魔芋葡甘低聚糖毒理學(xué)及腸道益生性評價

秦清娟，徐小青，張 媛，鐘 耕,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

魔芋葡甘低聚糖毒理學(xué)及腸道益生性評價

秦清娟1，徐小青1，張 媛1，鐘 耕1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

目的：研究以半干法酶解制備的魔芋葡甘低聚糖（konjac oligosaccharides，KOS）的毒理學(xué)特性和腸道益生性。方法：以小鼠急性毒性實驗，小鼠骨髓細胞微核實驗和小鼠精子畸形實驗對KOS急性毒性和遺傳毒性進行研究、評價；通過小鼠盲腸內(nèi)容物體外厭氧發(fā)酵評價KOS的腸道益生性。結(jié)果：KOS對雌、雄小鼠急性經(jīng)口半致死量（LD50）均大于21 500 mg/kg，屬無毒級；小鼠骨髓細胞微核實驗及小鼠精子畸形實驗均呈陰性；體外厭氧發(fā)酵實驗表明KOS可被腸道菌群有效利用，明顯增加腸道益生菌（雙歧桿菌、乳酸菌）和短鏈脂肪酸的數(shù)量，而對大腸桿菌的增殖效果不明顯。結(jié)論：KOS的安全性高，是一種功能顯著的腸道益生元。

魔芋葡甘低聚糖；急性毒性；遺傳毒性；腸道益生性

低聚糖（oligosaccharides）又稱為寡糖，是2～10 個單糖連接而成為直鏈或支鏈低聚合度糖類的總稱。隨著人們健康意識的增強，營養(yǎng)科學(xué)和醫(yī)藥科學(xué)的發(fā)展，開發(fā)天然的功能性食品原料成為近年來的研究熱點。低聚糖具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、無污染、無殘留、配伍性良好等特點，成為人們關(guān)注的焦點[1-2]。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是魔芋塊莖中的特有成分[3-4]，含量可達到44%～65%。KGM是由β-D-葡萄糖與β-D-甘露糖以1.5～1.6的比例，通過β-l,4-糖苷鍵和β-l,3-糖苷鍵連接而成[5]。但由于KGM的相對分子質(zhì)量太高，溶于水中形成的液體黏度大，限制了KGM的應(yīng)用范圍，因此可通過物理法[6]、化學(xué)法[7-8]或生物法[9]將KGM降解，形成不同聚合度的魔芋葡甘低聚糖（konjac oligosaccharide，KOS）。KOS不但可以避免KGM的劣勢，還能保留KGM多種生理功能，如對乳酸菌的增殖功能[10-11]，同時還具有一些新的已知[12]或未知的功能。半干法酶解制備KOS是以β-甘露聚糖酶處理KGM，通過微波加熱滅酶制備KOS。該種方法具有反應(yīng)條件溫和、污染小、能耗低、得率高、提純方法簡單等特點，可極大節(jié)約成本，便于工業(yè)化生產(chǎn)，故而以該種方法制備的KOS是一種潛在的、優(yōu)良的功能性低聚糖[13-14]。

半干法酶解制備KOS的工藝研究已基本完善[15]，本研究通過急性毒性實驗、骨髓細胞微核實驗及精子畸形實驗，對半干法酶解制備的KOS的安全性進行了研究。腸道中微生物發(fā) 酵是衡量腸道健康的一個重要指標[16]，因此本實驗體外模擬腸道發(fā)酵環(huán)境研究該種方法制備的KOS對腸道混合菌群及發(fā)酵環(huán)境的影響，以期為研究KOS的生理功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級昆明小鼠、飼料，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，許可證號：SCXK（渝）2012-0003；動物房溫度22～25 ℃，每天12 h明暗輪換（7：00—19：00），實驗動物環(huán)境設(shè)施合格證：普通級環(huán)境。

KOS粉末由本實驗室自制[13]，經(jīng)液相色譜和飛行質(zhì)譜聯(lián)用分析，表明該KOS粉末為葡甘二糖至十糖及少量單糖的混合物[15]。

曙紅（水溶）、牛肉膏、酵母浸粉、磷酸氫二鉀；磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、碳酸氫鈉、吐溫-80成都市科龍 化工試劑廠；L-半胱氨酸 廣州艾輝生物科技有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸（色譜純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；膽汁酸鹽、氯化血紅素 合肥博美生物科技有限責任公司；吉姆薩染色液 蘇州蘇大賽爾免疫生物科技有限公司；BBL培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基（生化試劑） 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；以上試劑除特殊標明外均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BX43顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；5810型臺式離心機 德國Eppendorf公司；厭氧培養(yǎng)箱美國Sheldon Manufacturing公司；VD-650型桌上式潔凈工作臺 蘇州精華設(shè)備有限公司；GC-2010氣相色譜日本島津公司；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋 日本Kagoshima Seisakusyo公司；Rtx-wax毛細管柱 美國Restek公司；PHS-3C pH計 上海諾博環(huán)?？萍加邢薰?。

1.3 方法

1.3.1 KOS中總糖和還原糖含量測定

稱取0.10 g KOS溶解到100 mL容量瓶中，編號為Ⅰ。?、裉柸芤? mL溶液于25 mL容量瓶中，加入3 mol/L的硫酸2.5 mL，沸水浴反應(yīng)1.5 h，冷卻，加6 mol/L氫氧化鈉溶液2.5 mL中和硫酸，定容至25 mL，編號為Ⅱ。分別?、?、Ⅱ號溶液2 mL用DNS法[17]測定還原糖，以葡萄糖做標準曲線，KOS中總糖和還原糖含量按公式（1）、（2）計算。

1.3.2 急性毒性實驗

健康昆明小鼠50 只，體質(zhì)量（20±2） g，隨機分為5 組，每組10 只，雌雄各半。根據(jù)霍恩法[18]KOS的灌胃劑量（以體質(zhì)量計，下同）分別設(shè)置為2 150、4 640、10 000、21 500 mg/kg，另設(shè)灌胃蒸餾水的空白對照組。采用一次性灌胃法，小鼠灌胃前禁食24 h，灌胃體積為0.2 mL/10 g。灌胃后連續(xù)觀察兩周，記錄小鼠中毒癥狀及死亡數(shù)量。

1.3.3 遺傳毒性實驗

1.3.3.1 小鼠精子畸形實驗

健康成年雄性昆明小鼠25 只，體質(zhì)量（25±2） g，隨機分成5 組。KOS分高、中、低3 個劑量，分別為2 500、5 000、10 000 mg/kg，以環(huán)磷酰胺為陽性組（40 mg/kg），另設(shè)空白對照組（灌胃蒸餾水），灌胃體積為0.2 mL/10 g，每日1 次，連續(xù)5 d，于首次灌胃后35 d頸椎脫臼處死小鼠，取雙側(cè)附睪，制備精子標本（每鼠制3 個），1%伊紅染色，高倍鏡下觀察1 000 個精子，記錄畸形精子數(shù)目，并按照公式（3）計算畸形率/‰。

式中：a、b、c分別為同一只小鼠所做3 個標本中畸形精子數(shù)量。

1.3.3.2 小鼠骨髓細胞微核實驗

健康昆明小鼠50 只，體質(zhì)量（20±2）g，隨機分為5 組，雌雄各半。KOS分別設(shè)為高（10 000 mg/kg）、中（5 000 mg/kg）、低（2 500 mg/kg）劑量組，另設(shè)環(huán)磷酰胺陽性組（40 mg/kg）和空白對照組（灌胃蒸餾水）。采用兩次經(jīng)口灌胃法，于第2次灌胃后6 h脫頸椎處死小鼠，取胸骨骨髓制標本（每鼠制2 個），吉姆薩染色液染色。油鏡下觀察1 000 個嗜多染紅細胞（polychromatic erythrocytes，PCE），計數(shù)產(chǎn)生微核的嗜多染紅細胞（microkernel normorchromatic erythrocytes，MNE），并于每個標本中分別計數(shù)200 個紅細胞中的PCE和成熟紅細胞（normorchromatic erythrocytes，NCE）的個數(shù)，計算微核產(chǎn)生率和PCE/NCE值。

1.3.4 體外厭氧發(fā)酵

1.3.4.1 體外發(fā)酵步驟

體外厭氧發(fā)酵參考Sanz[19-20]和Lan[21]等的方法，稍做改動。無菌取20 只健康小鼠盲腸內(nèi)容物于滅菌離心管中，9 倍無菌生理鹽水稀釋，渦旋振蕩3 min使其分散均勻，4 層紗布過濾，取8 mL加入盛有72 mL無菌氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、氯化鈉0.1 g、磷酸氫二鉀0.04 g、磷酸二氫鉀0.04 g、硫酸鎂0.01 g、氯化鈣0.01 g、碳酸氫鈉2 g、吐溫-80 2 mL、氯化血紅素5 mg、L-半胱氨酸0.5 g、膽汁酸鹽0.5 g，溶于1 000 mL蒸餾水）。將三角瓶分為4 組，每組3 瓶，分別加入1%的葡萄糖（Glu組）、1% KOS（KOS組）、0.5% KOS+0.5% Glu（KOS/Glu組），另外一組為不加任何碳源的空白對照組。之后將其放于37 ℃厭氧發(fā)酵箱中發(fā)酵12 h，終止發(fā)酵。檢測發(fā)酵液的pH值，短鏈脂肪酸及微生物含量。

1.3.4.2 發(fā)酵液pH值測定

發(fā)酵液pH值的測定參考GB/T 1601—1993《農(nóng)藥pH值的測定方法》[22]。

1.3.4.3 發(fā)酵液中微生物測定

取1 mL發(fā)酵液加入9 mL無菌生理鹽水，依次10 倍梯度稀釋為10-1～10-77 個梯度，取10-5、10-6、10-73 個梯度用于雙歧桿菌、大腸桿菌和乳酸菌的平板分離計數(shù)，接種量為100 ?L。雙歧桿菌和乳酸菌分別采用BBL和MRS選擇培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)（厭氧培養(yǎng)箱氣體成分5% O2、5% CO2、90% N2）48 h，大腸桿菌采用EMB培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后按照菌落計數(shù)原則進行計數(shù)，結(jié)果以lg（CFU/mL）表示。

1.3.4.4 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸測定

短鏈脂肪酸的提取參考賈益群等[23]的方法，用氣相色譜測定發(fā)酵液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及總酸含量。以乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸及異戊酸標準品做標準曲線，總酸為以上各種酸的總和。

氣相色譜條件：進樣量1 ?L；進樣口溫度220 ℃；柱流量0.95 mL/min，柱溫90 ℃、平衡時間0.5 min，5 ℃/min升溫至150 ℃，保留時間7 min；檢測器溫度230 ℃；氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進行預(yù)先處理，然后通過SPSS 17.0處理軟件進行各組間差異顯著性分析，P＜0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 KOS還原糖及總糖測定

用DNS法測定半干法酶解制備的KOS粉末中還原糖和總糖含量，還原糖含量為43.23%，總糖含量為80.25%?？偺桥c還原糖的比（即平均聚合度）為1.86。根據(jù)李劍芳等[24]的報道，將平均聚合度控制在1.8～1.9之間可以將低聚糖中單糖的含量降到最低。

2.2 急性毒性實驗

小鼠灌胃后觀察期間，體質(zhì)量增長正常，且各個劑量組均無死亡。外觀、體征、行為活動、精神狀態(tài)、飲食、大小便等均沒有異?，F(xiàn)象；口、眼、鼻等處也無異常分泌物。經(jīng)解剖肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器，與空白對照組小鼠比較，皆未發(fā)現(xiàn)明顯病變和差異。在本實驗設(shè)置的最大劑量組21 500 mg/kg中雌雄兩性小鼠均沒有出現(xiàn)異常現(xiàn)象，故而說明半干法制備的KOS的最大耐受量（maximum tolerated dose，MTD）＞21 500 mg/kg，故可推算出LD50＞21 500 mg/kg，根據(jù)GB 15193.1—2003《食品安全性毒理學(xué)評價程序》中的急性毒性分級標準，該種方法制備的KOS屬于無毒級物質(zhì)。

2.3 遺傳毒性實驗

2.3.1 小鼠精子畸形實驗

表1 魔芋葡甘低聚糖對小鼠精子畸形的影響（x±s，n＝55）Table1 Effect of KOS on mouse sperm abnormality (x ±s,, n == 55))

小鼠精子畸變主要表現(xiàn)為精子頭部彎曲、中部彎曲、雙頭、雙尾、胖頭和無鉤，其中以頭部和中部彎曲居多。由表1可知，與空白對照組相比，環(huán)磷酰胺組小鼠精子畸變率顯著增加（P＜0.01），而KOS各個劑量組與蒸餾水對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。由此可以說明KOS對小鼠精子畸變無影響。圖1展示了檢片過程中小鼠精子畸形種類及形態(tài)。

圖1 小鼠精子畸形種類及形態(tài)（×40000）Fig.1 The type and morphology of sperm deformity in mice (×400)

2.3.2 小鼠骨髓細胞微核實驗

微核是由致突變物質(zhì)作用于細胞有絲分裂中期，使染色體分裂異常而產(chǎn)生。由表2可知，在兩性小鼠中，環(huán)磷酰胺組小鼠與空白對照組相比，微核率有極顯著差異（P＜0.01），而KOS各個劑量組與空白對 照組無顯著性差異（P＞0.05），且無劑量-效應(yīng)關(guān)系。說明KOS對小鼠骨髓細胞微核發(fā)生率無影響。KOS各劑量組PCE/NCE值與空白對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05），說明KOS對小鼠骨髓細胞分裂無影響。圖2展示了檢片過程中小鼠骨髓NCE、PCE、MNE的形態(tài)顏色特征，由于其在小鼠兩性之間無顯著性差異，故此處只選取雌性作圖。

表2 魔芋葡甘低聚糖對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發(fā)生率的影響（x±s，n＝55）Table2 Effect of KOS on marrow micronucleus rate in mice (±s, , n = 5)

圖2 小鼠骨髓細胞微核（×2 000）Fig.2 Bone marrow micronucleus of mice (×2 000)

2.4 體外發(fā)酵實驗

2.4.1 發(fā)酵液pH值變化

圖3 發(fā)酵液pH值變化趨勢Fig.3 pH changes in anaerobic fermentation broth

由圖3可知，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的pH值均逐漸減小，其中以Glu組發(fā)酵液降低速率最快，KOS/Glu組次之，KOS組較兩者都小。發(fā)酵液的pH值變化主要受微生物生長產(chǎn)生的有機酸和游離氨影響[25]，可能是因為不同發(fā)酵液中微生物發(fā)酵產(chǎn)酸或游離氨速率不同，從而導(dǎo)致pH值變化速率不同。

2.4.2 發(fā)酵液中微生物變化趨勢

圖4 發(fā)酵液中微生物含量Fig.4 Microbial counts in anaerobic fermentation broth

由圖4可知，1% KOS組發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量明顯高于KOS/Glu組、Glu組、空白對照組（P＜0.05），KOS/Glu組發(fā)酵液中雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量也明顯高于Glu組和空白對照組（P＜0.05），由此可以看出KOS不論是單獨使用還是和葡萄糖復(fù)合都可以被微生物利用，并對雙歧桿菌和乳酸菌有良好的增殖作用。從大腸桿菌的分離結(jié)果可以看出，KOS組和KOS/Glu組的大腸桿菌與Glu組相比，數(shù)量明顯較多（P＜0.05），而與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05），這可能是由于Glu組發(fā)酵液pH值降低速率極快，在發(fā)酵結(jié)束時pH 4.62，對大腸桿菌造成了抑制作用，而KOS組、KOS/Glu組和空白對照組發(fā)酵液pH值降低速率較慢，對大腸桿菌影響不大。由此可以看出，KOS對腸道有害菌大腸桿菌增殖作用不明顯，這可能是因為雙歧桿菌等的增長對其有抑制作用[26]。

2.4.3 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量

圖5 KOS厭氧發(fā)酵液氣相色譜圖（11% KOOSS組）Fig.5 GC of KOS anaerobic fermentation broth (1% KOS)

發(fā)酵液氣相色譜圖見圖5。由表3可知，在不同發(fā)酵液的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）中，乙酸含量最高，占總量的47%～64%，其中KOS組和KOS/Glu組顯著高于Glu組和空白對照組（P＜0.05），而KOS組與KOS/Glu組含量差異不明顯（P＞0.05）。同樣KOS組和KOS/Glu組中丙酸、丁酸、和戊酸含量也極顯著高于另外兩組（P＜0.05），而KOS組與KOS/Glu組相比，丁酸和戊酸含量都顯著較高（P＜0.05），而丙酸含量略低，但差異不明顯（P＞0.05）。另外從SCFAs總量來看，KOS組和KOS/Glu組發(fā)酵液中SCFAs總量明顯高于其他兩組（P＜0.05），同樣KOS組與KOS/Glu組相比也具有顯著差異（P＜0.05）。SCFAs主要是雙歧桿菌等腸道益生菌通過厭氧發(fā)酵腸道中糖類物質(zhì)產(chǎn)生的對機體腸道健康有積極作用的一類次級代謝產(chǎn)物[27]。從上述結(jié)果可以看出，KOS可以促進腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs，有利于腸道健康。

表3 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量（x±s，n＝3）Table3 The contents of short-chain fatty acids (SCFAs) in anaerobic fermentation brotthh ((x ±s,, n == 33))

3 結(jié) 論

本實驗采用霍恩法研究KOS的急性毒性，結(jié)果表明：KOS的LD50＞21 500 mg/kg，屬于無毒級物質(zhì)。通過小鼠骨髓細胞微核實驗和小鼠精子畸形實驗，研究了KOS的遺傳毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨髓細胞微核實驗和精子畸形實驗均呈現(xiàn)陰性，表明KOS無遺傳毒性。綜合急性毒性實驗和遺傳毒性實驗表明KOS是一種安全的低聚糖。

腸道內(nèi)容物體外厭氧發(fā)酵結(jié)果表明不論是單獨的KOS或與葡萄糖復(fù)合都對腸道中的益生菌（雙歧桿菌、乳酸菌）有顯著的增殖作用（P＜0.05），而發(fā)酵液中SCFAs的增加也呈現(xiàn)極顯著的趨勢（P＜0.05），而對大腸桿菌的增殖沒有明顯作用（P＞0.05）。結(jié)果表明KOS刺激腸道益生菌生長，產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸及戊酸等有機酸，降低腸道發(fā)酵pH值，改變腸道微環(huán)境，促進腸道健康。

綜上所述，KOS具有較高的安全性，是一種功能顯著的腸道益生元。

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Toxicological and Prebiotic Evaluation of Konjac Oligosaccharides

QIN Qing-juan1, XU Xiao-qing1, ZHANG Yuan1, ZHONG Geng1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Special Food Engineering Technology Research Center, Chongqing 400715, China)

Objective: To evaluate the safety and prebiotic function of konjac oligosaccharides (KOS). Methods: Mouse acute toxicity test, mouse bone marrow cell micronucleus test and mouse sperm aberration test were used to evaluate the safety of KOS. The prebiotic function was evaluated by in vitro fermentation of mouse cecum contents. Results: Acute toxicity test showed that the LD50of KOS was greater than 21 500 mg/kg body weight for both male and female mi ce, indicating that KOS is non-toxic. The results of genotoxicity tests, including mouse bone marrow cell micronucleus test and mouse sperm aberration test, were all negative. Fermentation in vitro showed that KOS could promote proliferation of beneficial bacteria, such as Bif i dobacterium spp. and Lactobacillus/Enterococcus spp., but caused no significant effects on Escherichia coli. In addition, KOS significantly promoted the accumulation of acetic acid, propionic acid, butyric acid and valeric acid generated by gut microbes, and increased the total amount of short-chain fatty acid (SCFAs). Conclusion: KOS is highly safe and possesses an excellent prebiotic function.

konjac oligosacc harides (KOS); acute toxicity; genotoxicity; prebiotic function

TS201.4

A

1002-6630（2014）21-0244-05

10.7506/spkx1002-6630-201421048

2014-01-15

秦清娟（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：825681973@qq.com

*通信作者：鐘耕（1964—），男，教授，博士后，研究方向為糧食、油脂、植物蛋白。E-mail：zhongdg@126.com