正交試驗優(yōu)選當歸補血口服液的超濾工藝Δ

余 琰，范凌云，魏舒暢，高建德，馬立新（.甘肅中醫(yī)學院藥學院，蘭州 730000；.蘭州佛慈制藥股份有限公司，蘭州 730046））

當歸補血口服液是由當歸和黃芪兩味中藥組成，收載于2010年版《中國藥典》（一部）[1]，具有補養(yǎng)氣血，提高機體免疫功能的作用，且療效確切、應(yīng)用十分廣泛。傳統(tǒng)純化方法采用醇沉法，但工藝流程長、產(chǎn)品黏度大，且含有大量的微粒、亞微粒和絮狀物等沉淀[2]，放置時間久也易產(chǎn)生沉淀，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量外觀。為避免有效成分的損失并提高產(chǎn)品的外觀質(zhì)量，本研究采用超濾工藝對其進行純化并優(yōu)選最佳工藝參數(shù)以提高當歸補血口服液的品質(zhì)，并對超濾法在該制劑中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型液相色譜儀，包括1100系列二元泵、ELSD·2000型蒸發(fā)光散射檢測器、Agilent Chemstation 色譜工作站（美國Agilgent 公司）；UV-1800PC 型紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；KQ-250型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；LQ10-2.4型低速離心機（北京醫(yī)療儀器修理廠）；LG10-2.4A型高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；中空纖維超濾裝置（天津膜天膜工程技術(shù)有限公司）。

1.2 藥材

當歸、黃芪購于蘭州黃河藥市，經(jīng)蘭州佛慈制藥股份有限公司馬立新高級工程師鑒定為真品。

1.3 試劑

黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：106541-201106）；乙腈為色譜純，葡萄糖、乙醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥液的制備

按處方比例準確稱取藥材1600g，加12倍量水煎煮提取2次，每次2h[3]，合并提取液。提取液以離心半徑為15cm、3000 r/min離心10min，取上清液備用。

2.2 黃芪甲苷含量的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，以甲醇溶解并稀釋制備成質(zhì)量濃度為59.12μg/ml 的黃芪甲苷對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取當歸補血口服液10ml，用水飽和的正丁醇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨試液30ml，振搖，放置2h以上，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇定容、搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得[4]。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取當歸飲片適量，按“2.1”項下方法制備缺黃芪的陰性樣品貯備液，精密量取陰性樣品貯備液10ml，按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：依利特ODS-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（36∶64，V/V），流速：1.0ml/min；柱溫：室溫；進樣量：10μl；漂移管溫度：75℃；載氣（氮氣）流量：2.8L/min。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000。以上述色譜條件分別進樣測定對照品溶液、供試品溶液。結(jié)果，黃芪甲苷主峰與其他色譜峰分離良好，表明本法具有較強的專屬性。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.黃芪甲苷對照品；B.當歸補血口服液樣品；C.陰性樣品Fig 1 HPLC chromatogramsA.astragaloside Ⅳcontrol；B.Danggui buxue oral liquid；C.negative sample

2.2.5 標準曲線的制備 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液1、2、4、6、10μl，分別按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以黃芪甲苷進樣量（x，ng）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝1.319x+3.048（r＝0.9998，n＝5）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進樣量在59.12～591.2 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液10μl，連續(xù)進樣6次，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芪甲苷峰面積的RSD＝1.03%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標兩點法計算樣品中黃芪甲苷的含量。結(jié)果，黃芪甲苷的RSD＝0.76%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知黃芪甲苷含量（0.1398 mg/ml）的當歸補血口服液5ml，共6份，分別精密加入黃芪甲苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率（n＝6）。加樣回收率試驗結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.2.9 樣品含量測定 取樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，測得峰面積積分值結(jié)果帶入標準曲線方程，計算黃芪甲苷含量。

2.3 總多糖的測定

2.3.1 標準曲線的制備 精密稱取105℃下干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖25.4mg，參考文獻方法[5]，在490nm 波長處測吸光度（A）。以總多糖質(zhì)量濃度（c）為橫坐標，A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A＝16.2058c+0.0175（r＝0.9998）。結(jié)果表明，總多糖質(zhì)量濃度在0.01017～0.06102mg/ml范圍內(nèi)與A呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 總多糖樣品的制備 分別精密吸取“2.1”項下提取液12.5ml，加入無水乙醇5.0ml 使含醇量達85%，靜置24h 后，以離心半徑5cm、3700r/min 離心10min，沉淀加純化水溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，以純凈水定容。

2.3.3 總多糖的含量測定 精密吸取總多糖樣品液2.0ml，在490nm波長處測A，由回歸方程計算出總多糖含量。

2.4 超濾工藝的優(yōu)選

以影響超濾效果的工作壓強（A）、藥液溫度（B）、藥材與提取液質(zhì)量比（C）為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進行試驗?？己酥笜瞬捎镁C合評分法，以超濾前藥液所含總多糖、總皂苷的量計為100分，以超濾后的總多糖、總皂苷保留率依次評分。綜合得分＝總多糖保留率得分×60%+黃芪甲苷保留率得分×40%。因素與水平見表2；正交試驗結(jié)果見表3；方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Analysis of variance

由表2～表4可知，優(yōu)選的超濾工藝條件為A2B2C3，即工作壓強0.75MPa，藥液溫度30℃，藥材與提取液質(zhì)量比1∶8（m/m）。

2.5 工藝驗證試驗

分別按處方比例準確稱取藥材1600g，共3批，采用上述優(yōu)選工藝所得參數(shù)對最佳超濾工藝條件進行復(fù)核。結(jié)果表明，優(yōu)選超濾工藝綜合評分平均為91分，且所得工藝穩(wěn)定。驗證試驗結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果Tab 5 Results of validation tests

3 討論

當歸補血口服液藥理學研究表明，當歸中的多糖、黃芪中的多糖類、黃芪甲苷是非常重要的藥效成分，且有研究表明多糖部分的補血活性強于非多糖部分[6]。因此，本研究在考察超濾純化工藝時以黃芪甲苷、總多糖保留率為指標，且加大多糖的權(quán)重系數(shù)，能較好地反映超濾液的內(nèi)在品質(zhì)。

考慮到多糖分子量較大，又是本方中的重要藥效成分之一，在參考了文獻后[7-9]，本研究選擇分子截留量為10萬的超濾膜，既能達到較好的純化效果，還能較好地保留有效成分，提高當歸補血口服液的內(nèi)在品質(zhì)。

[1]衛(wèi)生部藥典委員會.新藥轉(zhuǎn)正標準：第34冊[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：15.

[2]李霞，馬家驊，李楠，等.當歸補血湯相狀態(tài)的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（2）：1.

[3]王永祿，王麗瑤，張東旭.正交實驗法優(yōu)選當歸補血湯提取工藝的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，18（6）：1435.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：687、616.

[5]楊莉，王志華，陶健生.黃芪中黃芪多糖含量測定方法的比較[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36（9）：562.

[6]范穎.當歸補血湯的實驗研究進展[J].中醫(yī)藥學刊，2006，24（9）：1643.

[7]楊祖金，江燕斌，葛發(fā)歡，等.超濾膜技術(shù)分離靈芝多糖的研究[J].中藥材，2009，32（1）：126.

[8]魏舒暢，余琰，王志旺，等.補陽還五湯超濾工藝優(yōu)選條件的評價與優(yōu)化[J].中成藥，2009，31（2）：304.

[9]陳彥佐，馮怡，徐德生，等.膜技術(shù)在多糖分離應(yīng)用中存在問題探討[J].中草藥，2009，40（6）：991.