益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病模型大鼠κ-nephrin 蛋白與P22Phox 表達(dá)的影響

張春輝，譚忠榮（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，武漢 430071）

糖尿病已成為對(duì)社會(huì)人群危害最大的疾病之一，其不僅可以影響體內(nèi)的糖代謝系統(tǒng)，還可誘發(fā)多種并發(fā)癥，從而加重對(duì)患者的危害。目前，對(duì)于糖尿病的治療主要以西藥口服或胰島素替代治療為主，臨床治療效果較好。而基于整體觀念的中醫(yī)學(xué)對(duì)于本病的治療同樣也有著極好的作用效果，且不良反應(yīng)較少。本研究以糖尿病模型大鼠為對(duì)象，對(duì)我院常用于治療糖尿病效果較好的益氣養(yǎng)陰活血方進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，以期為臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器

2315型UVP 分析儀器（挪威Nyco 公司）；NP-207型光學(xué)顯微鏡（深圳市海量光電有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司）；κ-nephrin 蛋白酶鏈免疫（ELISA）試劑盒（上海生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠60只，♀♂兼半，體質(zhì)量120～150g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（動(dòng)物使用合格證：醫(yī)動(dòng)字第2007-0806號(hào)）。高脂飼料包括5%膽固醇、10%豬油、5%蔗糖、10%蛋黃粉、0.2%牛膽鹽，其余為正常飼料。

2 方法

2.1 益氣養(yǎng)陰活血方的制備

黨參30g，黃芪20g，當(dāng)歸20g，地黃20g，丹參15g，川芎15g，黃精10g，地龍10g，水蛭10g。煎煮2次，每次30min，濾出，合并2次濾液濃縮至300ml。

2.2 復(fù)制模型與分組、給藥

[1]，ip STZ（25mg/kg）聯(lián)合喂飼高脂飼料以復(fù)制大鼠糖尿病模型。以空腹血糖＞7.0mmol/L和餐后2h血糖＞11.1 mmol/L 為復(fù)制糖尿病模型成功。60只SD 大鼠隨機(jī)均分為3組，即正常對(duì)照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組與益氣養(yǎng)陰活血方（200ml/kg）組。ig給藥，每天早晚1次，連續(xù)給藥16周。

2.3 大鼠腎組織病理形態(tài)觀察

末次給藥后，處死大鼠，取出腎臟，剝?nèi)ケ荒?，腎組織標(biāo)本常規(guī)脫水至透明后，石蠟包埋切片（厚度2μm），Masson 染色，光鏡下攝像，觀察腎組織病理形態(tài)改變。

2.4 κ-nephrin表達(dá)的測(cè)定

末次給藥后，處死大鼠，取出腎臟，剝?nèi)ケ荒?，將腎臟皮質(zhì)作為留取標(biāo)本，標(biāo)本留取成功后應(yīng)用液氮迅速冷凍，并應(yīng)用ELISA法測(cè)定大鼠腎皮質(zhì)勻漿中κ-nephrin的表達(dá)[1]。

2.5 P22Phox表達(dá)的測(cè)定

所有大鼠在斷頸處死后，取出胰腺，分離200mg，充分剪碎后裂解，常規(guī)勻漿、離心后靜置，取上清加熱使蛋白變性，隨后經(jīng)轉(zhuǎn)移、封閉及滴加一抗、二抗試劑，孵育過夜。應(yīng)用UVP分析儀讀標(biāo)本的校正積分光密度，以表示氧化酶亞單位22kD多肽表達(dá)的相對(duì)值[2]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以表示，多組間單因素比較先用單因素分析其正態(tài)分布，后以（LSD）法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎小球體積明顯萎縮，腎小球內(nèi)細(xì)胞增多、空泡變性；少數(shù)腎小球毛細(xì)血叢出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀病變或彌漫性萎縮，并可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹，空泡變性，間質(zhì)中有灶狀淋巴細(xì)胞浸潤。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血方組大鼠腎小球基質(zhì)和系膜細(xì)胞數(shù)增多，腎小球囊粘連程度更高。大鼠腎組織病理形態(tài)見圖1。

圖1 大鼠腎組織病理形態(tài)（Masson 染色，400×）A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.益氣養(yǎng)陰活血方組Fig 1 Pathological morphology of rat renal tissue（Masson，400×）A.normal control group；B.model group；C.Yiqi yangyin huoxue formula group

3.2 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)模型大鼠腎組織κ-nephrin 蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織κ-nephrin 蛋白表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血方組大鼠腎組織κ-nephrin 蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)模型大鼠腎皮質(zhì)κ-nephrin蛋白表達(dá)的影響見表1。

表1 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)模型大鼠腎皮質(zhì)κ-nephrin蛋白表達(dá)的影響（，n＝20）Tab 1 Effects of Yiqi yangyin huoxue formula on the expression ofκ-nephrin protein in model rat（，n＝20）

表1 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)模型大鼠腎皮質(zhì)κ-nephrin蛋白表達(dá)的影響（，n＝20）Tab 1 Effects of Yiqi yangyin huoxue formula on the expression ofκ-nephrin protein in model rat（，n＝20）

與正常對(duì)照組：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.3 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)模型大鼠腎皮質(zhì)P22Pox 多肽表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織P22Pox表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血方組大鼠腎組織氧化酶亞單位22kD多肽表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)模型大鼠腎皮質(zhì)P22-Pox表達(dá)的影響見表2。

表2 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病模型大鼠腎皮質(zhì)P22Phox 表達(dá)的影響（，n＝20）Tab 2 Effects of Yiqi yangyin huoxue formula on the expression of P22Phox in DM model rat（，n＝20）

表2 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病模型大鼠腎皮質(zhì)P22Phox 表達(dá)的影響（，n＝20）Tab 2 Effects of Yiqi yangyin huoxue formula on the expression of P22Phox in DM model rat（，n＝20）

與正常對(duì)照組：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

4 討論

κ-nephrin蛋白主要特異性表達(dá)于腎小球臟層上皮足細(xì)胞上，屬于免疫球蛋白超家族，作為跨膜蛋白表達(dá)于足細(xì)胞的裂孔隔膜，主要發(fā)揮維持腎小球?yàn)V過屏障的作用[3]。κ-nephrin蛋白在維持足細(xì)胞中具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病模型小鼠中的血清κ-nephrin蛋白水平顯著下降，且尿中κ-nephrin蛋白水平升高，與腎小球足細(xì)胞密度、數(shù)量下降水平及腎功能呈正比[4]。其作用機(jī)制可能與κ-nephrin 蛋白和CD2AP、actinin4等蛋白結(jié)合，通過重新排列足細(xì)胞的足突與細(xì)胞骨架來破壞腎小球的濾過膜結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)[5]。本研究表明，益氣養(yǎng)陰活血方可明顯增強(qiáng)模型大鼠腎組織κ-nephrin蛋白表達(dá)。

目前，臨床已將氧化應(yīng)激作為公認(rèn)的糖尿病統(tǒng)一機(jī)制的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[6]。在糖尿病模型大鼠中，隨著P22Phox表達(dá)水平的上調(diào)，會(huì)促使還原型輔酶ⅡNADPH活化，進(jìn)而使NADPH氧化酶依賴的ROS 生成增多，導(dǎo)致腎小球細(xì)胞DNA 損傷，腎小球基質(zhì)沉積，促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)展[7-8]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者中普遍存在與葡萄糖水平呈正相關(guān)的P22Phox水平增高，說明P22phox及NADPH的氧化應(yīng)激現(xiàn)象密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰活血方可明顯減弱模型大鼠腎組織P22Phox含量。

近年來，以整體觀為主要思想的中醫(yī)學(xué)治療方法逐漸受到重視。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病屬“消渴病”的范疇，其以氣陰虧虛為主要病機(jī)，同時(shí)又因患者長期氣陰虧虛，脾胃運(yùn)化失司，氣血生化乏源，脾胃虧虛，則可痰濕內(nèi)生，氣虛乏力，則可見瘀血內(nèi)生，最終可使患者出現(xiàn)以氣陰虧虛為主，兼見痰濕內(nèi)生、瘀血阻絡(luò)之證。而針對(duì)糖尿病腎病，臨床上早期分為脾腎兩虛型和肝腎陰虛型，適合采取黃芪固腎補(bǔ)氣，地黃滋養(yǎng)肝腎；晚期常為陰陽兩虛，采取黃精、水蛭等益氣通腑活血，起到溫補(bǔ)脾腎、利水泄?jié)岬淖饔肹10]。本研究中所用的益氣養(yǎng)陰活血方是基于“益氣養(yǎng)陰、化痰逐瘀”的治療原則而產(chǎn)生，其中黨參可補(bǔ)益氣血，用以為君；黃芪可補(bǔ)氣，當(dāng)歸可補(bǔ)血，兩者合用可協(xié)助君藥達(dá)到補(bǔ)益氣血之效，故用以為臣；地黃可清熱涼血，丹參可涼血活血，川芎可通絡(luò)止痛，黃精可益陰填精，四藥合用可達(dá)活血化瘀、益陰通絡(luò)之效，故合用以為佐；地龍、水蛭均為通絡(luò)之藥，可在通絡(luò)同時(shí)助藥力通達(dá)全身，故用以為使[11]。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰活血方可明顯改善糖尿病模型大鼠κ-nephrin蛋白以及P22Phox表達(dá)，對(duì)于模型大鼠的氧化應(yīng)激及腎臟保護(hù)均有著積極地作用。

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