基于電子舌技術(shù)檢測商業(yè)果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌

李二虎，馮佳潔，許 燦，潘思軼*

（環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

基于電子舌技術(shù)檢測商業(yè)果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌

李二虎，馮佳潔，許 燦，潘思軼*

（環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

采用法國Alpha M.O.S.公司生產(chǎn)的α-Astree Ⅱ型電子舌對7 種市售果汁飲料及其接種脂環(huán)酸芽孢桿菌樣品進行測定，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用主成分分析法進行辨別分析。2 種含乳類果汁飲料未能被區(qū)分開，其他5 種樣品均可區(qū)分。將電子舌可區(qū)分的6 種果汁飲料接種兩株脂環(huán)酸芽孢桿菌并在45 ℃條件下培養(yǎng)30 d，所有接種處理中均可檢出脂環(huán)酸芽孢桿菌。3 種渾濁型飲料的檢出量較多，大于103CFU/mL。3 種澄清型飲料的檢出量較少，小于103CFU/mL。應(yīng)用電子舌技術(shù)可將6 種接種脂環(huán)酸芽孢桿菌DSM 3922的果汁飲料與對照組區(qū)分開，4 種接種脂環(huán)酸芽孢桿菌XC-6的果汁飲料與對照組區(qū)分開，2 種接種脂環(huán)酸芽孢桿菌XC-6的混合果汁飲料和橙汁飲料同對照組未能被區(qū)分。

脂環(huán)酸芽孢桿菌；果汁飲料；電子舌；主成分分析

脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus sp.）是飲料加工中常見的非致病污染性微生物[1-2]，由于該菌代謝不會明顯改變飲料酸度且不產(chǎn)生氣體，在飲料生產(chǎn)和銷售環(huán)節(jié)很難被檢測[3]。脂環(huán)酸芽孢桿菌生成芽孢，經(jīng)過傳統(tǒng)的巴氏殺菌很難完全滅活[4]。在蘋果汁[5-6]、橙汁[7]、番茄汁[8]等各類果汁中都出現(xiàn)過污染脂環(huán)酸芽孢桿菌的報道。其代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚和鹵酚等質(zhì)量濃度超過21 μg/L就會使果汁產(chǎn)生類似藥水的味道，嚴重影響果汁加工產(chǎn)品的質(zhì)量[9-10]。

目前常用的果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測方法有：平板分離法[11]、感官鑒評法[12]、儀器分析法[9,13]以及生物技術(shù)等相關(guān)方法[14-16]。普通平板分離法準確度低、耗時較長[17]。感官鑒評法必須通過專業(yè)培訓(xùn)的品嘗人員對果汁樣品進行氣味和口感分析。感官鑒評法雖已被果汁生產(chǎn)企業(yè)廣泛應(yīng)用，但是其結(jié)果的準確度和可信度受到品嘗員素質(zhì)和各類環(huán)境的影響。儀器分析法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用、氣相色譜-嗅覺（gas chromatography -olfactometry，GC-O）[9,18]測定、電子鼻技術(shù)[19]和分光光度計法[13]等分析方法。應(yīng)用儀器檢測脂環(huán)酸芽孢桿菌，不但對樣品前處理方法和儀器的操作人員要求較高，而且需要確定不同菌株在不同果汁飲料中的特征性代謝產(chǎn)物。普通分光光度計法準確性較差，并且只能測定澄清果汁飲料中愈創(chuàng)木酚的含量。生物學(xué)技術(shù)的檢測手段，主要應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，以及酶聯(lián)免疫等方法可快速、準確檢測果汁產(chǎn)品是否污染該菌[20]，但是該類方法對硬件條件以及操作人員的技術(shù)水平要求較高，很難在果汁生產(chǎn)企業(yè)廣泛推廣。應(yīng)用電子鼻技術(shù)檢測果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌已有相關(guān)研究[21]，但是關(guān)于電子舌技術(shù)檢測商業(yè)果汁污染脂環(huán)酸芽孢桿菌任然處于起步階段，相關(guān)研究未見發(fā)表。

電子舌技術(shù)主要由傳感器陣列和模式識別系統(tǒng)組成，傳感器檢測可以對液體樣品進行味覺感官評分，模式識別系統(tǒng)進行綜合分析判別[22]。電子舌具有操作簡便、果汁樣品不需要進行前處理、對環(huán)境條件適應(yīng)能力強等優(yōu)點，且可得到樣品的整體信息[23]，也稱作“指紋”數(shù)據(jù)。本實驗使用法國Alpha MOS公司生產(chǎn)的α-Astree Ⅱ型電子舌，其傳感器采用化學(xué)修飾場效應(yīng)晶體管技術(shù)，每個傳感器上覆有不同的分子膜，對不同滋味物質(zhì)具有不同的吸附特性[24]，以市售商業(yè)無菌果汁飲料為材料，采用電子舌技術(shù)對正常果汁樣品和接種脂環(huán)酸芽孢桿菌果汁樣品進行測定，通過主成分分析進行辨別分析，以期為電子舌技術(shù)快速檢測商業(yè)果汁飲料中脂環(huán)酸芽孢桿菌污染提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 果汁飲料

從超市選取包裝完好、密封完整、無外漏、保質(zhì)期內(nèi)且配方中無防腐劑的7 種果汁飲料，詳見表1。將各果汁飲料無菌分裝于滅菌后的玻璃瓶中密封保存。

表1 樣品列表Table 1 List of samples used in this study

1.1.2 菌株

選取兩株脂環(huán)酸芽孢桿菌，一株為標(biāo)準菌株Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922，購自德國菌種保藏中心；一株為分離菌株XC-6，本實驗室從玉米果汁飲料中分離得到，通過分子生物學(xué)鑒定為Alicyclobacillus sp.，NCBI登錄號為KJ158157。

1.1.3 培養(yǎng)基

BAT培養(yǎng)基（g/L）[11,25]：CaCl2·2H2O 0.25、MgSO4·7H2O 0.50、(NH4)2SO40.20、KH2PO43.0、酵母膏2.0、葡萄糖5.0、瓊脂15，痕量鹽溶液1 mL（痕量鹽溶液（g/L）：CaCl2·2H2O 0.66、ZnSO4·7H2O 0.18、CuSO4·5H2O 0.16、MnSO4·H2O 0.15、CoCl2·5H2O 0.18、H3BO30.10、Na2MoO4·2H2O 0.30）、蒸餾水1 000 mL。加入1 L去離子水，用硫酸調(diào)節(jié)pH值至3.7，115 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至50 ℃。

1.2 儀器與設(shè)備

α-Astree Ⅱ型電子舌（配有ZZ、BA、BB、CA、GA、HA、JB傳感器和及αSOFTV 12.3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)），法國AlphaM.O.S.公司。電子舌7根傳感器均為交叉?zhèn)鞲衅?，每個傳感器對酸、甜、苦、咸、鮮5類滋味物質(zhì)都有不同的吸附特性，但對每種滋味物質(zhì)檢測的閾值不同（表2）。

表2 電子舌傳感器對5 種滋味物質(zhì)的檢測閾值Table 2 The detection thresholds of 5 flavor components by E-tongue sensors mol/L

1.3 方法

1.3.1 菌種擴培與收集

將兩株脂環(huán)酸芽孢桿菌菌株接種于250 mL BAT液體培養(yǎng)基中，在45 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)48 h后的菌液以4 000 r/min無菌離心15 min，棄去上清液，再用無菌生理鹽水沖洗菌體沉淀。將用無菌生理鹽水沖洗后的菌懸液，再以4 000 r/min離心15 min，重復(fù)上次操作3 次，得到純凈不含異味的菌體。

1.3.2 微生物接種、計數(shù)

上述操作所獲兩株菌的菌懸液接種于不同商業(yè)果汁中，接種量為100 CFU/mL，對照組不接種任何菌株。接種組和對照組于80 ℃水浴處理30 min，冷卻至45～65 ℃后，置于45 ℃培養(yǎng)箱中密封培養(yǎng)30 d。使用BAT平板計數(shù)法測定不同處理果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌落總數(shù)。

1.3.3 電子舌檢測方法

1.3.3.1 電子舌校準

校準程序：將傳感器陣列在超純水中清洗10 s，然后使用0.01 mol/L的鹽酸作為校準液，在標(biāo)準液中反應(yīng)120 s，如此重復(fù)8 次。

1.3.3.2 電子舌診斷

診斷程序：傳感器陣列在超純水中清洗10 s，然后在0.01 mol/L的鹽酸作為校準液反應(yīng)120 s，在超純水中清洗10 s，0.01 mol/L的NaCl校準液反應(yīng)120 s，再次清洗10 s，最后在0.01 mol/L的谷氨酸鈉校準液反應(yīng)120 s，以上過程循環(huán)6 次。上述3 種標(biāo)準溶液在主成分分析圖中的貢獻率必須達到99%以上，說明儀器傳感器正常。

1.3.3.3 電子舌檢測

分別量取80 mL實驗樣品，與超純水交錯擺放在自動檢測盤上，使樣品檢測和清洗交錯進行。電子舌傳感器檢測時間120 s，每1 s采集一次數(shù)據(jù)，清洗時間：10 s，數(shù)據(jù)類型：cleaning。按照該段程序測量2 次后，傳感器響應(yīng)強度趨于穩(wěn)定，每樣品重復(fù)檢測8 次，選取后6 次的測量的數(shù)據(jù)進行主成分分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究采用多元統(tǒng)計分析中的主成分分析法對電子舌采集的數(shù)據(jù)進行分析。主成分分析是將電子舌傳感器多指標(biāo)的信息進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，并對降維后的特征向量進行線性分析，最后在PCA圖上顯示主要的兩維圖。應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析，Origin 8.0軟件畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子舌對7 種商業(yè)果汁飲料的辨別分析

圖1為7 種市售果汁飲料的主成分分析圖，2、3、 4、5和6號樣品之間能夠很好地區(qū)分，分別聚類在PCA圖中的不同區(qū)域。1和7號樣品之間不能區(qū)分開來，在PCA圖中兩者基本重疊。由表1可知，樣品1和7均為含乳類飲料，配方成分相似，因此選用1～6號樣品進行后續(xù)實驗。

圖1 電子舌對7 種商業(yè)果汁飲料樣品辨別的主成分得分圖Fig.1 Principal component analysis (PCA) plots of seven fruit juice beverage samples

2.2 接種處理后各果汁飲料中微生物篩選結(jié)果

表3 培養(yǎng)30 d后果汁飲料中脂環(huán)酸芽孢桿菌菌落總數(shù)Table 3 Total number of Alicyclobacillus sp. in fruit juice beverages after incubation for 30 days CFU/mL

對照組培養(yǎng)30 d后，1～6號果汁飲料在BAT平板上均無菌落檢出（表3）。接種標(biāo)準菌株和分離菌株培養(yǎng)30 d后，各樣品在BAT平板上均有菌落生成，其中1、2號和6號渾濁型飲料有大量菌落檢出，菌落總數(shù)超過103CFU/mL，3、4號和5號澄清型飲料中菌落總數(shù)小于103CFU/mL，特別是4號和5號樣品中菌落總數(shù)小于初始接種量102CFU/mL。結(jié)合表1可知，1、2號和6號樣品的pH值在3.5～4.5之間，為脂環(huán)酸芽孢桿菌生長的最適pH值[11,26]。

2.3 電子舌對接種處理果汁飲料的辨別分析

圖2 電子舌對6 種接種果汁飲料樣品的主成分分析圖Fig.2 PCA plots of six fruit juice beverage samples inoculated with different Alicyclobacillus sp. isolates

由圖2可知，2號和6號樣品不同接種處理及對照聚類在PCA圖中的不同區(qū)域，能夠被很好地區(qū)分開來。樣品1中，接種標(biāo)準菌株和分離菌株處理之間不能很好地區(qū)分，但接種處理與對照之間能夠很好地區(qū)分。3號樣品中，3 種處理樣品雖可聚類在PCA圖中的不同區(qū)域，但標(biāo)準菌株與對照之間的距離較近。樣品4中，標(biāo)準菌株與對照之間能夠區(qū)分，但分離菌株與對照之間距離較近。5號樣品中，兩種接種菌株之間不能區(qū)分，但接種與對照處理之間可以區(qū)分開來。綜上，除3和4號樣品外，分離菌株與對照不能完全區(qū)分，其他樣品中接種處理與對照之間均能夠很好地區(qū)分開來。結(jié)合表3可知，1、2號和6號樣品接種菌落總數(shù)均大于103CFU/mL，接種處理與對照能區(qū)分開，3、4號和5號樣品中接種菌落總數(shù)均小于103CFU/mL，其中3號和4號樣品接種分離菌株處理同對照組不能區(qū)分，但5號樣品接種處理同對照組可以區(qū)分，可能與分離菌株在不同果汁飲料中的代謝產(chǎn)物有關(guān)，尚需進一步研究。

圖3 電子舌對不同接種處理的果汁主成分分析圖Fig.3 PCA plots of fruit juice beverage samples with different inoculums

將6 種果汁飲料按照對照、接種標(biāo)準菌株及接種分離菌株3 組處理進行電子舌信號的主成分分析，其結(jié)果見圖3。組Ⅰ為所有樣品的對照處理以及3號和4號樣品接種分離菌株處理；組Ⅱ為所有樣品接種標(biāo)準菌株處理以及1、5號和6號樣品接種分離菌株處理；組Ⅲ為2號樣品接種分離菌株處理。綜上所述，除樣品3和4外，采用電子舌技術(shù)可將接種脂環(huán)酸芽孢桿菌的果汁飲料同對照組區(qū)分開。

3 結(jié) 論

采用電子舌技術(shù)對7 種商業(yè)果汁飲料進行辨別分析，除2 種含乳類飲料配方相似外，其余產(chǎn)品均可被快速、準確區(qū)分。將電子舌可辨別的6 種樣品分別接種兩株脂環(huán)酸芽孢桿菌并培養(yǎng)30 d，所有接種處理在BAT平板上均有菌落檢出，但不同飲料的檢出量不同。3 種渾濁型飲料的pH值在3.5～4.5之間，接種脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長量較多，超過103CFU/mL，3 種澄清型飲料的pH值小于3.5，接種脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢出量均小于103CFU/mL。通過電子舌測定及主成分分析可將接種脂環(huán)酸芽孢桿菌DSM 3922的6 種果汁飲料同對照組區(qū)分開，接種脂環(huán)酸芽孢桿菌XC-6的4 種果汁飲料同對照組區(qū)分開，接種XC-6的3號樣品（混合果汁飲料）及4號樣品（橙汁飲料）和對照組不能辨別。本研究探索電子舌技術(shù)在脂環(huán)酸芽孢桿菌污染檢測中的應(yīng)用，有關(guān)其應(yīng)用機理尚需進一步研究。

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Detection of Alicyclobacillus sp. Spoilage of Commercial Fruit Juice Beverages by Electronic Tongue

LI Er-hu, FENG Jia-jie, XU Can, PAN Si-yi*
(Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Commercial fruit juice beverages and their samples inoculated with Alicyclobacillus sp. isolates were discriminated by an α-Astree Ⅱ electronic tongue with principal component analysis. Except for two beverages mainly containing dairy components, other samples could be separated in different groups. Six beverages that could be discriminated by E-tongue were inoculated with two Alicyclobacillus sp. isolates and were incubated at 45 ℃ for 30 days. All inoculated samples were detected with colonies on Bacillus acidoterrestris plate, but number of colonies varied in different beverages. Three c loudy samples had a higher colony number over 103CFU/mL and three clear samples had a lower colony number below 103CFU/mL. All samples inoculated with Alicyclobacillus sp. DSM 3922 could be distinguished from control by E-tongue method. Excepted for mixed fruit juice and orange juice, other samples with Alicyclobacillus sp. XC-6 inoculation could be grouped from the control by E-tongue method.

Alicyclobacillus sp.; fruit juice beverage; electronic tongue; principal component analysis

TP212.2

A

1002-6630（2014）22-0141-05

10.7506/spkx1002-6630-201422026

2014-05-19

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31201414）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項（2013PY098）

李二虎（1982—），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：erhuli@mail.hzau.edu.cn

*通信作者：潘思軼（1963—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：pansiyi@mail.hzau.edu.cn