蝦夷馬糞海膽生殖腺多糖的提取、純化及鑒定

曹月剛，趙 君，陳泓宇，陳 寧，田 姮，何冬梅，楊靜峰*

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

蝦夷馬糞海膽生殖腺多糖的提取、純化及鑒定

曹月剛，趙 君，陳泓宇，陳 寧，田 姮，何冬梅，楊靜峰*

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

從蝦夷馬糞海膽生殖腺中提取純化出一種多聚甘露糖物質(zhì)，并對其結(jié)構(gòu)組成特征進行研究。以海膽生殖腺干粉為材料，采用木瓜蛋白酶酶解、乙醇醇沉、Sevag法脫蛋白等方法提取得到海膽生殖腺粗多糖。進一步以唾液淀粉酶脫除粗多糖中的糖原組分，再經(jīng)過Sepharose CL-6B色譜柱分離純化后得到均一的蝦夷馬糞海膽生殖腺多糖（polysaccharide from gonad of sea urchin，SUGP）。采用紅外光譜、紫外光譜、高效液相色譜法對SUGP的結(jié)構(gòu)特征進行研究。結(jié)果表明：SUGP為含有甘露糖的均一多糖，分子質(zhì)量為4 436 D。唾液淀粉酶可以去除多糖中的所有葡萄糖成分，之后其單糖組成僅為甘露糖，說明蝦夷馬糞海膽生殖腺多糖結(jié)構(gòu)是由多聚甘露糖與糖原相連接構(gòu)成的。

海膽生殖腺；多糖；多聚甘露糖；糖原

海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）在系統(tǒng)分類上屬于棘皮動物門（Echinodermata），游在亞門（Eleutherozoa）、海膽綱（Echinoidea），是海洋中一類常見的無脊椎動物[1]。海膽不但具有較高的營養(yǎng)價值，同時還具有多種藥用價值[2]，其生物體內(nèi)含有多種活性物質(zhì)。海膽中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)包括氨基酸、多糖、脂類、色素、毒素等[3-7]。研究發(fā)現(xiàn)海膽多糖也具有抗腫瘤和增強機體免疫力等生物活性[8-9]。張忠玲等[10]采用水提醇沉、有機溶劑抽提、柱層析、離心超濾等從海膽腸中精確提取多糖，研究發(fā)現(xiàn)這種多糖成分對Bel-7402人肝癌細胞有一定的抗腫瘤作用。Liu Chunhui等[11]以光棘球海膽生殖腺為原料，從中提取純化得到一種多糖，并利用體外脾淋巴細胞做了增殖實驗測定其免疫活性，證明其具有較強的體外免疫活性。徐張展等[12]利用Sephadex G-75色譜柱純化得到一種分子質(zhì)量在3.6 kD左右的海膽生殖腺多糖（polysaccharide from gonad of sea urchin，SUGP），也證明了其具有體外免疫活性。白日霞等[13]從馬糞海膽棘殼中提取出硫酸多糖，確定其含有巖藻糖和硫酸基，并且對癌細胞具有一定的抑制增殖作用。

本實驗以蝦夷馬糞海膽生殖腺為原料，分離提取出一種均一多糖，并對其化學(xué)組成進行了深入研究，以期獲取這種海珍品多糖的結(jié)構(gòu)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蝦夷馬糞海膽（Strongylocentrotus intermedius），購自大連長興水產(chǎn)市場。

木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等 生工生物工程（上海）股份有限公司；氨基酸半乳糖、甘露糖 美國Sigma公司；乙醇、苯酚、氯仿、丙酮、濃硫酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀（配有SGD-300氮、氧、空發(fā)生器） 美國Agilent公司；高效液相色譜儀（配有ELSD 2000ES型蒸發(fā)光檢測器） 日本島津公司；UV-2100紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器公司；PE Frontier傅里葉變換紅外光譜儀 美國鉑金埃爾默公司；JJ200Y型精密電子天平 美國雙杰兄弟（集團）有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖的提取

取冷凍干燥后的海膽生殖腺干粉500 g，粉碎后加入與干粉等體積量的丙酮，不斷攪拌脫脂，棄去丙酮相并重新更換丙酮直至丙酮無色，棄去丙酮完成脫脂之后真空干燥除去殘余丙酮。脫脂后的干粉加入45 倍體積的水攪拌均勻，以6 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值為8.0，按干粉質(zhì)量分數(shù)加入2.5%的木瓜蛋白酶酶解，水解溫度50 ℃，時間2.5 h，之后迅速升溫至90 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫后調(diào)pH值至中性，4 000 r/min離心10 min，離心得到的沉淀部分再重復(fù)以上酶解操作，合并得到的上清液，然后加3 倍體積的95%乙醇，醇沉12 h，離心取沉淀，冷凍干燥。

1.3.2 蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖脫蛋白

本實驗采用兩步蛋白酶-Sevag（正丁醇加氯仿）的方法來脫除多糖中含有的蛋白質(zhì)[14]。

第一步蛋白酶-Sevag法脫蛋白：將冷凍干燥后的粗多糖配成質(zhì)量分數(shù)2.0%的水溶液，依次用胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶酶解（表1）去除多糖共價連接的蛋白質(zhì)，酶解后的酶解液采用Sevag法脫除游離蛋白。

表1 蛋白酶的水解條件Table1 Hydrolysis conditions for different proteases

第二步蛋白酶-Sevag法脫蛋白：為進一步脫除共價蛋白，采用鏈酶蛋白酶脫蛋白，將第一步脫蛋白后的海膽生殖腺粗多糖配成質(zhì)量分數(shù)5%的水溶液，按照樣品含量加入質(zhì)量分數(shù)2.0%的鏈酶蛋白酶，裝入透析袋中，0.15 mol/L NaCl溶液作激活劑，加少量二甲苯防腐，在37 ℃保溫24 h，換透析水4 次。酶解后取溶液按1∶1（V/V）加入Sevag試劑（V（氯仿）∶V（正丁醇）＝5∶1）[15-16]重復(fù)脫蛋白直到無游離蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止，上清液經(jīng)透析凍融離心后冷凍干燥。

1.3.3 蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖除糖原

取凍干后粗多糖加入去離子水配成5.0%的溶液，將溶液pH值調(diào)為6.8，空腹取2 mL唾液加入溶液，裝入透析袋，放入大燒杯中，0.9% NaCl溶液作激活劑，在37 ℃保溫6 h，每1 h更換透析水。之后自來水透析4 h，冷凍干燥。

1.3.4 蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖純化

分別采用DEAE-52、Sepharose CL-6B、Sephadex G-100色譜柱對粗多糖進行分離純化。將海膽粗多糖通過纖維素柱DEAE-52進行分離純化，依次采用去離子水及0.15、0.5 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，梯度時間為200 min，將粗多糖配成100 mg/mL的溶液上樣到DEAE-52分離柱中，用恒流泵調(diào)節(jié)流速為1 mL/min，每5 min收集1 管，以苯酚-硫酸法監(jiān)測并收集相同組分，相同組分多糖合并、透析、凍干得純化后多糖。得到的多糖組分再經(jīng)過Sepharose CL-6B、Sephadex G-100柱進一步分離純化，用0.15 mol/L NaCl溶液做流動相，恒流泵流速為0.25 mL/min，每12 min收集1 管，苯酚-硫酸法監(jiān)測并收集相同組分，相同組分多糖洗脫液經(jīng)合并、透析、冷凍干燥得到均一的SUGP。

1.3.5 SUGP的純度鑒定

SUGP的純度鑒定采用凝膠高效液相色譜法，取1 mg SUGP溶解于1 mL 超純水中，使其充分溶解，0.45 μm膜過濾，以高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析SUGP的純度。色譜條件：TSK-GEL G-4000PWXL柱（7.8 mm×300 mm），流動相為超純水，流速為0.2 mL/min；檢測器：ELSD 2000ES型蒸發(fā)光檢測器，漂移管溫度80 ℃；載氣為N2，流速為2.0 L/min。

1.3.6 SUGP分子質(zhì)量測定

采用Sepharose CL-6B凝膠柱（1.6 cm×80 cm）測定SUGP分子質(zhì)量，洗脫液為0.15 mol/L的NaCl溶液，流速0.18 mL/min。標液配制：將分子質(zhì)量分別為1×103、5×103、1.2×104、8×104、2.7×105、4.1×105D的標準葡聚糖分別溶于雙蒸水中，配制成1 mg/L的溶液，按分子質(zhì)量由小到大順序分別進樣，分離并收集，苯酚硫酸法跟蹤監(jiān)測糖含量，在490 nm波長處測定光密度值。以洗脫體積對分子質(zhì)量的對數(shù)進行線性回歸處理，求線性回歸方程[17]。

將精制多糖SUGP溶于雙蒸水中制成2 mg/mL的溶液，于相同條件下進樣分析，記錄洗脫體積，代入回歸方程求分子質(zhì)量。

1.3.7 SUGP的光譜鑒定

紫外光譜鑒定：將SUGP配成500 μg/mL的溶液，然后利用紫外分光光度計進行光譜掃描。

紅外光譜鑒定：將SUGP與KBr以1∶100（m/m）混合研細后，以KBr為本底，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描。

1.3.8 SUGP的組成分析

SUGP硫酸根含量的測定采用明膠比濁法[18]。SUGP糖醛酸含量的測定采用間羥基聯(lián)苯法[19]。SUGP氨基己糖含量的測定采用比色法[20]。

1.3.9 糖腈乙酸酯衍生化氣相色譜法[21-22]測單糖組成1.3.9.1 多糖的水解

準確稱取10 mg粗多糖或SUGP溶于2 mL 2 mol/L的三氟乙酸中，充N2密封，在100 ℃的條件下水解4 h，反復(fù)加甲醇并用N2吹干，得到水解產(chǎn)物備用。

1.3.9.2 單糖的衍生化

向水解產(chǎn)物中加入8 mg鹽酸羥胺、0.5 mL吡啶、1 mg肌醇，漩渦振蕩后，于90 ℃水浴鍋中加熱30 min，取出后冷卻至室溫，加入0.5 mL乙酸酐，在90 ℃恒溫水浴乙?；?0 min，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后注入氣相色譜進行分析；標準單糖用相同方法處理，并制成標準單糖衍生物混合液。

1.3.9.3 色譜條件

色譜柱：石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm)；升溫程序：0～5.00 min為130 ℃，然后以4 ℃/min的速率由130 ℃升至240 ℃，保持10 min，再以10 ℃/min的速率升至250 ℃；載氣（N2）流速2 mL/min，壓力171.8 kPa；進樣量為5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖的提取及脫蛋白

蝦夷馬糞海膽生殖腺干粉的蛋白質(zhì)含量高達49.21%，脂肪含量為17.4%，總糖含量為16.55%。表明海膽是一種高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)食品。蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖的提取率為8.73%。動物體中的多糖常與蛋白質(zhì)共價連接在一起，因而一般采用蛋白酶對其處理以利于多糖的提取。再結(jié)合Sevag法脫除游離蛋白質(zhì)，此方法不僅能有效脫除蛋白質(zhì)，同時也能較好地保留多糖[23]。經(jīng)過此方法處理后多糖樣品中蛋白質(zhì)含量為3.54%，總糖含量為40.36%。

2.2 蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖的純化

經(jīng)過脫糖原處理后的蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖再以DEAE-52柱進行分離，結(jié)果如圖1所示。海膽生殖腺粗多糖在15 管左右已經(jīng)被全部洗脫出來了，說明海膽生殖腺粗多糖可能帶有一定量的正電荷，DEAE-52柱并未起到多糖分離作用，但可以除去一些雜蛋白等雜質(zhì)。收集多糖組分分別用Sepharose CL-6B、Sephadex G-100柱進行下一步純化，結(jié)果如圖2所示。Sepharose CL-6B（圖2a）和Sephadex G-100（圖2b）層析圖出現(xiàn)的大峰基本相似，只是出峰時間有差別，但從Sepharose CL-6B的層析圖可以看出在20～25 管有很小的峰，因此以Sepharose CL-6B分離純化海膽生殖腺粗多糖。收集分離純化得到的糖含量最高的組分進行透析，冷凍干燥得海膽生殖腺多糖SUGP。

圖1 粗多糖在DEAE-52陰離子柱上的洗脫曲線Fig.1 Chromatogram of crude polysaccharides on DEAE-52 column

圖2 粗多糖的洗脫曲線Fig.2 Further chromatogram of polysaccharides eluted from DEAE-52 column

圖3 HPLC法鑒定SUGP純度Fig.3 HPLC prof i le of SUGP

2.3 SUGP的純度鑒定及分子質(zhì)量如圖3所示，SUGP的HPLC圖譜中出現(xiàn)單一的峰，出峰時間較晚，證明SUGP為一分子質(zhì)量較小且純度較高的多糖。測定SUGP的分子質(zhì)量為4 436 D。

2.4 SUGP紫外分光光度計光譜鑒定

圖4 SUGP的紫外光譜圖Fig.4 UV spectrum of SUGP

SUGP水溶液的紫外光譜如圖4，在260、280 nm波長附近曲線平坦，幾乎沒有核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰，說明樣品中的蛋白質(zhì)含量很低[24]。

2.5 SUGP紅外光譜鑒定

圖5 SUGP紅外光譜圖Fig.5 IR spectrum of SUGP

SUGP的紅外光譜圖如圖5所示，在3 393.6、1 027.9 cm-1波數(shù)附近有強吸收，表示有-OH的O-H鍵伸縮振動和變角振動；2 934.5、1 417.2 cm-1波數(shù)附近有吸收，分別示有C-H鍵的伸縮振動和變角振動，均為多糖的特征吸收峰；1 658.8 cm-1波數(shù)附近有中強吸收，可能是C＝O鍵的伸縮振動，或是酰胺鍵中N-H鍵的變角振動；1 260 cm-1波數(shù)附近有很小的吸收峰，說明-OSO3-基團含量很少[25]。

2.6 SUGP組成分析

經(jīng)測定，SUGP中總糖、蛋白質(zhì)、硫酸根、糖醛酸、氨基半乳糖、氨基葡萄糖的含量分別為46.25%、2.85%、1.32%、2.16%、4.05%、10.80%。SUGP中測得的硫酸根和糖醛酸數(shù)值很小，結(jié)合紅外光譜分析SUGP中應(yīng)該不含有這兩種官能團，而SUGP中氨基葡萄糖含量較高。

2.7 蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖及SUGP單糖組成分析

7 種標準單糖氣相色譜圖見圖6，未知樣品的單糖組成按標準單糖保留時間進行定性。未脫糖原前樣品中的單糖組成見圖7，圖7中1、2號兩個峰分別是甘露糖和葡萄糖，根據(jù)峰面積積分計算其物質(zhì)的量之比為1.3∶37.2。因此海膽生殖腺粗多糖中葡萄糖含量遠遠高于甘露糖，推測粗多糖中含有大量糖原，因此提取過程中采用了唾液淀粉酶對蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖進行脫糖原處理。

圖6 標準單糖糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜圖Fig.6 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives of monosaccharide standards

圖7 未脫糖原前粗多糖糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜圖Fig.7 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives of crude polysaccharide with glycogen

圖8 脫糖原后糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜圖Fig.8 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives of purif i ed polysaccharide without glycogen

海膽生殖腺粗多糖經(jīng)脫糖原并以色譜柱分離純化后得到SUGP，其葡萄糖峰消失，僅剩甘露糖（圖8），這也證實粗多糖中含有大量的糖原，因此證明蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖是由多聚甘露糖和糖原鏈接構(gòu)成。經(jīng)實驗測得1 g粗多糖脫糖原后得到52.4 mg純多糖。

3 結(jié) 論

本實驗通過水酶法提取蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖，提取得到的粗多糖含有甘露糖和葡萄糖，其物質(zhì)的量比為1.3∶37.2，粗多糖經(jīng)過脫糖原處理后只含有甘露糖，說明蝦夷馬糞海膽生殖腺多糖結(jié)構(gòu)是由多聚甘露糖與糖原相連接而構(gòu)成。蝦夷馬糞海膽生殖腺粗多糖經(jīng)過進一步分離純化后得到均一多糖SUGP，對SUGP進一步進行了分子質(zhì)量測定，硫酸根、糖醛酸、氨基葡萄糖含量測定和光譜鑒定。本實驗對SUGP理化性質(zhì)和單糖組成做了初步鑒定，有關(guān)其結(jié)構(gòu)及活性有待于進一步研究。

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Extraction, Purif i cation and Identif i cation of Polysaccharide from the Gonad of the Sea Urchin Strongylocentrotus intermedius

CAO Yue-gang, ZHAO Jun, CHEN Hong-yu, CHEN Ning, TIAN Heng, HE Dong-mei, YANG Jing-feng*
(National Engineering Research Center of Seafood, School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

A water-soluble polysaccharide (SUGP) from the gonad of the sea urchin Strongylocentrotus intermedius was obtained and its structural characteristics were elucidated. SUGP was isolated by protease-assisted aqueous extraction, precipitated with ethanol, deproteinized by the Sevag method, further treated with alpha-amylase for the removal of glycogen, and fi nally purif i ed with gel fi ltration chromatography. The structural characteristics of SUGP were determined by IR spectroscopy, ultraviolet spectroscopy and high performance liquid chromatography. The results showed that SUGP was a homogeneous polysaccharide with average molecular weight of 4 436 D and contained only mannose. Alpha-amylase eliminated the glycogen present in SUGP, so that producing a purif i ed polysaccharide composed of only mannose, indicating that the sea urchin polysaccharide is a glucomannan that is constructed with polymanna conjugated to glycogen.

sea urchin gonad; polysaccharide; polymanna; glycogen

Q538

A

1002-6630（2014）21-0016-05

10.7506/spkx1002-6630-201421004

2014-01-07

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31301430）

曹月剛（1988—），男，碩士，研究方向為水產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：cyg549886642@126.com

*通信作者：楊靜峰（1979—），男，講師，博士，研究方向為糖化學(xué)與糖生物學(xué)。E-mail：42717505@qq.com