敗醬草多糖的組成及抗疲勞與耐缺氧作用

池愛平，康琛喆，郭歡歡，李 虹，王一民，郭 飛

（陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安 71011 9）

敗醬草多糖的組成及抗疲勞與耐缺氧作用

池愛平，康琛喆，郭歡歡，李 虹，王一民，郭 飛

（陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西 西安 71011 9）

目 的：評(píng)價(jià)敗醬草多糖（Herba Patriniae polysaccharide，HPP）抗疲勞和耐缺氧的活性。方法：采用水提醇沉法提取HPP，對(duì)其基本成分組成進(jìn)行測定；同時(shí)建立小鼠負(fù)重游泳模型和耐缺氧模型，同時(shí)給予小鼠不同劑量的HPP水溶液，測定小鼠力竭游泳時(shí)間與耐缺氧時(shí)間以及血乳酸（blood lactic acid，BLA）、血尿素氮的濃度和肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性、肝糖原和肌糖原的含量。結(jié)果：HPP是一種含蛋白質(zhì)的多糖，蛋白質(zhì)含量為13.26%，單糖主要由D-甘露糖、L-鼠李糖、 D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖以物質(zhì)的量比0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27組成；服用HPP可使小鼠游泳力竭時(shí)間顯著延 長、肝糖原含量升高，而BLA含量和CK活性均不同程度下降，但耐缺氧時(shí)間變化不明顯。結(jié)論：HPP具有抗疲勞的作用，但其對(duì)小鼠的耐缺氧作用不明顯。

敗醬草多糖；力竭運(yùn)動(dòng)；疲勞；缺氧

通過有針對(duì)性地補(bǔ)充外源性營養(yǎng)補(bǔ)劑或藥物活性成分來延緩或緩解運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生，是解決運(yùn)動(dòng)性疲勞的有效途徑之一。研究表明，許多植物多糖成分具有改善運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用[1-3]，其作用機(jī)制大多與提高機(jī)體糖儲(chǔ)備以及提高機(jī)體免疫能力等方面有關(guān)，故多糖抗運(yùn)動(dòng)性疲勞方面的研究成為近幾年運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。敗醬草是屬于敗醬科的一種草本植物，具有清熱解毒的作用，在我國各地均有生長，此外敗醬草還含有豐富的營養(yǎng)素，在許多地方被作為野生蔬菜食用[4-5]。近幾年的研究表明，敗醬草多糖（Herba Patriniae polysaccharide，HPP）具有抗呼吸道合胞病毒[6]、抗宮頸癌[7]和抗氧化[8]等藥理活性。目前還未檢索到有關(guān)于HPP的抗疲勞與耐缺氧方面的研究，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)陜西產(chǎn)敗醬草的多糖成分進(jìn)行提取，建立小鼠負(fù)重游泳模型與耐缺氧模型，通過灌胃小鼠HPP來評(píng)估其抗疲勞與耐缺氧的效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康昆明種雄性小鼠，兩月齡，體質(zhì)量22～26 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。

敗醬草購于西安市吳家墳中藥店，粉碎后備用。

D-甘露糖（D-mannose，D-Man）、D-核糖（D-ribose，D-Rib）、L-鼠李糖（L-rhamnose monohydrate，L-Rha）、D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid，D-GlcUA）、D-半乳糖醛酸（D-galacturonic acid，D-GalUA）、D-葡萄糖（D-glucose，D-Glc）、D-木糖（D-Xylose，D-Xyl）、D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）、L-阿拉伯糖（L-arabinose，L-Ara）、D-巖藻糖（D-fucose，D-Fuc） 美國Sigma公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 北京化學(xué)試劑公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Honeywell公司；透析袋（MW10 000） 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752B型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；DD5低溫高速離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Christ A LPHA 1-4冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；紫外-可見分光光度計(jì) 上海分析儀器廠；Shimadzu LC-2010A高效液相色譜儀、Shimadzu Class-VP 6.1色譜工作站 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 HPP的提取工藝

干燥敗醬草皮→粉碎→80%的乙醇浸泡30 min→濾渣水提（料液比1∶15（m/V）、溫度80 ℃、時(shí)間2 h、提取次數(shù)2 次）→過濾→Sevag法脫除游離蛋白質(zhì)→透析袋對(duì)水透析24 h→濃縮→終體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇沉淀→無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌→冷凍干 燥→HPP

1.3.2 HPP的組成測定

多糖含量測定采用蒽酮-硫酸法[9]；糖醛酸含量測定采用硫酸-咔唑法[10]；蛋白質(zhì)含量測定采用雙縮脲法[11]。紫外光譜采集：稱取HPP 5 mg，配成0.5 mg/mL的溶液，以蒸餾水為對(duì)照，在紫外光譜儀190～600 nm波長區(qū)域掃描。

單糖組成分析[12-13]：采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）。取HPP 20 mg，置于具塞試管中，加水1 mL，加熱溶解后加入0.2 mol/L的TFA 1 mL，放入烘箱中，110 ℃水解8 h，冷卻至室溫，加0.2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值為7，將水解液用重蒸水稀釋至10 mL，轉(zhuǎn)移到量瓶中，待測。對(duì)照液制備：分別稱取適量D-Man、D-Rib、L-Rha、D-GlcUA、D-GalUA、D-Glc、D-Xyl、D-Gal、L-Ara、D-Fuc，用10%甲醇配成0.1 mol/L的溶液。各取100 μL樣品液與對(duì)照液，依次加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μL、0.3mol/L NaOH溶液300 μL，70 ℃水浴60 min后冷卻至室溫，用0.3 mol/L鹽酸溶液300 μL中和，加入氯仿1.0 mL萃取，振蕩、離心，棄去下層液，重復(fù)3 次，0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液10 μL準(zhǔn)備上樣。采用梯度洗脫方式。流動(dòng)相A液為純乙腈；B液由0.45 g KH2PO4、0.5 mL TFA、100 mL乙腈和900 mL超純水組成（pH 7.5）。色譜柱：Venusil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；梯度洗脫：0 min，94% B液；4 min，94% B液；5 min，88% B液；30 min，88% B液；進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為35 ℃。

1.3.3 抗疲勞實(shí)驗(yàn)

小鼠隨機(jī)分為3 組（每組30 只）：對(duì)照組、HPP低劑量（100 mg/（kg·d））組和HPP高劑量（200 mg/（kg·d））組。HPP低、高劑量組每天灌胃相應(yīng)劑量的多糖水溶液，對(duì)照組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃5 周。末次給藥30 min后，從各組中隨機(jī)取出10 只小鼠進(jìn)行負(fù)重（體質(zhì)量5%）游泳實(shí)驗(yàn)，水溫28 ℃，記錄各組小鼠游泳力竭時(shí)間（力竭判斷的標(biāo)準(zhǔn)：小鼠頭部沉入水中5 s不能浮出水面）。小鼠力竭后立刻采血取材，測定血乳酸（blood lactic acid，BLA）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的濃度和肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性。同時(shí)在各組剩余小鼠中隨機(jī)選擇10 只，不參與力竭游泳，直接麻醉取材，測定肝糖原與肌糖原含量。均使用南京建成生物制劑公司的試劑盒測定。

1.3.4 耐缺氧實(shí)驗(yàn)方法

參照文獻(xiàn)[14]方法，對(duì)各組剩下的10 只小鼠進(jìn)行耐缺氧實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備帶塞的廣口瓶若干，每瓶加入5 g的鈉石灰，每瓶放入1 只小鼠，用凡士林涂抹瓶塞和瓶口，密閉，計(jì)時(shí)，直至小鼠呼吸停止，記錄小鼠的存活時(shí)間。

1.3.5 延長率的計(jì)算

按照下式計(jì)算抗疲勞實(shí)驗(yàn)和耐缺氧實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPP的組成

采用水提醇沉法從1 000 g敗醬草原料中提取出HPP 25.4 g，得率為2.54%。蒽酮-硫酸法測定多糖含量為58.85%，D-GalUA含量為35.20%，雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量為13.26%；紫外光譜圖（圖1）顯示HPP在280 nm波長左右有強(qiáng)吸收峰，表明其確實(shí)含有結(jié)合蛋白，屬于蛋白多糖。HPP的HPLC色譜圖（圖2）顯示：HPP主要含有D-Man、L-Rha、D-GalUA、D-Glc、D-Gal和L-Ara，其物質(zhì)的量比依次為0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27。

圖1 HPP的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectrum of HPP

圖2 HPP的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of HPP

2.2 小鼠力竭游泳時(shí)間與耐缺氧時(shí)間的測定結(jié)果

表1 各組小鼠力竭游泳時(shí)間與耐缺氧時(shí)間的對(duì)比（n＝1100）Table1 Comparison of swimming time until exhaustion and hypoxia resistance time of mice ((n = 1100))

如表1所示，與對(duì)照組相比，HPP低、高兩個(gè)劑量組小鼠力竭時(shí)間顯著延長（P＜0.05），延長率分別為23.95%和25.06%。然而HPP低、高劑量組小鼠耐缺氧時(shí)間與對(duì)照組相比較沒有顯著性差異，延長率較低（0.78%與2.22%）。結(jié)果表明，敗醬草多糖對(duì)小鼠抗疲勞的作用明顯，而對(duì)小鼠耐缺氧作用不顯著。

2.3 各組小鼠疲勞相關(guān)指標(biāo)的測定結(jié)果

表2 各組小鼠疲勞相關(guān)指標(biāo)的比較（n＝1100）Table2 Comparison of fatigue-related biochemical parameters of mice (n = 1100))

如表2所示，與對(duì)照組相比較，HPP低、高兩個(gè)劑量組小鼠的力竭后CK活性與BLA濃度顯著降低，而HPP高劑量組小鼠的肝糖原含量顯著升高，但BUN濃度與肌糖原含量變化不明顯。上述結(jié)果說明，敗醬草多糖能夠增加小鼠肝糖原儲(chǔ)備，減少運(yùn)動(dòng)時(shí)的乳酸生成，改善力竭運(yùn)動(dòng)造成的小鼠肌組織損傷程度。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法對(duì)敗醬草多糖進(jìn)行提取，多糖得率為2.54%，含量為58.85%，D-GalUA含量為35.20%。在提取過程中已經(jīng)對(duì)游離蛋白質(zhì)進(jìn)行脫除，但紫外光譜結(jié)果顯示敗醬草多糖含有結(jié)合蛋白，經(jīng)雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量為13.26%，因此HPP是一種蛋白多糖。HPLC色譜圖結(jié)果顯示，HPP的單糖組成主要是：D-Man、L-Rha、D-GalUA、D-Glc、D-Gal和L-Ara（物質(zhì)的量比依次為0.53∶0.35∶3.18∶1∶2.72∶1.27）。

游泳力竭模型是常用的一種小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型[15-16]。本實(shí)驗(yàn)通過5 周的小鼠游泳模型來評(píng)價(jià)敗醬草多糖的抗疲勞作用，測定指標(biāo)選擇與糖原儲(chǔ)備、糖代謝相關(guān)的指標(biāo)。肝糖原與肌糖原是耐力運(yùn)動(dòng)的主要能量來源，雖然本實(shí)驗(yàn)檢測到力竭前各組小鼠肌糖原含量無顯著差異，但HPP高劑量組小鼠的肝糖原儲(chǔ)備明顯高于對(duì)照組，說明HPP能夠提高機(jī)體糖原儲(chǔ)備，這是其延緩力竭游泳時(shí)間的主要原因之一。BLA是反映機(jī)體糖無氧代謝的一個(gè)重要指標(biāo)[17]。本實(shí)驗(yàn)說明，敗醬草多糖能夠提高機(jī)體糖的有氧代謝能力，降低糖的無氧代謝參與程度，這是敗醬草多糖延緩小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞的另一個(gè)原因。目前不少研究證實(shí)，植物多糖可以通過改善機(jī)體糖代謝系統(tǒng)來達(dá)到抗疲勞的作用[18-20]。BUN反映蛋白質(zhì)參與代謝的程度，也是檢測運(yùn)動(dòng)性疲勞的另一個(gè)理想指標(biāo)[21]，機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷適應(yīng)能力越差，不僅糖的無氧代謝參與程度增加，而且蛋白質(zhì)的分解代謝的程度也會(huì)有不同程度的增加，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敗醬草多糖對(duì)于蛋白質(zhì)的分解代謝影響不明顯。血清CK活性的變化是評(píng)定骨骼肌微細(xì)損 傷的一個(gè)重要生理指標(biāo)[22]。過度運(yùn)動(dòng)會(huì)使機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度加大，對(duì)肌組織造成一定的損傷[23-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敗醬草多糖可以降低游泳小鼠血清CK活性，這可能與敗醬草多糖的抗氧化性有關(guān)[8]。關(guān)于多糖對(duì)于小鼠耐缺氧能力的影響，已有研究證明其效果顯著[14,25-27]，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敗醬草多糖此作用并不明顯。耐缺氧能力由機(jī)體氧運(yùn)輸系統(tǒng)和氧利用系統(tǒng)等多種因素決定[17]，如血紅蛋白含量、紅細(xì)胞比容以及線粒體呼吸鏈各種酶的活性等，敗醬草多糖可能對(duì)于上述各項(xiàng)指標(biāo)效果不明顯而影響其耐缺氧效果。

綜上所述，敗醬草多糖可通過提高小鼠的肝糖原儲(chǔ)備與增強(qiáng)糖的有氧代謝而使小鼠游泳時(shí)間延長，達(dá)到抗運(yùn)動(dòng)疲勞的效果，但對(duì)小鼠耐缺氧能力的作用效果不明顯。

[1] XU Chao, Lü Junli, LO Y M, et al. Effects of oat β-glucan on endurance exercise and its anti-fatigue properties in trained rats[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 92(2): 1159-1165.

[2] WANG Jia, LI Shanshan, FAN Yuying, et al. Anti-fatigue activity of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C. A. Meyer[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 130(2): 421-423.

[3] JUNG K, KIM I H, HAN D. Effect of medicinal plant extracts on forced swimming capacity in mice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 93(1): 75-81.

[4] 王立軍, 李運(yùn)景. 敗醬草的本草考證[J]. 中草藥, 2004, 35(6): 696-6 97.

[5] 張一芳. 敗醬草研究進(jìn)展[J]. 中藥材, 2009, 32(1): 148-152.

[6] 張鳳梅, 李洪源, 李霞, 等. 敗醬草多糖體外抗呼吸道合胞病毒作用的研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2006, 29(1): 48-50.

[7] 陸文總. 異葉敗醬草多糖抗宮頸癌作用及機(jī)理研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2009: 12-123.

[8] 孟良玉, 劉錦峰, 渠宏雁, 等. 敗醬草粗多糖抗氧化穩(wěn)定性的研究[J].食品工業(yè)科技, 2012, 33(20): 109-115.

[9] 劉曉涵, 陳永剛, 林勵(lì), 等. 蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較[J]. 食品科技, 2009, 34(9): 270-272.

[10] TIAN Lingmin, ZHAO Yan, GUO Chao, et al. A comparative study on the antioxidant activities of an acidic polysaccharide and various solvent extracts derived from herbal Houttuynia cordata[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 83(2): 537-544.

[11] 王衛(wèi)國, 吳強(qiáng), 胡寶坤, 等. 幾種測定灰樹花多糖中蛋白質(zhì)含量方法的比較研究[J]. 中國食用菌, 2002, 22(1): 27-30.

[12] 田靈敏, 邱雪梅, 潘子敬, 等. 新型糖組成高效液相色譜分析技術(shù)的構(gòu)建及其在水飛薊多糖質(zhì)控中的應(yīng)用[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 45(4): 498-504.

[13] 何念武, 楊興斌, 田靈敏, 等. 黃瓜多糖的體外抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(19): 70-74.

[14] 王玢, 朱培新, 梁運(yùn)祥, 等. 冬蟲夏草菌絲體多糖對(duì)小鼠抗疲勞和耐缺氧能力的影響[J]. 食品科技, 2012, 37(10): 164-167.

[15] KIM K M, YU K W, KANG D H, et al. Anti-stress and anti-fatigue effects of fermented rice bran[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65(10): 2294-2296.

[16] KOO H N, LEE J K, HONG S H, et al. Herbkines increases physical stamina in mice[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2004, 27(1): 117-119.

[17] 鄧樹勛, 王健, 喬德才. 運(yùn)動(dòng)生理學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2013: 233-235.

[18] CHI Aiping, TANG Liang, ZHANG Jing, et al. Chemical composition of three polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum and their antioxidant activity in skeletal muscle of exercised mice[J]. International Journal of Sport Nutrition and Exercise Metabolism, 2012, 22(6): 479-485.

[19] CHI Aiping, CHEN Jingping, WANG Zhezhi, et al. Morphological and structural characterization of a polysaccharide from Gynostemma pentaphyllum Makino and its anti-exercise fatigue activity[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 74(4): 868-874.

[20] NI Weihua, GAO Tingting, WANG Hailiang, et al. Anti-fatigue activity of polysaccharides from fruits of four Tibetan plateau indigenous medicinal plants[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 150(2): 529-535.

[21] 陳建明, 劉昭強(qiáng), 李俊法. 貞芪扶正顆粒對(duì)抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2008, 24(6): 793-794.

[22] 李靜. 對(duì)女子馬拉松運(yùn)動(dòng)員有氧耐力訓(xùn)練生理生化指標(biāo)的評(píng)定[D].長春: 東北師范大學(xué), 2006: 20-38.

[23] 賈磊, 聶秀娟, 方梅, 等. 黃參多糖對(duì)小鼠CK、LDH和MG、HG及運(yùn)動(dòng)耐力影響的研究[J]. 吉林體育學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 26(4): 4-6.

[24] WHITE A, ESTRADA M, WALKER K, et al. Role of exercise and ascorbate on plasma antioxidant capacity in thoroughbred race horses[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2001, 128(1): 99-104.

[25] 周慶峰, 姜書納, 馬亢, 等. 鐵棍山藥多糖抗疲勞及耐缺氧作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2014, 25(2): 284-285.

[26] ZHANG Chenxiao, DAI Ziru. Anti-hypoxia activity of a polysaccharide extracted from the Sipunculus nudus L.[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 49(4): 523-526.

[27] ONISHI H, MORISAKI T, NAKAO F, et al. Protein-bound polysaccharide decreases invasiveness and proliferation in pancreatic cancer by inhibition of hedgehog signaling and HIF-1α pathways under hypoxia[J]. Cancer Letters, 2013, 335(2): 289-298.

Composition of Polysaccharides from Herba Patriniae and Their Anti-fatigue and Anti-hypoxia Activities

CHI Ai-ping, KANG Chen-zhe, GUO Huan-huan, LI Hong, WANG Yi-min, GUO Fei
(School of Sports, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119, China)

Objective: To evaluate the anti-fatigue and anti-hypoxia effects of Herba Patriniae polysaccharide (HPP). Methods: HPP was extracted by using the method of water extraction and subsequent alcohol precipitation, and its main components were determined. A weight loaded swimming model and a hypoxia model in mice were established. Meanwhile, the mice were given different dose of HPP by oral gavage, and their hypoxi a resistance time and swimming time until exhaustion were determined, and then blood lactic acid (BLA) and blood urea nitrogen (BUN) contents, creatine kinase (CK) activity and the contents of hepatic glycogen and muscle glycogen were measured. Results: HPP was a protein-bound polysaccharide composed of D-Man, L-Rha, D-GalUA, D-Glc, D-Gal and L-Ara with a molar ratio of 0.53:0.35:3.18:1:2.72:1.27. HPP could prolong the swimming time until exhaustion of mice and significantly increase the hepatic glycogen level but decrease the levels of BLA and CK. Co nclusion: HPP has an anti-fatigue effect but no antihypoxia effect in mice.

Herba Patriniae polysaccharide; exhaustive exercise; fatigue; hypoxia

G804.7

A

1002-6630（2014）21-0212-04

10.7506/spkx1002-6630-201421041

2014-06-30

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（GK201402046）；陜西師范大學(xué)“211工程”項(xiàng)目（2010-93）

池愛平（1972—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)營養(yǎng)與健康。E-mail：chimu@snnu.edu.cn