轉(zhuǎn)基因食品分析檢測技術(shù)研究進展

王晨光，許文濤,2，黃昆侖,2，羅云波,2,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100083）

轉(zhuǎn)基因食品分析檢測技術(shù)研究進展

王晨光1，許文濤1,2，黃昆侖1,2，羅云波1,2,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗測試中心，北京 100083）

目前世界各國都以不同方式要求企業(yè)對轉(zhuǎn)基因食品進行標識，這就對轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)提出了更高的要求。本文以轉(zhuǎn)基因食品安全檢測控制體系為線索先后介紹了世界各國的轉(zhuǎn)基因標識制度及其必要性和國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因分析檢測技術(shù)的新進展，其中包括一些新穎的檢測技術(shù)，如二代測序技術(shù)、等溫擴增技術(shù)、組學分析技術(shù)等，最后預測了這些技術(shù)未來的發(fā)展前景。

轉(zhuǎn)基因食品；分析檢測技術(shù)；分子特征；等溫擴增

1988年，Hinchee等[1]研發(fā)出全球首例轉(zhuǎn)基因作物耐草甘膦品系轉(zhuǎn)基因大豆。自此之后轉(zhuǎn)基因作物得到了飛速發(fā)展，已經(jīng)對傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)生了很大的沖擊。2013年，轉(zhuǎn)基因作物在全球的總種植面積已經(jīng)超過了1.75億 hm2，比2012年增加了3%。這個數(shù)據(jù)相對于1996年轉(zhuǎn)基因作物種植面積增加了94 倍[2]。轉(zhuǎn)基因作物的迅猛發(fā)展使得轉(zhuǎn)基因食品更多地流入了商品市場，這一方面極大地滿足并豐富了人們的物質(zhì)生活需求；另一方面，人們對轉(zhuǎn)基因食品食用安全性的關(guān)注也越來越多，其中最核心的關(guān)注在于外源基因是否會對人體和環(huán)境產(chǎn)生影響。世界各國針對轉(zhuǎn)基因食品出臺了嚴格的管理制度以預防轉(zhuǎn)基因生物可能存在的安全擔憂，早在1992年，世界各國在聯(lián)合國框架下就共同達成了關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品的規(guī)范制度——《卡塔赫納生物安全議定書》[3]。食品轉(zhuǎn)基因成分分析檢測是轉(zhuǎn)基因食品標識以及監(jiān)管的首要工作，分析檢測技術(shù)的發(fā)展直接影響轉(zhuǎn)基因生物安全管理的成敗。目前對于轉(zhuǎn)基因作物及食品的研究，既有常規(guī)的定性檢測技術(shù)和定量檢測技術(shù)，也有近幾年比較關(guān)注的安全分析技術(shù)。本文主要根據(jù)實際檢測中不同需求產(chǎn)生的分析檢測技術(shù)進行綜述，以期為轉(zhuǎn)基因食品分析檢測工作提供清楚明了的框架。

1 轉(zhuǎn)基因食品標識制度

目前世界上有50余個國家都對轉(zhuǎn)基因食品實施標識管理制度。大體而言，轉(zhuǎn)基因食品標識制度主要分為強制性標識和自愿型標識兩大類。以中國、歐盟為代表的國家或組織制定了比較嚴格和預防性的法律制度，規(guī)定了需要標識的閾值；而以美國為代表的國家地區(qū)則給出了自愿標識的制度，只有當轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)食品存在過敏原等明顯差別時才需要進行標注[4-6]。

雖然各國的標識制度不同，但除了基于政治經(jīng)濟因素之外，各國更多的考慮是實際檢測能力。政府機構(gòu)在為轉(zhuǎn)基因食品標記進口許可時會依據(jù)相應的標識制度，也就是說凡是批準進口的轉(zhuǎn)基因食品必須進行標識才可進入流通環(huán)節(jié)。因此，轉(zhuǎn)基因食品標識制度是轉(zhuǎn)基因食品的重要標簽。標識制度的建立由實際檢測能力決定，定性定量分析檢測技術(shù)所達到的檢測限為標識制度提供科學依據(jù)；然而標識制度在實際檢驗檢疫工作中是通過檢測技術(shù)來實現(xiàn)的。因此，標識制度與分析檢測技術(shù)的關(guān)系十分密切，二者相互影響相互作用。

2 轉(zhuǎn)基因食品分析檢測技術(shù)

轉(zhuǎn)基因食品分析主要關(guān)注于轉(zhuǎn)基因樣品與非轉(zhuǎn)基因樣品之間的顯著性差異分析，它強調(diào)的是兩者成分和代謝物等方面體現(xiàn)的規(guī)律與特征。轉(zhuǎn)基因食品檢測主要是驗證待檢樣品的轉(zhuǎn)基因性質(zhì)，它強調(diào)的是檢驗。對于分析技術(shù)而言，得到樣品與標準參照物的差異是科研工作者的首要關(guān)注點，差異主要由樣品的主要成分，主要標記信息等方面構(gòu)成。這些信息是轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的重要對象。換言之，轉(zhuǎn)基因食品分析技術(shù)為檢測技術(shù)提供了檢測對象，而這些對象反過來也可以印證目前所開發(fā)技術(shù)的檢測效果。2.1 組學分析技術(shù)

組學技術(shù)是對一類個體系統(tǒng)集合的分析技術(shù)，主要包括轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學、代謝組學等技術(shù)。蛋白組學是指研究一個細胞在特定時間和特定環(huán)境下所有蛋白質(zhì)表達的技術(shù)。蛋白組學是對某一生物或細胞在特定生理病理狀態(tài)下表達的所有蛋白質(zhì)的特征、數(shù)量和功能進行系統(tǒng)性的研究，能在細胞整體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動規(guī)律[7]。轉(zhuǎn)錄組學研究的則是細胞在某一功能狀態(tài)下表達的全部基因總和。轉(zhuǎn)錄組學研究能夠獲得外源基因表達的信息以及外源基因插入后受體基因組表達的情況，對評價轉(zhuǎn)基因食品的非期望效應有重要意義[8]。代謝組學研究的對象是細胞在特定時間和條件下的所有小分子代謝物質(zhì)。通過對這些物質(zhì)的定性定量檢測，代謝物質(zhì)的內(nèi)外因變化應答規(guī)律可以準確獲得[9]。應用組學技術(shù)研究小分子物質(zhì)可以了解食品在體內(nèi)的消化途徑以及外源基因表達產(chǎn)物引起何種變化。目前，組學技術(shù)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因食品分析中取得一定應用。Wang Yan等[10]利用雙向電泳和電子噴霧飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分析含有Cry1ab/ac蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻的信息。Xu Wentao等[11]利用轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176的代謝產(chǎn)物（脂肪酸、甾醇、萜類化合物等）的抗氧化活力從而探究轉(zhuǎn)基因食品帶來的非期望效應。Gall等[12]利用核磁共振技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因番茄和非轉(zhuǎn)基因參照的初級代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)了15 種代謝產(chǎn)物的含量與非轉(zhuǎn)基因番茄的差異，分辨出兩種番茄的代謝產(chǎn)物差異，從而分析轉(zhuǎn)基因番茄的非期望效應。

組學分析的主要目的在于評價樣品的非期望效應（unintended effects），從而能夠正確地進行轉(zhuǎn)基因食品危害識別（hazard identification）。組學分析可以避免常規(guī)評價方法（動物喂養(yǎng)實驗）靈敏性差、耗時長及統(tǒng)計誤差等問題[13]。組學技術(shù)作為一項新興的技術(shù)，因其通量高、客觀、無選擇性的技術(shù)優(yōu)點，已經(jīng)被越來越多的科研工作者關(guān)注并使用，轉(zhuǎn)基因食品更加客觀全面的安全評價體系也會逐漸建立起來，而且它對消費者所關(guān)注的非期望效應評價具有顯著優(yōu)勢。當然，組學技術(shù)分析對象沒有形成全面的聯(lián)系，容易造成錯誤分析結(jié)果或?qū)υu價系統(tǒng)造成影響，同時組學研究的數(shù)據(jù)量和成本也是不能忽視的因素。因此，合理使用組學分析技術(shù)才能為科研工作者帶來理想結(jié)果。

2.2 光譜學分析技術(shù)

轉(zhuǎn)基因光譜學技術(shù)主要為近紅外光譜檢測。近紅外光譜穿透力強，所以不需要對轉(zhuǎn)基因食品進行預處理或基因組提取[14]；能夠表征基因結(jié)構(gòu)變化所帶來的構(gòu)型變化，進而可以通過C—O鍵，C—H鍵，C—N鍵等數(shù)據(jù)變化看出基因表達的差異[15]。近紅外光譜分析技術(shù)利用光譜圖和模擬軟件對已知樣品建庫，樣品信息庫中包含了經(jīng)過誤差校正的大量不同來源的轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)參照樣品的數(shù)據(jù)，是生物信息學較為簡單的模型。Xie Liyuan等[16]利用可見/近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合光譜預處理技術(shù)和化學計量學方法對68 個番茄葉樣品（轉(zhuǎn)基因38 個，非轉(zhuǎn)基因30 個）進行分類。芮玉奎等[17-18]利用近紅外光譜檢測轉(zhuǎn)基因玉米及其親本的差異和轉(zhuǎn)基因油菜的相關(guān)信息，并通過BP算法進行數(shù)據(jù)處理，從而建立了轉(zhuǎn)基因玉米的快速標準分析模型。翟亞鋒等[19]對9 個轉(zhuǎn)基因小麥樣品進行光譜學分析，通過主成分分析方法得到能反映小麥種子97.28%光譜信息的主成分，建立仿生模式識別（biomimetic pattern recognition，BPR）技術(shù)標準模型快速特異識別轉(zhuǎn)基因小麥系統(tǒng)。雖然轉(zhuǎn)基因光譜學檢測的準確性還有待考證，但這不能抹滅其簡單快速的優(yōu)勢在無損檢測方向所做出的貢獻。鑒于消費者對轉(zhuǎn)基因食品的安全問題格外關(guān)注，光譜學和組學分析一樣都關(guān)注于轉(zhuǎn)基因食品的非期望效應，這也是分析檢測技術(shù)在評價期望效應的基礎(chǔ)上的一種補充。

2.3 DNA水平和蛋白水平檢測策略

轉(zhuǎn)基因食品分析技術(shù)提供了檢測對象，檢測技術(shù)即驗證這些對象的轉(zhuǎn)基因性質(zhì)。對轉(zhuǎn)基因食品的檢測可以從DNA水平、RNA轉(zhuǎn)錄水平、表達蛋白水平、代謝物水平等幾個方面考慮。目前國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的研究主要集中在核酸和蛋白兩個水平上，實踐中以DNA為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)因其較高的靈敏度和特異性得到了廣泛應用。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是目前應用最廣泛的轉(zhuǎn)基因分析檢測技術(shù)。除此之外，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是常用的檢測技術(shù)[20]。

DNA水平檢測一般采用PCR技術(shù)，由于外源基因在導入受體時位置和插入片段大小難以確定，檢測每個導入基因顯然缺乏實際意義，因此檢測要通過一定的篩選技術(shù)實現(xiàn)，篩選技術(shù)可分為篩選PCR（screening PCR）、基因特異性PCR（gene-specific PCR）、構(gòu)建特異性PCR（construct-specific PCR）和轉(zhuǎn)化事件特異性PCR（event-specific PCR），如圖1所示。篩選PCR是一種以外源基因中的啟動子或者終止子為目的檢測片段的檢測方法，是一種較為快速簡便的方法；基因特異性PCR檢測的目的片段是外源插入基因中的外源目的片段；構(gòu)建特異性PCR檢測的目的片段是外源基因中外源目的基因與啟動子或者終止子的連接區(qū)域；而轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測的目的片段是外源插入基因與植物基因組的結(jié)合位點，這種方法可以確定外源基因在生物體基因組中的插入位點，而且可以明確提供外源基因的確切拷貝數(shù)，因此這種方法是目前特異性最高的檢測方法[21]。

圖1 轉(zhuǎn)基因作物PCR檢測策略示意圖及特異性比較Fig.1 Comparison of specificities of different PCR detection protocols for GMOs

PCR檢測過程中還會用到內(nèi)標基因（endogenous gene）和標準物質(zhì)（certificated reference materials，CRMs）。內(nèi)標基因是植物體內(nèi)能夠穩(wěn)定表達的低拷貝的基因[22]。內(nèi)標基因能夠用來驗證樣品的物種屬性，同時也能驗證反應體系的可行性和特異性。目前常用的內(nèi)標基因包括大豆的lectin基因[23]，棉花的sad1基因[24]，木瓜的papain基因[25]。CRMs是已知含量的轉(zhuǎn)基因樣品，用來對待檢食品進行定量分析。目前標準物質(zhì)大多采用歐盟參考物和測量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements，IRMMs）審核批準的標準分子。CRMs是由未經(jīng)過加工的原料制備而成的，由于基質(zhì)效應以及加工過程對基因組的損傷，CRMs在實際應用過程中受了很大的制約。目前線性化質(zhì)粒因其具有容易制備，準確穩(wěn)定的特點，已有取代CRMs成為標準物質(zhì)的趨勢[26]。

蛋白水平檢測主要包括ELISA法和Western blotting雜交法。ELISA法是外源蛋白與特異性的抗體進行結(jié)合，通過酶促反應產(chǎn)生有顏色的物質(zhì)從而對外源蛋白濃度進行定量。Yarasi等[27]采用ELISA法能夠準確檢測出轉(zhuǎn)基因水稻大蒜葉凝集素的含量。Western blotting法是一種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)，這種技術(shù)具有從雜蛋白質(zhì)中檢測特異性蛋白質(zhì)的功能，而且具有蛋白質(zhì)反應均一性好，保存時間長等優(yōu)點。Qiu Dewen等[28]利用Western blotting檢測轉(zhuǎn)基因水稻中稻瘟菌蛋白激發(fā)子，并且證明了該蛋白的表達增強了水稻的抗病性。

2.4 分子特征分析檢測技術(shù)

分子特征是轉(zhuǎn)基因作物及食品中外源基因插入受體基因的全部信息，主要包括外源基因的特異序列，插入位點，插入數(shù)量以及外源插入基因兩側(cè)的側(cè)翼序列等[29]。這些信息為轉(zhuǎn)基因作物及食品的分類及安全評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，可以說是整個分析檢測技術(shù)的基礎(chǔ)，不僅僅對后續(xù)現(xiàn)場快速檢測和精準定量檢測意義重大，而且也與組學分析技術(shù)關(guān)系密切，可以說分子特征既是轉(zhuǎn)基因的檢測對象，也是轉(zhuǎn)基因的分析對象，對于科研工作者和政府相關(guān)部門的重要性自然不言而喻。對于這一類技術(shù)而言，研究者首要關(guān)注的是信息的準確性和全面性，高通量的生物檢測方法就顯得尤為重要。

2.4.1 第二代測序技術(shù)

第二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS），又叫高通量測序技術(shù)，它是基于邊合成邊測序的原理誕生的高通量測序技術(shù)[30]。第二代測序技術(shù)通過基因組破碎，盲端補平，接頭連接，擴增測序等步驟獲得片段兩側(cè)的序列信息，從而獲得序列的重測序結(jié)果。第二代測序技術(shù)除了進行常規(guī)分子特征鑒定之外，還可以對多倍體基因組進行高通量分析，能夠解決多倍體基因組序列信息不全及工作量大的難題，未來可用于多倍體基因組轉(zhuǎn)基因插入位點的檢測[31]。第二代測序技術(shù)的缺點在于數(shù)據(jù)量龐大，工作繁瑣，這也是目前沒有廣泛應用的重要原因[30]。然而，正是這些數(shù)據(jù)才能獲得目的基因的所有信息，為轉(zhuǎn)基因食品的檢測提供了潛在的可能性和新的發(fā)展方向。Wahler等[32]利用第二代測序技術(shù)分析了歐盟批準上市的轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因插入位點，并且通過重測序拼接的新基因組分析外源基因的全部信息。Yang Litao等[33]同樣利用第二代測序技術(shù)，直接將小片段雙端測序結(jié)果與含有通用元件等常規(guī)信息的基因文庫比對，從而得到可疑的插入位點及插入序列，最后通過傳統(tǒng)PCR驗證，如圖2所示。

圖2 第二代測序檢測技術(shù)示意圖Fig.2 Next-generation sequencing technique

2.4.2 側(cè)翼序列PCR檢測技術(shù)

之前已經(jīng)提到，轉(zhuǎn)化事件特異性檢測是特異性最高的檢測技術(shù)，插入位點也是分子特征最為關(guān)注的信息。這種技術(shù)需要外源基因插入位點兩側(cè)的序列信息，即側(cè)翼序列信息。傳統(tǒng)PCR技術(shù)依然是分子特征檢測的主流技術(shù)。目前，擴增側(cè)翼序列PCR主要包括兩大類，一類是依賴酶切位點的技術(shù)，包括反向PCR（inverse PCR，I-PCR）和連接接頭PCR（ligated-adapter PCR，LAPCR）；一類是不依賴酶切位點的技術(shù)，包括熱不對稱交錯PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）和隨機破碎片段PCR（randomly broken fragment PCR，RBF-PCR）。

反向PCR是將基因組酶切破碎，通過環(huán)化實現(xiàn)反向引物擴增，最后測序判斷產(chǎn)物的序列信息的一項技術(shù)。反向PCR的優(yōu)勢在于操作簡單，是快速獲得側(cè)翼序列的方法。Xu Wentao等[34]運用反向PCR技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因大豆DP-356043-5的側(cè)翼序列，并經(jīng)過傳統(tǒng)PCR驗證從而確定出一套成熟的檢測方法。同樣使用酶切破碎的還有連接接頭PCR（圖3a），與反向PCR不同的是，這種方法在破碎之后認為在兩端加上接頭，然后再用特異性引物和接頭引物進行巢式PCR擴增[35]。Trinh等[36]開發(fā)出一種新型依賴接頭PCR的側(cè)翼序列獲取技術(shù)——環(huán)狀接頭PCR（loop-linker PCR），通過這種方法從多種轉(zhuǎn)基因玉米和大豆中分離出了最長達到1 800 bp的側(cè)翼序列片段。對于這種技術(shù)而言，選取酶切位點是重要的考慮環(huán)節(jié)。

Xu Wentao等[37]最近開發(fā)出一種新型的不依賴酶切位點的技術(shù)，稱為RBF-PCR。RBF-PCR的原理是利用超聲破碎的方法獲得基因小片段，兩端平端化處理后在3’端添入堿基A，利用通用接頭進行的染色體步移技術(shù)（圖3b）。Xu Wentao等[37]已經(jīng)成功獲得轉(zhuǎn)基因玉米LY038外源基因兩側(cè)的插入序列，這種方法不依賴于酶切位點的選擇，適用于所有種類的轉(zhuǎn)基因品系，具有很高的應用性。

側(cè)翼序列檢測包括對外源基因插入位點的綜合分析，因此也需要分析每一段基因的相互位置。雖然近幾年第二代測序技術(shù)因其龐大的數(shù)據(jù)分析量而被越來越多的用來獲得側(cè)翼序列，然而PCR技術(shù)的成本和簡便性仍然不容忽視，可以說側(cè)翼PCR檢測技術(shù)依然是擴增側(cè)翼序列主流且不可或缺的檢測技術(shù)。

2.5 轉(zhuǎn)基因快速檢測技術(shù)

轉(zhuǎn)基因食品分子特征信息的完備相當于建立一個龐大的篩選庫，然而一些特殊場合（港口出入境檢疫局、地方食藥監(jiān)局等）的工作者更為關(guān)注的是快速靈敏地檢測未知樣品，換句話說，沒有受過專業(yè)培訓的普通工作人員也要有能力使用某種技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因食品。這是轉(zhuǎn)基因分析檢測應用到實踐的最直接體現(xiàn)。PCR需要變溫步驟及費時費力的缺陷不適宜這一要求，所以開發(fā)新型的恒溫狀態(tài)下的擴增技術(shù)十分必要。與此同時，外源基因表達的蛋白質(zhì)可以由操作簡便、結(jié)果顯示簡單的試紙達到檢測效果。

2.5.1 等溫擴增檢測技術(shù)

PCR反應需要經(jīng)歷高溫變性，退火結(jié)合和延伸3 個溫度梯度，熱循環(huán)儀器必不可少，這就給一線檢驗工作者檢測造成了很大不便。等溫擴增技術(shù)作為解決這一問題最直接的方案，已經(jīng)取得了很大的應用突破[38]。等溫擴增（isothermal amplification）是擴增反應保持反應溫度不變的廣義PCR技術(shù)。等溫擴增最大的特點在于不需要溫度變化，簡易加熱裝置即可滿足要求。目前主要的等溫擴增技術(shù)包括環(huán)介導等溫擴增[39]（loop mediated isothermal amplification，LAMP）、鏈置換擴增（strand displacement amplification，SDA）、切口酶擴增（nicking endonuclease mediated amplification，NEMA）、依賴核酸序列的擴增技術(shù)（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、依賴解旋酶的等溫擴增（helicase-dependent amplification，HDA）等。其中，LAMP技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中已經(jīng)有很多應用，是一項已經(jīng)成熟的技術(shù)手段，閆興華等[40]用LAMP技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因玉米LY038，將cordapA基因作為目的基因設(shè)計引物，最終能達到在50 min內(nèi)檢測到0.01%的樣品。

圖4 等溫擴增原理圖Fig.4 Reaction scheme of isothermal amplification

鏈置換擴增（strand displacement amplification，SDA）是利用內(nèi)切酶活性和DNA聚合酶實現(xiàn)的擴增反應，原理如圖4a。SDA僅僅需要兩對引物和兩種特殊功能的酶，分別是限制性內(nèi)切酶和具有鏈置換活性的DNA聚合酶[41]。引物與DNA單鏈結(jié)合后產(chǎn)生的內(nèi)切酶識別位點經(jīng)內(nèi)切酶作用后依賴DNA聚合酶在切割處延伸3’端，并替代另一條DNA鏈；替代的鏈與引物雜交后又可作為另一個新的擴增反應的模板。目前，以SDA為代表的鏈置換擴增技術(shù)因其較好的特異性成為等溫擴增的主要發(fā)展方向。鏈置換主要依賴特異的酶切位點和具有置換活性的DNA酶，在此基礎(chǔ)上衍生了許多鏈置換擴增技術(shù)。其中，切口酶擴增技術(shù)（nicking endonuclease mediated amplification，NEMA）使用一種特殊的切口內(nèi)切酶，這種酶特異性地識別酶切位點并只切割其中一條鏈，從而實現(xiàn)擴增的目的。NEMA能夠避免SDA需要合成特殊硫代核苷酸的要求。王紀東等[42]利用NEMA技術(shù)檢測蠟樣芽孢桿菌的大片段DNA，最長可以獲得450 bp的目的片段，這種技術(shù)可以應用于基因組龐大的轉(zhuǎn)基因食品的檢測。此外，引入RNA酶也可實現(xiàn)擴增目的。TARAKA公司提出了一種新型的基于鏈置換原理的擴增技術(shù)——嵌合引物介導核酸等溫擴增技術(shù)（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids，ICAN）[43]。它將上述的酶切位點設(shè)計為DNA-RNA嵌合引物，使用RNase H酶特異識別嵌合部位并切斷RNA序列，從而實現(xiàn)鏈置換目的。這種引入嵌合部分的擴增技術(shù)特異性較之NEMA更好[44]。幾種鏈置換技術(shù)依然處于基礎(chǔ)研究階段，然后他們的特異性逐漸增強，且后一種方法均為前一種方法缺陷的解決方案，完善實驗方案能夠擴大等溫技術(shù)的應用范圍。

依賴核酸序列的擴增技術(shù)（nucleic acid sequencebased amplification，NASBA）是一項等溫的基于RNA的核酸擴增技術(shù)。如圖4b所示，NASBA反應體系需要逆轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA聚合酶、RNase H這3種酶。模板RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成RNA-DNA雜交體，RNase H酶降解雜交體的RNA，單鏈DNA作為模板合成新的雙鏈DNA，后者被T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出靶RNA，由此進入新一輪擴增循環(huán)，不斷形成靶核酸分子[45]。NASBA技術(shù)中不使用容易受抑制的逆轉(zhuǎn)錄酶，因此可減少樣品中抑制性物質(zhì)的影響，擴增的高特異性能夠有效降低核酸污染。對于轉(zhuǎn)基因食品而言，由于加工過程中RNA有不同程度的破壞，直接以RNA為模板難度較大。但是，如果以DNA為模板并提前高溫變性使DNA雙鏈解旋，也可使用這種方法。另外，NASBA技術(shù)還可用于制毒因子的檢測從而判斷食物中毒的原因。Morisset等[46]利用NASBA技術(shù)在芯片上完成對轉(zhuǎn)基因玉米MON863和MON810的多重定量檢測，證明了該方法在轉(zhuǎn)基因檢測方面的可應用性。

2.5.2 試紙檢測技術(shù)

試紙檢測技術(shù)更為方便快捷，對于現(xiàn)場快檢工作人員應用極廣。顯色試紙的原理如圖5所示[47]。試紙條檢測的是外源基因表達的蛋白，固定在試紙的能與外源蛋白特異結(jié)合的抗體偶聯(lián)了發(fā)光基團，外源蛋白在毛細管作用下流動與特異性抗體結(jié)合后形成的復合物可與含有特殊識別位點的二抗再次結(jié)合，從而在T線（test line）上產(chǎn)生特異顏色，而未結(jié)合的抗體則與C線（control line）上的二抗結(jié)合顯色。根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合達到檢測目的。發(fā)光基團可以為熒光集團，普通顯色劑，近年來應用適配體結(jié)合蛋白借助膠體金或納米金粒子實現(xiàn)顏色變化也得到廣泛應用[48-49]。孫艷秋等[49]利用膠體金標記的試紙成功檢測黃瓜細菌性角斑病，在15 min內(nèi)檢測到26 個菌株的存在，且無交叉污染，從而拓展了試紙條在食源微生物等領(lǐng)域的檢測應用。試紙條分析檢測技術(shù)操作簡便，分析時間短，結(jié)果表征簡單，不需要專業(yè)的檢測培訓，是快速檢測技術(shù)未來的發(fā)展方向。

除了常規(guī)外源蛋白檢測技術(shù)，He Yuqing等[50]研制出一種用來檢測控制表皮松懈R156H基因變異的核酸檢測試紙，并成功在75 min內(nèi)檢測出最低1 fmol/L的變異基因分子。與檢測外源蛋白不同，核酸試紙是直接在試紙條上檢測DNA分子，原理如圖6。樣品在被檢測前經(jīng)過一定循環(huán)產(chǎn)生大量擴增產(chǎn)物，可以實現(xiàn)邊擴增變檢測，也就是說直接將試紙條插入反應溶液中即可看到T線和C線的顯色效果。核酸試紙完成等溫擴增和試紙檢測的統(tǒng)一，不需要依賴熒光檢測裝置，而且也有效避免蛋白檢測試紙帶來的污染及假陰性問題。由于該技術(shù)目前尚處于實驗研究階段，目前在轉(zhuǎn)基因食品檢測中還沒有出現(xiàn)這種技術(shù)，但可以預見未來依賴擴 增的試紙條是快速檢測的發(fā)展趨勢。

圖5 試紙顯色原理圖Fig.5 Reaction scheme of lateral flow strip

圖6 鏈置換核酸檢測試紙原理圖[[5500]]Fig.6 Scheme of lateral flow strip based on isothermal strand displacement amplification[50]

2.6 轉(zhuǎn)基因定量檢測技術(shù)

分子特征是制定標識制度的基礎(chǔ)，依據(jù)分子特征確定標識閾值則需要通過定量檢測技術(shù)來實現(xiàn)。定量檢測技術(shù)不僅在科研工作中用來確定外源基因拷貝數(shù)及樣品轉(zhuǎn)基因相對含量，在口岸田間也可確定送檢樣品的含量從而根據(jù)閾值給出處理意見。定量檢測技術(shù)不僅是標識制度的踐行者，而且是標識制度的強大科學支撐。因此，定量檢測技術(shù)是貫穿整個轉(zhuǎn)基因分析檢測工作的重要技術(shù)手段。

2.6.1 傳統(tǒng)定量檢測技術(shù)

定量PCR重點追求的是準確性，需要確定最低檢測限和定量檢測限，檢測的目的是樣品中目的分子的拷貝數(shù)，根據(jù)同時檢測出的轉(zhuǎn)基因品系特異性基因和物種內(nèi)參基因的拷貝數(shù)來確定轉(zhuǎn)基因成分的含量。定量的方法主要是借助光學現(xiàn)象，即實時熒光PCR（real-time PCR，RT-PCR）。RT-PCR所使用的標記物主要分為3 種，即Taqman熒光探針，SYBR GreenⅠ和分子信標法。SYBR GreenⅠ染料成本最低，這種染料可以與雙鏈的DNA分子產(chǎn)生特異性的結(jié)合，熒光信號隨著PCR反應的進行逐漸增大。這種方法具有成本低、靈敏度相對較高的優(yōu)點，但是相對于其他兩種方法靈敏度較低。Taqman探針可以與目的片段特異性結(jié)合，探針5’端的熒光報告基團和3’端標記的熒光淬滅基團會被Taq擴增酶的外切活性切開從而產(chǎn)生熒光信號。Taqman熒光探針目前使用最為廣泛，其特異性和高靈敏度都得到了充分驗證，許多國家和行業(yè)標準中均使用Taqman探針法檢測[51-52]。此外一些新的技術(shù)也層出不窮，比如單熒光自淬滅技術(shù)，利用核酸本身結(jié)構(gòu)實現(xiàn)熒光淬滅，而與目的片段互補的探針則發(fā)出熒光信號。單熒光自淬滅技術(shù)因結(jié)構(gòu)復雜性難以設(shè)計，但其特異性及強淬滅性在定量技術(shù)中有應用價值，而且能用來進行等溫技術(shù)的定量檢測[53]。雖然近年來不斷有新技術(shù)涌出，RT-PCR依然是定量檢測的主流方法。

2.6.2 數(shù)字PCR檢測技術(shù)

數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是繼定性和實時熒光PCR之后的第三代PCR技術(shù)，是一種分子生物學與統(tǒng)計學結(jié)合的檢測方法。dPCR通過將樣品進行大倍稀釋，使得反應孔中的模板分子不超過一個。在傳統(tǒng)PCR條件下擴增后，產(chǎn)生熒光信號的反應孔即代表樣品的具體含量[54]。如果樣品濃度過高導致每孔中不止一個分子，根據(jù)泊松概率分布（Poisson distribution）也可計算出樣品的濃度或者拷貝數(shù)[55]。這種不依賴擴增曲線和標準曲線的定量方法已經(jīng)在拷貝數(shù)變化分析，基因分型，單細胞基因表達等領(lǐng)域取得一定突破[56-59]。對于轉(zhuǎn)基因檢測來說，獲得樣品中外源基因的拷貝數(shù)是定量檢測的關(guān)鍵。Corbisier等[60]和Sanders等[61]都得到了數(shù)字PCR與實時熒光PCR一致且準確性靈敏度更高的結(jié)果，因為不需要標準物質(zhì)，數(shù)字PCR能夠真正實現(xiàn)樣品的絕對定量。

目前數(shù)字PCR主要包括芯片數(shù)字PCR（chip digital PCR，cdPCR）和微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）。cdPCR由美國Fluidigm公司開發(fā)，通過將樣品分散到數(shù)萬個微孔中實現(xiàn)擴增反應，如圖7a所示。芯片法的最大優(yōu)勢在于通量極高，而且芯片結(jié)果可以直接通過探針反映的熒光信號計數(shù)，從而達到絕對定量的目的。Sanders在評價dPCR檢測效果時就是采用芯片法。ddPCR目前主要由美國Bio-Rad公司開發(fā)，如圖7b所示，其基本原理是將擴增體系分散為無數(shù)個小液滴，這些液滴被油狀液體包裹形成小油滴，小油滴在傳統(tǒng)PCR擴增程序下完成擴增并檢測探針熒光信號。這種方法較之芯片法成本更低，而且液滴百萬級數(shù)目足夠保證實驗的準確性，適合科研及檢測工作者使用。Taly等[58]利用ddPCR技術(shù)檢測直腸癌病人環(huán)狀DNA的KRAS突變基因，最終實現(xiàn)了包括野生型的5重樣品檢測。Morisset等[62]利用ddPCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810含量，獲得了和定量PCR一致的結(jié)果，該結(jié)果也間接證明了dPCR技術(shù)對于轉(zhuǎn)基因定量檢測的貢獻?？傮w而言，dPCR技術(shù)目前更多地應用于醫(yī)學診斷方面，已成為臨床應用方面最具潛力的診斷技術(shù)之一。兩種dPCR雖然都有各自缺陷，在轉(zhuǎn)基因檢測的研究方面還處于起始階段，但dPCR不依賴標準物質(zhì)定量的顯著特點能從原理上為核酸定量提供保證。

圖7 數(shù)字PCR反應原理Fig.7 Reaction shceme of digital PCR

2.6.3 新材料輔助的定量檢測技術(shù)

近些年來，納米技術(shù)已經(jīng)越來越多的應用在目的產(chǎn)物的檢測中[63]，主要目的在于降低背景值和提高檢測準確性。目前應用較多的新材料包括氧化石墨烯（graphene oxide，GO），納米金粒子（gold nanoparticles，AuNPs）和量子點（quantum dots，QDs）。

GO是碳原子通過sp2化學鍵形成的單分子層的二維蜂窩狀氧化結(jié)構(gòu)。GO可以作為熒光淬滅的介質(zhì)，達到淬滅染料及熒光基團的目的。GO同時具有優(yōu)先結(jié)合單鏈DNA的能力，這就使得攜帶熒光基團的探針能夠被GO吸收從而達到淬滅的目的[64]。Zhu Debin等[65]和Li Zhen等[66]根據(jù)GO的這一特點設(shè)計了相應檢測系統(tǒng)，具有很高的應用價值。納米金粒子（AuNPs）是金的微小顆粒，直徑在1～100 nm之間，可以作為淬滅基團實現(xiàn)熒光共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）[67]。Prigodich等[68]將AuNPs與DNA探針進行結(jié)合，形成AuNPs-DNA復合物，如圖8a。當目的片段與DNA探針互補時含有熒光基團的探針會被剝離下來，從而與AuNPs分離而發(fā)出熒光。與此功能類似的QDs則呈現(xiàn)出比AuNPs更好的光學性質(zhì)。量子點具有吸收波長范圍寬和發(fā)射波長范圍窄的特點，這種獨特的物理和化學性質(zhì)使得量子點在生物領(lǐng)域有廣泛應用[69-70]。與AuNPs相反的是，量子點在探針領(lǐng)域充當熒光基團的作用，熒光強度比目前發(fā)現(xiàn)的最強熒光基團還要強[71-72]。Freeman等[73]根據(jù)量子點的這一特性設(shè)計生物探針用來檢測小分子DNA。目的片段存在的情況下可以與探針結(jié)合暴露酶切位點，經(jīng)ExoⅢ內(nèi)切酶切開后探針與量子點的距離變增大發(fā)出熒光（圖8b）。

圖8 新材料輔助定量PCR技術(shù)Fig.8 Quantative PCR technology based on new optical materials

目前，這些方法只限于檢測小片段的DNA或RNA分子，對于深加工轉(zhuǎn)基因食品中存在的小片段有很好的檢測效果，對于普通轉(zhuǎn)基因食品中的作物成分，還需要進行進一步研究以增大可檢測的模板長度。雖然這些技術(shù)還處于研究階段，沒有廣泛用于轉(zhuǎn)基因食品檢測，但是鑒于現(xiàn)有熒光試劑在特異性、準確性及高背景值等方面的問題，新材料輔助的定量方法有很大的應用前景。

3 結(jié) 語

轉(zhuǎn)基因食品分析檢測技術(shù)主要針對的是原料作物的轉(zhuǎn)基因成分，監(jiān)管者或消費者需要知道外源基因插入的全部信息和外源基因及其表達產(chǎn)物對人體健康和環(huán)境的影響，這就對轉(zhuǎn)基因食品的分析檢測技術(shù)提出了更高的要求[74]。從獲得轉(zhuǎn)基因檢測的對象到轉(zhuǎn)基因食品定性定量檢測就完成了一整套轉(zhuǎn)基因食品評價的科學依據(jù)，從這點來說分析和檢測技術(shù)是相通的，而且兩者相互滲透，它們都為標識制度服務(wù)并佐證標識制度。隨著各種高新技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因分析檢測也逐漸向高通量，高準確度和高靈敏性方向發(fā)展?？梢灶A見，組學分析技術(shù)能夠幫助評價轉(zhuǎn)基因食品的非期望效應，拓展分析技術(shù)的研究手段；在普通PCR存在一定缺陷的情況下，數(shù)字PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測的應用會逐漸增多，尤其是在精準定量檢測領(lǐng)域能夠?qū)崿F(xiàn)基因拷貝數(shù)的絕對定量。針對一線工作者的快速檢測領(lǐng)域也會更多地引入等溫擴增及試紙顯色的機理?？傊D(zhuǎn)基因食品的分析檢測技術(shù)是全方位的，一方面依據(jù)管理措施研究工作會應運而生一些新的技術(shù)手段，另一方面分析和檢測技術(shù)會更加高效地滿足監(jiān)管部門和消費者的信息需求。

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Recent Progress in Techniques for the Detection and Analysis of Genetically Modified Foods

WANG Chen-guang1, XU Wen-tao1,2, HUANG Kun-lun1,2, LUO Yun-bo1,2,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. The Supervision, Inspection and Testing Center of Genetically Modified Organisms Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)

Nowadays, many countries have formulated regulatory laws for urging enterprises to identify the specific content of genetically modified foods (GMFs) in various ways, proposing higher requirement for the detection techniques of GMFs. This review describes the GMF labeling systems of various countries all over the world as well as their significance and presents the latest progress in techniques for the analysis and detection of GMFs, including some emerging techniques such as next-generation sequencing, isothermal amplification and omics techniques. At last, the future prospects of these techniques are also discussed.

genetically modified foods; analysis and detection; molecular characterization; isothermal amplification

TS201.6

A

1002-6630（2014）21-0297-09

10.7506/spkx1002-6630-201421058

2014-03-25

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08012-001）

王晨光（1991—），男，碩士，研究方向為轉(zhuǎn)基因食品分子檢測技術(shù)。E-mail：italy10.wang@gmail.com

*通信作者：羅云波（1960—），男，教授，博士，研究方向為食品安全與食品生物技術(shù)。E-mail：lyb@cau.edu.cn