，首先必須做好室內(nèi)質(zhì)量控制的各項(xiàng)工作:①待檢菌株必須是純培養(yǎng)。②正確觀察細(xì)菌溶血情況和氧化酶、觸酶、凝固酶試驗(yàn)，必須規(guī)范判斷正確，否則會(huì)出錯(cuò)誤結(jié)果。③革蘭染色的觀察必須準(zhǔn)確無(wú)誤，選擇鑒定卡要慎重，必要時(shí)可通過多代培養(yǎng)、反復(fù)染色、加拉絲試驗(yàn)等，再行鑒定，否則有可能產(chǎn)生鑒定導(dǎo)向的錯(cuò)誤。④受檢菌株的菌齡應(yīng)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，凍干保存的菌株，最好能轉(zhuǎn)種1～2代后，再行鑒定，準(zhǔn)確率較高。⑤注意上機(jī)操作的全過程(包括準(zhǔn)備細(xì)菌懸液、充填切割、上機(jī)的各個(gè)環(huán)節(jié))最好連續(xù)進(jìn)行，不能久置耽擱，以免影響結(jié)果。其他注意事項(xiàng):①操作過程中的污染(混懸液、吸頭、加樣槍)。②試劑過期及卡片本身問題，如部分管路堵塞。造成某些生化孔未能充入菌液，造成假陰性。③讀數(shù)儀光學(xué)讀數(shù)頭出現(xiàn)問題，光學(xué)系統(tǒng)需要經(jīng)常校正。

3.4 使用API系統(tǒng)的問題 有時(shí)新鮮培養(yǎng)的純培養(yǎng)細(xì)菌，鑒定結(jié)果卻不好，常見原因是附加試劑過期失效。附加試劑啟用后有效期僅1個(gè)月。尤其是FB試劑，顏色變深后應(yīng)棄去。此外即試劑過期。對(duì)此有以下建議:①在用VITEK-Ⅱ鑒定質(zhì)控菌時(shí)最好同時(shí)加上API系列，如兩種方法結(jié)果不相同，需要分析原因。②有時(shí)同一份細(xì)菌標(biāo)本在API與VITEK-Ⅱ鑒定結(jié)果的細(xì)菌名稱不同。首先確認(rèn)其英文名稱是否一致。如果一致，則是一致結(jié)果。如果不一致，請(qǐng)復(fù)查。③有的菌株可出現(xiàn)“不能鑒定”，這種情況的原因需要進(jìn)一步探討，結(jié)合API和傳統(tǒng)的雙歧索引法，以做出正確判斷，不能報(bào)出種名的細(xì)菌可以報(bào)該菌的屬名。④對(duì)VITEK-Ⅱ數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)無(wú)資料而不能鑒定的菌株，應(yīng)同時(shí)采用其他廠家的鑒定方法，相互查缺補(bǔ)漏，以便順利完成鑒定。⑤應(yīng)及時(shí)更新數(shù)據(jù)庫(kù)。

綜上所述，要得到正確的鑒定結(jié)果，檢驗(yàn)人員應(yīng)加強(qiáng)微生物基礎(chǔ)知識(shí)、手工鑒定基礎(chǔ)和操作技能的培訓(xùn)，加強(qiáng)學(xué)習(xí)儀器原理，同時(shí)作好室內(nèi)質(zhì)控工作的經(jīng)驗(yàn)也很重要的，才能迅速、準(zhǔn)確地為臨床提供可靠的診斷和治療依據(jù)。

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