食品過敏原澳洲堅果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立與應(yīng)用

劉 津，張 雋，李 婷，張 璜，高東微，李志勇,*

（1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣州迪澳生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

食品過敏原澳洲堅果環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立與應(yīng)用

劉 津1，張 雋1，李 婷1，張 璜2，高東微1，李志勇1,*

（1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣州迪澳生物科技有限公司，廣東 廣州 510663）

根據(jù)澳洲堅果豌豆蛋白AMP2基因序列，利用設(shè)計軟件Primer Explorer Version 4設(shè)計并篩選了食品過敏原澳洲堅果的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增引物，對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立澳洲堅果的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法，結(jié)果判斷可采用實(shí)時熒光法和熒光染料終點(diǎn)顯色法。對該方法進(jìn)行了特異性、靈敏度、穩(wěn)定性評價，結(jié)果顯示：該方法能夠特異性、靈敏、穩(wěn)定地檢測食品中的澳洲堅果成分，檢測低限為0.5%。此外，對7 種市售食品樣品的檢測結(jié)果表明，該方法與食品標(biāo)簽標(biāo)示的過敏原成分結(jié)果吻合率為100%，假陽性率和假陰性率均為0，在市售食品的過敏原成分檢測上較商業(yè)化快速檢測試紙條更加穩(wěn)定可靠。

食品過敏原；澳洲堅果；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；檢測方法

澳洲堅果（Macadamia ternifolia），又名夏威夷果、澳洲胡桃、昆士蘭栗，為山龍眼科澳洲堅果屬植物。澳洲堅果果仁，呈奶白色，營養(yǎng)豐富，除了用于制作干果外，還可制作糕點(diǎn)、巧克力等[1-2]。澳洲堅果引起的過敏癥狀包括嘴唇、眼睛、喉嚨充血紅腫、蕁麻疹、結(jié)膜炎和呼吸困難等[3]，是食品過敏原標(biāo)識管理的重要種類。國際食品法典委員會制定的國際標(biāo)準(zhǔn)CODEX STAN 1-1985《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》明確規(guī)定了澳洲堅果及其產(chǎn)品必須在預(yù)包裝食品標(biāo)簽上予以標(biāo)識[4]。在國際標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，世界各國紛紛頒布了各自的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，對澳洲堅果這種過敏原成分的標(biāo)識管理進(jìn)行了詳細(xì)的規(guī)定[5-6]。我國在各級食品標(biāo)準(zhǔn)中也做出了相關(guān)規(guī)定，例如GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》、GB/T 23779—2009《預(yù)包裝食品中的致敏原成分》等均對此有明確的規(guī)定[7-8]。

食品過敏原標(biāo)識管理的有效實(shí)施，依賴于完善的監(jiān)控技術(shù)手段。其中，食品過敏原檢測技術(shù)是必不可少的一個組成部分。特別是進(jìn)出口食品檢驗(yàn)方面，我國主要貿(mào)易國家對過敏原標(biāo)識管理的日趨嚴(yán)格，對檢測技術(shù)提出了迫切的現(xiàn)實(shí)需求。但是，目前為止國內(nèi)外尚未發(fā)布澳洲堅果過敏原成分的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，澳洲堅果過敏原檢測技術(shù)研究的文獻(xiàn)也鮮有報道，國外對澳洲堅果的檢測通常采用一種商業(yè)化過敏原蛋白質(zhì)免疫層析快速檢測技術(shù)，國內(nèi)對澳洲堅果尚未建立任何達(dá)到行業(yè)應(yīng)用水平的通用方法。這種現(xiàn)狀已經(jīng)嚴(yán)重影響了過敏原標(biāo)識管理相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)有效實(shí)施。因此，在預(yù)包裝食品過敏原檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，目前急需制定更加普適、簡便、準(zhǔn)確、成本低廉的澳洲堅果過敏原檢測方法，使之適用于食品企業(yè)品質(zhì)安全檢驗(yàn)和進(jìn)出口食品實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

目前食品過敏原檢測的方法主要分為兩大類，一類是基于蛋白質(zhì)檢測的方法，一類是基于基因檢測的方法。然而，現(xiàn)有研究結(jié)果表明食品過敏原中能夠引起過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)組成復(fù)雜，澳洲堅果中存在的過敏原蛋白質(zhì)組成尚未完全調(diào)查清楚，因此以某種過敏原蛋白質(zhì)為檢測目標(biāo)物質(zhì)建立的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)得到的檢測結(jié)果存在與實(shí)際致敏效應(yīng)發(fā)生偏差的可能性；基于免疫學(xué)原理的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)對檢測樣品提取物的背景干擾具有較高的要求，與此同時由于預(yù)包裝食品種類、配料成分、加工工藝千差萬別造成背景干擾非常復(fù)雜，極大局限了澳洲堅果過敏原蛋白質(zhì)免疫檢測方法的實(shí)際應(yīng)用效果[9]。此外，相對于核酸而言，澳洲堅果過敏原蛋白質(zhì)容易在食品加工過程中發(fā)生變性，對基于免疫學(xué)原理的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)造成不可忽略的性能下降。相比之下，基于基因檢測的方法以食品過敏原的特異性基因片段為檢測對象，通過食品中是否存在過敏原所屬物種的保守基因片段判斷是否含有某種特定的過敏原成分。由于核酸的穩(wěn)定程度比蛋白質(zhì)高，在食品加工過程中不易被破壞，因此這類技術(shù)可以更加穩(wěn)定地檢測出微量的過敏原成分[10]。

現(xiàn)有常用的基因檢測方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），但是PCR技術(shù)需要使用大型的儀器設(shè)備、耗時長、對技術(shù)要求高、成本昂貴，并不適用于基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法是2000年由Notomi等發(fā)明的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法[11]。LAMP技術(shù)發(fā)展至今，既可采用熒光染料終點(diǎn)顯色法，利用SYBR GREEN Ⅰ等熒光染料可嵌合到擴(kuò)增產(chǎn)物中，發(fā)生顯著的顏色變化，可用肉眼進(jìn)行顏色判斷；又可采用實(shí)時熒光LAMP法，通過使用高精度的實(shí)時熒光儀對LAMP反應(yīng)的過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控[12-14]。目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)在食品安全、公共衛(wèi)生安全監(jiān)測和應(yīng)急檢測、臨床醫(yī)學(xué)診斷、生物安全、生物識別等專業(yè)技術(shù)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用[15-18]。本實(shí)驗(yàn)以澳洲堅果AMP2豌豆球蛋白基因?yàn)槟康幕?，建立能夠特異、靈敏、穩(wěn)定地檢測食品中的澳洲堅果成分的LAMP檢測方法，并且能夠同時用實(shí)時熒光法和熒光染料終點(diǎn)顯色法進(jìn)行判斷，既能應(yīng)用于大中型實(shí)驗(yàn)室，又能應(yīng)用于基層快速大規(guī)模篩查。

1 材料與方法

1.1 樣品種類及來源

澳洲堅果（Macadamia ternifolia）、巴西堅果（Bertholletia excelsa）、開心果（Pistacia vera）、核桃（Juglans regia）、碧根果（Carya illinoensis (Wangh.) koch）、腰果（Anacardium occidentalie）、松籽（Pinus koraiensis）、榛子（Corylus avellana）、美國大杏仁（Amygdalus communis）、葵花籽（Helianthus annuus）、板栗（Castanea mollissima）、苦杏仁（Semen Armeniacae Amarum）、南瓜籽（Cucurbita moschata）、蓮子（Semen Nelumbinis）和大米（Oryza sativa） 市購。

1.2 試劑與儀器

Promega Wizard?基因組DNA純化試劑盒 北京盈田卓越科技有限公司；Ex Taq和dNTPs購自寶生物工程（大連）有限公司；甜菜堿、Bst DNA聚合酶和10× ThermoPol緩沖液 德國Sigma公司；1 000× SYBR GreenⅠ 廈門致善生物科技有限公司；SYTO-9 美國Invitrogen公司；LAMP引物由上海生工生物工程有限公司合成；r-biopharm?澳洲堅果快速檢測試紙條（BL 605） 拜發(fā)分析系統(tǒng)銷售（北京）有限公司。

1000核酸蛋白分析儀 美國Nanodrop科技有限公司；ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；恒溫金屬浴 杭州奧盛儀器有限公司；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的提取和純化

根據(jù)GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測：核酸提取純化方法》規(guī)定[19]，采用標(biāo)準(zhǔn)方法從供試材料中提取植物基因組DNA，用核酸蛋白分析儀測定DNA的濃度和純度，將DNA溶液稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。對提取出的植物基因組DNA用植物通用引物Plant 159進(jìn)行檢測[20]，檢測結(jié)果陽性表明提取出適宜進(jìn)行擴(kuò)增的DNA，否則應(yīng)重新進(jìn)行DNA提取和純化。

1.3.2 引物的設(shè)計與篩選

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中澳洲堅果AMP2豌豆球蛋白基因（Macadamia integrifolia vicilin precursor (AMP2)，Accession no. AF161883.1）序列，通過BLAST在線比對軟件進(jìn)行分析，在澳洲堅果序列的種特異性區(qū)域，利用LAMP引物在線設(shè)計軟件Primer Explorer Version 4分別設(shè)計包括兩條外引物F3、B3、兩條內(nèi)引物FIP、BIP的LAMP引物各3 套，由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)引物的擴(kuò)增效果選取最佳的引物后，使用Primer Explorer Version 4設(shè)計環(huán)引物。在LAMP反應(yīng)的循環(huán)延伸階段，所有的莖環(huán)DNA與內(nèi)引物或環(huán)引物結(jié)合，引導(dǎo)鏈置換延伸反應(yīng)，可加快反應(yīng)速度，縮短近一半的反應(yīng)時間，提高檢測效率。

1.3.3 LAMP反應(yīng)體系的建立

根據(jù)文獻(xiàn)[11]，初步確定25 μL的LAMP反應(yīng)體系：內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，環(huán)引物L(fēng)F和LB各0.8 μmol/L，1×ThermoPol緩沖液，1mol/L甜菜堿，6 mmol/L MgSO4，1.6 mmol/L dNTP，0.32 U/μL Bst DNA聚合酶，DNA模板200 ng。將LAMP反應(yīng)體系配制完成后置于0.2 mL離心管中，在離心管中加入1 滴石蠟油以避免反應(yīng)體系揮發(fā)和污染。

LAMP反應(yīng)可采用兩種結(jié)果判讀方法，一是熒光染料顯色法，二是實(shí)時熒光法。

熒光染料顯色法是在上述管蓋內(nèi)壁加入1 μL 1 000×SYBR GreenⅠ。蓋管蓋時應(yīng)小心，防止顯色液混合進(jìn)入反應(yīng)液中。然后將其置于金屬浴在63 ℃恒溫反應(yīng)90 min，最后80 ℃滅活5 min結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管上下顛倒混勻或離心，使蓋內(nèi)壁的SYBR GreenⅠ與反應(yīng)液混合，觀察離心管中反應(yīng)液顏色。如發(fā)生特異性擴(kuò)增，溶液變?yōu)榫G色，否則保持SYBR GreenⅠ橙色不變。

實(shí)時熒光法是在反應(yīng)體系中加入0.2 ?mol/L SYTO-9，通過實(shí)時熒光PCR儀設(shè)定Holding Stage為63℃、30 s，1 個循環(huán)；Cycling Stage為63 ℃、15 s，63 ℃、45 s，90個循環(huán)，于63℃、45 s處收集熒光信號，熒光通道為FAM。

1.3.4 LAMP引物的篩選

用澳洲堅果DNA作為模板，用大米DNA作為陰性對照，每組對照分別設(shè)置2 個平行，通過實(shí)時熒光法檢測LAMP反應(yīng)。通過觀察實(shí)時熒光的擴(kuò)增曲線，根據(jù)起始擴(kuò)增時間、擴(kuò)增曲線的重復(fù)性等指標(biāo)對引物進(jìn)行篩選。

1.3.5 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[11]報道，反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、鎂離子濃度、甜菜堿濃度和dNTPs濃度是影響LAMP擴(kuò)增效果的重要因素。由于Bst DNA聚合酶最適溫度在61～65 ℃，本實(shí)驗(yàn)選取61、62、63、64 ℃和65 ℃ 5個溫度條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)，通過實(shí)時熒光法檢測LAMP反應(yīng)，選取適宜的溫度。在適宜的溫度條件下，依次對Mg2+、甜菜堿和dNTPs濃度和反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化，其中Mg2+選取2、4、6、8、10 mmol/L 5 個濃度梯度，甜菜堿選取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L 5 個濃度梯度，dNTPs選取0.8、1.2、 1.6、2.0、2.4 mmol/L 5 個濃度梯度。通過實(shí)時熒光法檢測LAMP反應(yīng)，確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.3.6 特異性實(shí)驗(yàn)

高度特異性是過敏原檢測方法必須具備的基本特性，為此利用建立的LAMP方法對澳洲堅果、腰果、花生、巴西堅果、碧根果、杏仁、開心果、葵瓜子、板栗、榛子、核桃、南杏、北杏、松子、南瓜子、西瓜子、蓮子共17 種常見的堅果進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，同時采用顯色法和實(shí)時熒光法進(jìn)行檢測。

1.3.7 靈敏度實(shí)驗(yàn)

為確定本方法的相對靈敏度，用100 ng/μL的大米DNA為基質(zhì)，用100 ng/μL的澳洲堅果DNA按照體積比制成不同梯度濃度（0%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%）的澳洲堅果模擬樣品DNA，用不同濃度梯度的模擬樣品DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，每個梯度濃度設(shè)置2 個平行，用實(shí)時熒光法和顯色法同時進(jìn)行靈敏度測試。

1.3.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為評估本方法的穩(wěn)定性，對0.5%、1%、5%的澳洲堅果模擬樣品DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，每個濃度分別采用實(shí)時熒光法和顯色法重復(fù)10 次，同時以0%的澳洲堅果模擬樣品DNA作為陰性對照，用以測試本方法的穩(wěn)定性。

1.3.9 適用性實(shí)驗(yàn)

利用建立的LAMP方法對共計7 份進(jìn)口商品和市售商品進(jìn)行檢測，同時采用商業(yè)化快速檢測試紙條進(jìn)行檢測，兩種方法進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP引物篩選

本研究針對澳洲堅果AMP2豌豆球蛋白基因設(shè)計了3 套LAMP檢測引物，通過LAMP反應(yīng)實(shí)時熒光法結(jié)果顯示，第1套引物出現(xiàn)對數(shù)擴(kuò)增時間分別為70 min和80 min，第2套引物出現(xiàn)對數(shù)擴(kuò)增時間約為35 min，兩個平行重復(fù)性較好，3 套引物出現(xiàn)對數(shù)擴(kuò)增時間約為40 min。因此，選取第2套引物進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)，為了增加擴(kuò)增效率，引入環(huán)引物一對，最佳引物序列見表1。

表1 澳洲堅果LAMP擴(kuò)增引物序列Table 1 The primers for LAMP assay of macadamia nut

2.2 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

以澳洲堅果DNA為模板，利用設(shè)計的引物在不同溫度條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)，實(shí)時熒光法檢測LAMP反應(yīng)的結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為63 ℃時出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的時間最早，因此選取63 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖1 不同反應(yīng)溫度澳洲堅果LAMP檢測結(jié)果圖（實(shí)時熒光法）Fig.1 RT-LAMP detection of macadamia nut at different reaction temperatures

2.2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化

以澳洲堅果DNA為模板，在反應(yīng)溫度為63 ℃的條件下，依次對Mg2+、甜菜堿和dNTPs濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖2～4。

圖2 不同鎂離子濃度澳洲堅果LAMP檢測結(jié)果圖（實(shí)時熒光法）Fig.2 RT-LAMP detection of macadamia nut with different Mg2＋concentrations

圖3 不同甜菜堿濃度澳洲堅果LAMP檢測結(jié)果圖（實(shí)時熒光法）Fig.3 RT-LAMP detection of macadamia nut with different betaine concentrations

選取最早出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增曲線的反應(yīng)體系濃度為最佳濃度，由圖2～4可知，在25 μL反應(yīng)體系中，當(dāng)Mg2+濃度為6 mmol/L、甜菜堿濃度為0.8 mol/L、dNTPs濃度為1.6 mmol/L，在63 ℃反應(yīng)45 min，LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效果最好。

圖4 不同dNTPs濃度澳洲堅果LAMP檢測結(jié)果圖（實(shí)時熒光法）Fig.4 RT-LAMP detection of macadamia nut with different concentrations of dNTPs

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

利用建立的LAMP方法對澳洲堅果及其他16 種堅果進(jìn)行特異性擴(kuò)增。實(shí)時熒光法和顯色法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖5和圖6。

圖5 澳洲堅果LAMP檢測方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（實(shí)時熒光法）Fig.5 Specificity of the RT-LAMP assay for macadamia nut

圖6 澳洲堅果LAMP檢測方法特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（熒光染料顯色法）Fig.6 Specificity of the LAMP assay using fluorescent dye for macadamia nut

由圖5可知，澳洲堅果LAMP檢測實(shí)時熒光法僅澳洲堅果出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其他堅果均未出現(xiàn)擴(kuò)增；澳洲堅果LAMP檢測熒光染料顯色法僅以澳洲堅果DNA為模板的反應(yīng)管，在反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green Ⅰ熒光染料顯色為綠色，以其他堅果DNA為模板的反應(yīng)管均顯示為黃色，且2 個平行管中的反應(yīng)無差異。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP方法對澳洲堅果具有高度的特異性。

2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

實(shí)時熒光法和熒光染料顯色法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖7和圖8，可知LAMP實(shí)時熒光法和熒光染料顯色法均可檢出100%、10%、5%、1%、0.5%的澳洲堅果陽性樣品，不能檢出0.1%和0.05%的陽性樣品。LAMP實(shí)時熒光法的檢測結(jié)果顯示巴西堅果濃度越高，開始出現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增的時間越短，Ct值越小。靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本標(biāo)準(zhǔn)檢測方法對澳洲堅果的最低檢測限可達(dá)0.5%。

圖7 澳洲堅果LAMP檢測方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（實(shí)時熒光法）Fig.7 Sensitivity of the RT-LAMP assay for macadamia nut

圖8 澳洲堅果LAMP檢測方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（顯色法）Fig.8 Sensitivity of the LAMP assay using fluorescent dye for macadamia nut detection method

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表2顯示：澳洲堅果LAMP檢測方法對0%、0.5%、1%和5%的澳洲堅果樣品進(jìn)行10 次重復(fù)檢測，在不同濃度和各次重復(fù)中均能得到準(zhǔn)確穩(wěn)定的檢測結(jié)果，假陽性率和假陰性率均為0，表明本方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。注：+.陽性；—.陰性。

表2 澳洲堅果LAMP檢測方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Stability of the LAMP assay for macadamia nut

2.6 適用性實(shí)驗(yàn)

實(shí)際樣品的檢測結(jié)果見表3、圖9～11。

表3 澳洲堅果LAMP檢測方法適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Applicability of the LAMP assay for macadamia nut

圖9 澳洲堅果LAMP檢測方法適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（實(shí)時熒光法）Fig.9 Applicability of the RT-LAMP assay for macadamia nut

圖10 澳洲堅果LAMP檢測方法適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（顯色法）Fig.10 Applicability of the LAMP assay using fluorescent dye for macadamia nut

圖11 澳洲堅果快速檢測試紙條適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.11 Applicability of rapid test strips for macadamia nut

澳洲堅果LAMP檢測實(shí)時熒光法和熒光染料顯色法的檢測結(jié)果與配料表中所標(biāo)識的澳洲堅果是否存在的實(shí)際情況完全一致，假陽性率和假陰性率均為0?？焖贆z測試紙條在檢測樣品1和2時均出現(xiàn)了弱陽性，檢測結(jié)果較難判斷。相比而言，本實(shí)驗(yàn)建立的澳洲堅果LAMP檢測方法在檢測樣品1和2時，實(shí)時熒光法顯示樣品1和2出現(xiàn)了指數(shù)擴(kuò)增，熒光染料顯色法顯示樣品1和2均為陽性，且2個平行管結(jié)果一致，陽性結(jié)果易于判斷。

適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的澳洲堅果LAMP檢測方法可用于預(yù)包裝食品中澳洲堅果的檢測，在檢測市售食品樣品時，特別是食品中含有低濃度澳洲堅果成分時，性能較商業(yè)化快速檢測試紙條更佳。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)建立的澳洲堅果LAMP檢測方法該方法能夠特異、靈敏、穩(wěn)定地檢測食品中的澳洲堅果成分，檢測低限為0.5%，可采用實(shí)時熒光法和熒光染料終點(diǎn)顯色法兩種方法進(jìn)行檢測。實(shí)時熒光法的優(yōu)點(diǎn)在于可通過使用高精度的實(shí)時熒光儀對LAMP反應(yīng)的過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，尤其是在方法建立時優(yōu)勢突出，例如在引物篩選、反應(yīng)條件和反應(yīng)體系優(yōu)化時，可以通過擴(kuò)增曲線直觀的分辨出指數(shù)擴(kuò)增出現(xiàn)的時間遲早和效率高低，從而進(jìn)行引物篩選和反應(yīng)優(yōu)化，大大提高了LAMP技術(shù)的靈敏性和準(zhǔn)確性；實(shí)時熒光法的缺點(diǎn)在于需要使用大型的儀器設(shè)備，對實(shí)驗(yàn)室硬件配置要求較高。熒光染料終點(diǎn)顯色法的特點(diǎn)在于利用SYBR GREEN Ⅰ等熒光染料可嵌合到擴(kuò)增產(chǎn)物中，發(fā)生顯著的顏色變化，突出的優(yōu)點(diǎn)是通過反應(yīng)終點(diǎn)的顏色變化進(jìn)行結(jié)果判斷，無需使用大型的儀器設(shè)備，可在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用，也可用于現(xiàn)場檢測；缺點(diǎn)是高濃度的熒光染料對LAMP反應(yīng)具有抑制作用，因此擴(kuò)增-檢測需要分步進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作上與實(shí)時熒光法相比需要額外在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時加入熒光染料，稍顯不便。本實(shí)驗(yàn)建立的澳洲LAMP檢測方法可采用上述兩種方法進(jìn)行檢測，兩種方法互為補(bǔ)充，可有效地對食品中澳洲堅果過敏原成分進(jìn)行檢測和監(jiān)控，能夠極大的滿足業(yè)務(wù)需要。

經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，國內(nèi)外均未發(fā)布澳洲堅果過敏原成分的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，關(guān)于澳洲堅果過敏原成分檢測技術(shù)也鮮有報道，國外對澳洲堅果的檢測通常采用一種商業(yè)化過敏原蛋白質(zhì)免疫層析檢測試紙條，因此，在適用性實(shí)驗(yàn)部分將本實(shí)驗(yàn)建立的澳洲堅果LAMP檢測方法與該方法進(jìn)行了性能比較，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)建立的方法性能較佳。原因可能有3 個方面：第1，由于食品樣品中澳洲堅果含量低且分布不均勻影響了檢測結(jié)果；第2，檢測對象不同影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，LAMP技術(shù)的檢測對象是核酸，而蛋白質(zhì)免疫層析檢測試紙條的檢測對象為蛋白質(zhì)，由于在加工過程中澳洲堅果核酸的穩(wěn)定程度比蛋白質(zhì)高，因此本實(shí)驗(yàn)建立的方法可以更加穩(wěn)定的檢測出微量的過敏原成分；第3，商業(yè)化過敏原蛋白質(zhì)免疫層析檢測試紙條對檢測樣品提取物的背景干擾具有較高的要求，由于食品類別、配料、加工工藝不同造成背景干擾非常復(fù)雜，對免疫檢測方法的檢測效果造成了負(fù)面影響。此外，澳洲堅果免疫層析檢測試紙條為國外商業(yè)化試劑產(chǎn)品，價格昂貴，且訂貨期長，相比而言，本實(shí)驗(yàn)建立的澳洲堅果LAMP檢測方法只需合成引物和配制試劑即可建立檢測方法，檢測試劑成本低廉，且無需昂貴的儀器設(shè)備，更加適合基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

[1] 劉建福, 黃莉. 澳洲堅果的營養(yǎng)價值及其開發(fā)利用[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2005(2): 25-26.

[2] 杜麗清, 鄒明宏, 曾輝, 等. 澳洲堅果果仁營養(yǎng)成分分析[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2010, 32(1): 95-96.

[3] de KNOP K J, HAGENDORENS M M, BRIDTS C H, et al. Macadamia nut allergy: 2 case reports and a review of the literature[J]. Acta Clinica Belgica, 2010, 65(2): 129-132.

[4] Codex Almentarius Commission. CODEX STAN 1-1985 General standard for the labelling of prepackaged foods[S].

[5] The commission of the European Communities. Commission directive 2007/68/EC of 27 November 2007 amending annex IIIa to directive 2000/13/EC of the European parliament and of the council as regards certain food ingredients[S].

[6] U.S. the Food and Drug Administration. Public law 108-282 the food allergen labeling and consumer protection act[S].

[7] 衛(wèi)生部. GB 7718—2011 預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2011.

[8] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T 23779—2009 預(yù)包裝食品中的致敏原成分[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2009.

[9] KENNETH H R, SUZANNE S T, SHRIDHAR K S. Tree nut allergen[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2003, 131(4): 234-244.

[10] 劉中勇, 高東微. 預(yù)包裝食品致敏原標(biāo)識、檢測和生產(chǎn)控制指南[M].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2011: 103-111; 118-126.

[11] TOMITA N, MORI Y, KANDA H, et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)of gene sequences and simple visual detection of products[J]. Nature Protocols, 2008, 3(5): 877-882.

[12] MORI Y, KITAO M, TOMITA N. Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2004, 59: 145-157.

[13] HILL J, BERIWAL S, CHANDRA I, et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of common strains of Escherichia coli[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2008, 46(8): 2800-2804.

[14] LIU Dayu, LIANG Guangtie, ZHANG Qiong. Detection of mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and and fluorescence detection[J]. Analytical Chemistry, 2013, 85(9): 4698-4704.

[15] GOTO M, HONDA E, OGURA A, et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue[J]. Biotechniques, 2009, 46(3): 167-172.

[16] NJIRU Z K, YEBOAH-MANU D, STINEAR T P, et al. Rapid and sensitive detection of Mycobacterium ulcerans by use of a loop-mediated isothermal amplification test[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2012, 50(5): 1737-1741.

[17] BüHLMANN A, POTHIER J F, REZZONICO F, et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight[J]. Journal of Microbiological Methods, 2013, 92(3): 332-339.

[18] MAHONY J, CHONG S, BULIR D, et al. Development of a sensitive loop-mediated isothermal amplification assay that provides specimen-toresult diagnosis of respiratory syncytial virus infection in 30 minutes[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2013, 51(8): 2696-2701.

[19] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T 19495.3—2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測: 核酸定性PCR檢測方法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2007.

[20] HAN Jianxun, WU Yajun, HUANG Wensheng, et al. PCR and DHPLC methods used to detect juice ingredient from 7 fruits[J]. Food Control, 2012, 25(2): 696-703.

Construction and Application of Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Detection of Macadamia Nut as a Food Allergen

LIU Jin1, ZHANG Jun1, LI Ting1, ZHANG Huang2, GAO Dong-wei1, LI Zhi-yong1,*
(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510623, China; 2. Guangzhou Di Ao Bio-Technology Co. Ltd., Guangzhou 510663, China)

According to the Macadamia integrifolia vicilin precursor AMP2 gene sequences, sets of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primers were designed and screened using the design software Primer Explorer Version 4, then the relevant LAMP method was established for the detection of macadamia nuts as a food allergen by measuring the results using real-time fluorescence or using a fluorescent dye in the reaction end. An evaluation of this method indicated the satisfied specificity, sensitivity and stability in the identification of macadamia nuts from foods with a LOD of 0.5%. In addition, the detection of 7 marketed food samples using this method showed 100% consistency with the labeled information of allergen ingredients with zero false positive and negative rates, and thus, proved its better performances than commercial rapid test strips.

food allergen; macadamia nut; loop-mediated isothermal amplification (LAMP); detection method

TS255.6

A

1002-6630（2014）22-0226-07

10.7506/spkx1002-6630-201422044

2013-11-17

出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定計劃項目（2012B141）

劉津（1983—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称贩肿由飳W(xué)檢測。E-mail：ivfhonline@126.com

*通信作者：李志勇（1972—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩蜋z測。E-mail：lizy@iqtc.cn