鼠曲草總黃酮抑制疼痛模型小鼠炎癥因子產(chǎn)生而致鎮(zhèn)痛作用

黃曉佳，李永金*，李 靜，許 瀟

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 202013）

鼠曲草總黃酮抑制疼痛模型小鼠炎癥因子產(chǎn)生而致鎮(zhèn)痛作用

黃曉佳，李永金*，李 靜，許 瀟

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 202013）

目的：研究鼠曲草總黃酮的鎮(zhèn)痛活性及其作用機(jī)制。方法：采用熱板刺激、腹腔注射醋酸法構(gòu)建小鼠疼痛模型，觀察灌胃給予不同劑量的鼠曲草總黃酮對(duì)小鼠疼痛反應(yīng)的作用，研究鼠曲草總黃酮對(duì)疼痛小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）的作用，以及對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）基因表達(dá)的影響。結(jié)果：鼠曲草總黃酮可明顯延長熱刺激引起的小鼠舔足時(shí)間，抑制腹腔注射醋酸后引起的小鼠扭體反應(yīng)；降低腹腔注射醋酸致痛小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO的含量，也抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、iNOS基因表達(dá)。結(jié)論：鼠曲草總黃酮具有鎮(zhèn)痛作用，其作用與減少血清中炎癥因子的產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

鼠曲草；總黃酮；鎮(zhèn)痛；炎癥因子

鼠曲草（Gnaphalium aff i ne D. Don）為菊科植物鼠曲草屬植物，主產(chǎn)于江蘇、浙江、福建等地。每年清明節(jié)前后，民間采摘其嫩葉用于制作糕點(diǎn)等食品。研究表明鼠曲草的主要成分包含黃酮類、揮發(fā)油等，其黃酮類成分具有抗氧化、抑菌、護(hù)肝等作用[1-4]，且毒性低，具有可觀的作為天然保健食品的開發(fā)利用價(jià)值。來自于天然產(chǎn)物中的黃酮類化合物具有降血糖、降血壓、抗衰老、抗炎等生物活性[5-8]，在保健食品和保健藥品中的使用日益廣泛，對(duì)黃酮類化合物的研究開發(fā)也日益增多。但目前對(duì)鼠曲草黃酮類化合物的研究仍不完全。

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠疼痛模型，研究鼠曲草總黃酮對(duì)小鼠疼痛的作用，觀察其鎮(zhèn)痛作用的特點(diǎn)，同時(shí)也測(cè)試其對(duì)小鼠血清中炎癥因子和腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的作用，評(píng)價(jià)其鎮(zhèn)痛作用和相關(guān)機(jī)制，為有效開發(fā)鼠曲草作為保健食品和藥品提供有效的理論支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)雄性昆明種小鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度25 ℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，燈光控制12 h晝夜節(jié)律；鼠曲草購自安徽亳州藥材市場(chǎng)。

蘆丁對(duì)照品 中國藥品生物制品檢定所；纖維素酶（1 400 U/mg） 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；AB-8型大孔吸附樹脂 安徽三星樹脂有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒 上海越研生物技術(shù)有限公司；NO試劑盒 南京建成生物工程研究所；mRNA提取試劑盒（含DNA酶Ⅰ消化）、小鼠TNF-α引物、IL-6引物、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）引物、親環(huán)蛋白A（cyclophilin A）引物 美國Qiagen公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒美國ABI公司；其他試劑均為國產(chǎn)化學(xué)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SENCO R201L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；Model 680酶標(biāo)儀、S1000聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；ABI 7000定量PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠曲草總黃酮的制備及純度測(cè)定

鼠曲草干燥粉經(jīng)過篩后，取粉末4 g于三角瓶中，加入10 mg纖維素酶和0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）使總體積為100 mL。置于50 ℃在水浴振蕩器中反應(yīng)2 h后，于沸水浴中5 min終止反應(yīng)，過濾，離心取上清液，合并濾液，抽濾濃縮。

使用AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)提取的濾液進(jìn)行純化，純化條件為上樣液質(zhì)量濃度2.3 mg/mL，上樣液pH 4.5，流速2 BV/h；洗脫液為75%乙醇，流速為1 BV/h；回收率為80%，純化后產(chǎn)品純度為45%。

[2]的方法，以蘆丁作為對(duì)照品測(cè)定總黃酮的純度。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入70%乙醇溶解使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60 mg/mL，以亞硝酸鈉-亞硝酸鋁比色法在510 nm波長處讀取吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=9.422 5x+ 0.162（R2=0.997 3）。取鼠尾草乙醇提取液按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法處理，于510 nm波長處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性昆明種小鼠40 只，體質(zhì)量（22±2）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為5 組。各組動(dòng)物分組及灌胃劑量如下：生理鹽水組、阿司匹林組（300 mg/（kg·d））、鼠曲草總黃酮組（低劑量組25 mg/（kg·d）、中劑量組50 mg/（kg·d）、高劑量組100 mg/（kg·d））。

熱板法小鼠疼痛模型：給予藥物前預(yù)先測(cè)定各小鼠的痛閾值。將小鼠置于55 ℃熱板上，觀察其開始舔足的時(shí)間并予以記錄。重復(fù)測(cè)量3 次，剔除平均痛閾值＜3 s或＞30 s的小鼠，將3 次痛閾平均值作為該小鼠基礎(chǔ)痛閾值。之后，各組動(dòng)物均進(jìn)行灌胃給藥，鼠曲草總黃酮組各小鼠1 次/d，連續(xù)灌胃5 d；阿司匹林組小鼠只給予1 次藥物。末次給藥后分別在0.5、1、2 h后將小鼠置于熱板上，測(cè)定其痛閾值。

腹腔注射醋酸小鼠疼痛模型：取雄性昆明種小鼠40 只，隨機(jī)分為5 組，分組及給藥劑量同上。連續(xù)灌胃5 d，末次給藥后1 h，各小鼠均腹腔注射體積分?jǐn)?shù)0.6%的醋酸溶液0.1 mL/10 g，觀察注射醋酸后20 min內(nèi)各組小鼠發(fā)生扭體反應(yīng)的次數(shù)。

1.3.3 血清中TNF-α、IL-6、NO含量檢測(cè)

小鼠于腹腔注射醋酸1 h后處死，取血樣進(jìn)行酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6含量。依照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，終止反應(yīng)后，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀內(nèi)，在450 nm波長處進(jìn)行檢測(cè)，讀取吸光度。血清NO含量按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞mRNA的制備及定量PCR檢測(cè)

依據(jù)文獻(xiàn)[9-10]方法并加以改進(jìn)，進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離。末次給藥2 h后將小鼠斷頸處死，用乙醇消毒小鼠腹部皮膚。腹腔注射5 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS），輕揉腹部5 min，小心抽吸出液體，收集到離心管中。將細(xì)胞懸液4 ℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清液收集沉淀。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作提取細(xì)胞mRNA，進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠曲草總黃酮對(duì)熱板致小鼠疼痛的作用

如表1所示，灌胃5 d后，與生理鹽水組比較，鼠曲草總黃酮（50、100 mg/kg）可顯著提高熱板導(dǎo)致小鼠疼痛閾值，2 種劑量藥物的作用均與阿司匹林相當(dāng)。此外，灌胃給予藥物后0.5 h即開始產(chǎn)生作用，至2 h后仍然有效，其峰值為給藥后1 h。

表1 鼠曲草總黃酮對(duì)熱板致小鼠疼痛的作用（x±s，n＝8）Table1 Effect of total flavonoids from Gnaphalium af fi nee D. Don oonn heat-induced pain in mice ((x ±s,, n == 88))

2.2 鼠曲草總黃酮對(duì)腹腔注射醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的作用

表2 鼠曲草總黃酮對(duì)腹腔注射醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的作用（x ＝8）Table2 Effect of total flavonoids from Gnaphalium affifi ne D. Don on the writhing response in mice induced by intraperitoneal injection of acetic acid (x , = 8)

如表2所示，腹腔注射醋酸后，各組小鼠均出現(xiàn)扭體反應(yīng)。灌胃5 d后，與生理鹽水組比較，鼠曲草總黃酮（50、100 mg/kg）可顯著減少腹腔注射醋酸導(dǎo)致的小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，其作用呈現(xiàn)劑量依賴性，50 mg/kg劑量作用與阿司匹林相當(dāng)，100 mg/kg劑量可產(chǎn)生比阿司匹林更強(qiáng)的作用（P＜0.05）。鼠曲草總黃酮（25 mg/kg）對(duì)扭體反應(yīng)次數(shù)沒有影響。

2.3 鼠曲草總黃酮對(duì)腹腔注射醋酸后小鼠血清中炎癥因子的作用

圖1 鼠曲草總黃酮對(duì)小鼠腹腔注射醋酸后血清炎癥因子的作用（x±s，n＝8）Fig.1 Effect of total flavonoids from Gnaphalium af fi ne D. Don on the production of pro-inflammatory mediators in mouse plasma after administration with acetic acid (x ±s,n=8)

如圖1所示，經(jīng)腹腔注射醋酸后，小鼠血清中出現(xiàn)大量炎癥因子，包括TNF-α、IL-6、NO。鼠曲草總黃酮（50、100 mg/kg）呈劑量依賴性地降低血清中TNF-α、IL-6、NO的含量，而25 mg/kg劑量不具有抑制血清中炎癥因子表達(dá)的作用。

2.4 鼠曲草總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的作用

圖2 鼠曲草總黃酮對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的作用（x±s，n＝4）Fig.2 Effect of total flavonoids from Gnaphalium af fi ne D. Don on the expressions of pro-inflammatory mediators in abdominal macrophages in mice treated with acetic acid (x±s, n=4)

小鼠腹腔注射醋酸后，腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平增加，誘發(fā)了炎癥反應(yīng)[11]。如圖2所示，鼠曲草總黃酮可劑量性地抑制巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、iNOS基因表達(dá)，50、100 mg/kg劑量效果與生理鹽水組相比具有顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討 論

疼痛是機(jī)體對(duì)損傷的一種反應(yīng)，緩解疼痛的方法之一是采用藥物治療。用來篩選鎮(zhèn)痛藥物的動(dòng)物模型有許多，其中熱板實(shí)驗(yàn)可模擬熱刺激導(dǎo)致的疼痛，可考察中樞性鎮(zhèn)痛藥物的作用[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼠曲草總黃酮對(duì)熱板引起的疼痛具有緩解作用，可明顯延長小鼠的痛閾值，其作用與阿司匹林相似，提示其鎮(zhèn)痛作用位點(diǎn)不在中樞，而在外周。此外，醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)模型是另一種動(dòng)物疼痛模型，該模型可模擬腹腔炎癥導(dǎo)致的病理性疼痛，已被廣泛用于非甾體抗炎藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥物的篩選和作用機(jī)制研究[11]。腹腔注射醋酸后，動(dòng)物出現(xiàn)內(nèi)臟痛疼，表現(xiàn)為扭體反應(yīng)，該反應(yīng)至少持續(xù)2 h，其高峰期為0.5 h[13-14]。在本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔注射醋酸后20 min內(nèi)出現(xiàn)多次扭體反應(yīng)，鼠曲草總黃酮和阿司匹林可顯著減少該反應(yīng)的次數(shù)，表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛作用。

鼠曲草中含有多種化學(xué)成分，包括黃酮類成分如蘆丁、槲皮素、槲皮素糖苷等，揮發(fā)油、氨基酸、微量金屬元素等[1]。鼠曲草主要活性成分為黃酮類化合物，目前已知鼠曲草黃酮可發(fā)揮抗氧化、抑制細(xì)菌生長、止咳祛痰、保護(hù)肝臟損傷等作用[1,8]。本實(shí)驗(yàn)通過熱板法和腹腔注射醋酸法模型，證實(shí)了鼠曲草總黃酮具有鎮(zhèn)痛的作用，且鎮(zhèn)痛作用在50～100 mg/kg范圍內(nèi)具有劑量依賴性，且100 mg/kg劑量的效應(yīng)優(yōu)于阿司匹林。此外，鼠曲草總黃酮可抑制腹腔注射醋酸后小鼠血清中炎癥因子如TNF-α、IL-6、NO的產(chǎn)生，也可抑制腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、iNOS基因表達(dá)，表明鼠曲草總黃酮的鎮(zhèn)痛作用來自于抑制巨噬細(xì)胞參與的機(jī)體炎癥反應(yīng)。在疼痛發(fā)生過程中，各種細(xì)胞因子和致炎癥物質(zhì)如TNF-α、干擾素、IL-6、NO、環(huán)氧合酶產(chǎn)物等都可引起痛覺的產(chǎn)生和傳遞過程，抑制各種細(xì)胞因子的表達(dá)則具有明顯的鎮(zhèn)痛效果[15-16]。而巨噬細(xì)胞是一種重要的炎癥因子產(chǎn)生細(xì)胞，其分泌的各種致炎因子可導(dǎo)致血管通透性增加、中性粒細(xì)胞滲出、組織浸潤、痛覺受體增敏和與痛覺有關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的啟動(dòng)，引起機(jī)體疼痛的感覺[17-18]。研究已表明，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和分泌炎癥因子，降低血液中炎癥因子水平可明顯減低小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，二者具有良好的相關(guān)性[19-22]。因此，通過抑制巨噬細(xì)胞的活化及分泌炎癥因子，進(jìn)而減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)是一種可行的鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)思路。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過小鼠疼痛模型，證實(shí)了鼠曲草總黃酮的鎮(zhèn)痛作用，且該作用與其抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，減低機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)。我國鼠曲草資源豐富，在保健食品和藥品開發(fā)上具有一定的價(jià)值。目前，國內(nèi)外研究已經(jīng)初步表明鼠曲草黃酮類物質(zhì)可能的作用，但其生物活性成分仍需進(jìn)一步研究，為其作為功能性食品或藥品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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Total Flavonoids from Gnaphalium aff i ne D. Don Exert Analgesic Effect via Inhibiting the Production of Pro-inflammatory Mediators in Mouse Model of Pain

HUANG Xiao-jia, LI Yong-jin*, LI Jing, XU Xiao
(School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 202013, China)

Objective: To investigate the anti-nociceptive effect of total fl avonoids from Gnaphalium aff i ne D. Don and the involved mechanism. Methods: Employing the mouse model of pain induced by heat and intraperitoneal injection of acetic acid, the analgesic activity of oral administration of the total fl avonoids was assessed. Moreover, the production of cytokines in mouse plasma, including tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and nitric oxide (NO) was determined. The gene expression levels of TNF-α, IL-6 and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in peritoneal macrophages were also examined. Results: The total fl avonoids signif i cantly increased the withdrawal latency in hot plate tests and inhibited the writhing response in mice. In addition, the total fl avonoids blocked the production of TNF-α, IL-6, and NO in plasma and reduced the expression levels of TNF-α, IL-6, and iNOS in the peritoneal macrophages. Conclusions: The total fl avonoids from Gnaphalium aff i ne D. Don exert analgesic effects in mice, which is associated with the inhibition of the production of cytokines in plasma and macrophage-mediated inf l ammation.

Gnaphalium aff i ne D. Don; total fl avonoids; analgesic effect; pro-inf l ammatory mediator

R285.5

A

1002-6630（2014）21-0240-04

10.7506/spkx1002-6630-201421047

2014-01-16

江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金項(xiàng)目（08JDG005；11JDG092）

黃曉佳（1980—），男，講師，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)和抗腫瘤藥物藥理學(xué)。E-mail：harold1980@163.com

*通信作者：李永金（1968—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锼幚韺W(xué)。E-mail：lyj8617@163.com