乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取壇紫菜多糖

張鉥孟，陳美珍*

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東 汕頭 515063）

乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取壇紫菜多糖

張鉥孟，陳美珍*

（汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系，廣東 汕頭 515063）

探究不同系線長度的乙醇-硫酸銨雙水相體系對壇紫菜多糖萃取的影響。采用濁點(diǎn)滴定法繪制乙醇-硫酸銨雙水相相圖，選取不同系線長度體系，測定其對紫菜多糖分配情況。結(jié)果表明：在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%（即系線長度為40）、體系相比R為1.1時(shí)，紫菜多糖的回收率可達(dá)79.8%，分配系數(shù)K為0.23；其蛋白去除率明顯高于傳統(tǒng)醇沉法（雙水相萃取多糖蛋白含量為1.20%，醇沉多糖蛋白含量為6.17%），且具有較好的脫色效果，可用于紫菜多糖的分離純化。

雙水相；系線長度；壇紫菜；多糖

紫菜多糖屬半乳聚糖硫酸酯，主要由半乳糖、3,6-內(nèi)醚半乳糖和硫酸基等組成，其基本結(jié)構(gòu)單位為3-β-D-半乳糖苷-1,4-α-L-3,6-內(nèi)醚半乳糖組成的二糖[1-2]。紫菜多糖是一種多組分的水溶性多糖，含有大量的酸性多糖，糖鏈殘基上不同程度地連接著硫酸根、甲氧基等基團(tuán)[3-4]。研究[5-9]表明紫菜多糖具有抗凝血、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能等多種生物活性。多糖傳統(tǒng)提取工藝存在著操作繁瑣、破壞多糖結(jié)構(gòu)、多糖損失率高、蛋白去除效果差等問題，因此，尋求一種高效、溫和、操作簡便的方法顯得至關(guān)重要。

雙水相萃取技術(shù)是利用組分在兩個(gè)互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離的技術(shù)[10]。由于其具有高效、溫和、操作簡便、容易放大、回收率高，不存在有機(jī)溶劑殘留及不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等各大領(lǐng)域，如抗生素分離、酶、蛋白質(zhì)分離提純和其他生物活性物質(zhì)萃取以及藥物分析和金屬分離等[14-16]。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-鹽系統(tǒng)已用于萃取蘆薈、雙孢菇、香菇、毛木耳以及葡萄籽多糖[17-21]，同樣也用于分離血紅蛋白樣品、人參皂苷、凝集素、結(jié)構(gòu)類似蛋白等其他物質(zhì)[22-25]，但聚合物存在難以回收、價(jià)格高等問題，于是醇-鹽系統(tǒng)受到了人們的關(guān)注。有研究[26-30]報(bào)道使用乙醇-鹽系統(tǒng)萃取螺旋藻多糖、靈芝酸、白藜蘆醇、醌類化合物、重組人血清白蛋白等，而國內(nèi)外還未見有關(guān)于雙水相萃取紫菜多糖的報(bào)道，因此采用乙醇-硫酸銨這種廉價(jià)的雙水相體系，探討不同系線長度（tie line length，TLL）的體系對紫菜多糖萃取的影響，以期建立萃取分離紫菜多糖的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售壇紫菜購于汕頭市。

苯酚、無水乙醇、硫酸銨、H3PO4、濃硫酸（分析純） 西隴化工股份有限公司；KBr、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白（分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2100C型紫外-可見分光光度計(jì) 美國Unico公司；UV-1800PC型分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；IR200型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖繪制

參照文獻(xiàn)[14,26]，采用濁點(diǎn)滴定法測定乙醇-硫酸銨雙水相相圖中雙節(jié)線的組成，反復(fù)重復(fù)操作并記錄溶液出現(xiàn)混濁（即轉(zhuǎn)變?yōu)閮上鄥^(qū)）至溶液澄清（即單相）過程中所加入的乙醇溶液和水的質(zhì)量，并計(jì)算出各組分的質(zhì)量濃度，繪制相圖。

1.3.2 半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取20 mg干燥至恒質(zhì)量的半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，配成40 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，混勻冷卻，靜置30 min以后于490 nm波長處測量吸光度，以2.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為半乳糖質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，濾紙過濾得考馬斯亮藍(lán)溶液；結(jié)晶牛血清白蛋白預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別加入0、10、20、30、40、50 ?L標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，以蒸餾水補(bǔ)至50 ?L，均加入2.5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑后混勻，5 min以后測量其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 紫菜多糖液的制備

采用熱水浸提法[31]，溫度80 ℃、料液比1∶40、時(shí)間2 h。4 500 r/min，5 min 離心取上清液，得紫菜粗多糖液，濃縮至1/3體積得濃縮液，置于4 ℃冰箱待用。

1.3.5 雙水相萃取紫菜多糖體系的優(yōu)化

根據(jù)乙醇-硫酸銨雙水相相圖，選取5 個(gè)不同體系測定其對紫菜多糖分配的影響。預(yù)先配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的硫酸銨母液，然后按照表1配制100 g體系，置于分液漏斗中振蕩搖勻，靜止一段時(shí)間使其分相完全后，測定上下相體積并計(jì)算相比（R）；分別取上下相測定其多糖和蛋白含量，計(jì)算紫菜多糖的分配系數(shù)（K）和收率（Y）。參數(shù)計(jì)算見式（1）～（3）：

式中：R為上下相體積比；V上和V下分別為雙水相體系的上下相體積/mL；K為紫菜多糖在雙水相體系中的分配系數(shù)；ρ上和ρ下分別為紫菜多糖在雙水相體系中上、下相的質(zhì)量濃度/（?g/mL）；Y為紫菜多糖在下相中的收率。

表1 乙醇-硫酸銨雙水相體系Table 1 Ethanol-ammonium sulfate aqueous two phase system

1.3.6 雙水相萃取和乙醇沉淀法的比較

取上述紫菜多糖濃縮液，分別采用優(yōu)化后的雙水相體系和乙醇沉淀法[32]制備紫菜多糖并測定其多糖、蛋白含量。雙水相萃取的多糖液經(jīng)4 ℃冰箱放置一段時(shí)間，結(jié)晶析出大部分硫酸銨后再經(jīng)透析、濃縮及真空冷凍干燥后得樣品。

1.3.7 紫外檢測

配制1 mg/mL的多糖液，以蒸餾水為對照，于200～400 nm進(jìn)行全波段掃描，檢測其是否有核酸、蛋白特征吸收峰。

1.3.8 紅外光譜分析

取多糖樣品1～2 mg按1∶100比例與KBr研磨壓片，以KBr為參照物。用紅外光譜儀測定，于400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of ethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system

由圖1可知，乙醇與硫酸銨在較大質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)均具有較好的成相能力，且必須保持一定的配比，質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大或過小均不能形成雙水相體系，與文獻(xiàn)[27]報(bào)道一致。

2.2 多糖及蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.010 1x-0.013 8（R2=0.995，y為半乳糖質(zhì)量濃度/（μg/mL），x為吸光度）；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.589 6x-0.005 7（R2=0.999 4，y為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL），x為吸光度）。

2.3 雙水相體系優(yōu)化結(jié)果

表2 雙水相體系萃取紫菜多糖結(jié)果Table 2 Extraction of polysaccharides from Porphyra haitanensis by ATPS

圖2 蛋白及多糖分配系數(shù)圖Fig.2 Partition coefficient graphs of proteins and polysaccharides

靜止分相后，上相顏色較深，為乙醇相；下相基本透明，為鹽相；表明色素在上相得到富集。由表2可知，多糖均富集于下相，可能是由于上相乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，多糖更易分配于下相所致。以多糖回收率為主要指標(biāo)同時(shí)考察蛋白的分配情況，結(jié)果如圖2及表2所示，得最優(yōu)體系為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%（即TLL為40）。因此，乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取多糖的同時(shí)兼有脫色素效果。

2.4 傳統(tǒng)醇沉及雙水相萃取紫菜多糖比較結(jié)果

傳統(tǒng)醇沉法制備的樣品中多糖含量為30.83%，蛋白含量高達(dá)6.17%；而乙醇-硫酸銨雙水相體系制備的樣品中多糖含量達(dá)90%以上，蛋白含量僅為1.20%。相比傳統(tǒng)醇沉法，乙醇-硫酸銨雙水相體系具有較好的除蛋白效果。

2.5 紫外掃描結(jié)果

雙水相萃取的紫菜多糖樣品在260、280 nm波長處均沒有特征吸收峰，而傳統(tǒng)醇沉的多糖在280 nm波長處有吸收峰。

2.6 紅外光譜結(jié)果

圖3 多糖紅外圖譜Fig.3 Infrared spectra of polysaccharides

由圖3可知，兩種多糖紅外圖譜基本一致，均含有多糖類特征吸收峰，表明雙水相萃取和傳統(tǒng)醇沉法制得的多糖結(jié)構(gòu)一致。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探究了紫菜多糖在乙醇-硫酸銨雙水相體系中的分配情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%時(shí)，多糖分配系數(shù)K為0.23，富集于下相，收率Y可達(dá)79.8%。

在乙醇-硫酸銨雙水相體系中，紫菜多糖 更易分配于下相，而色素等雜質(zhì)在上相富集。相比傳統(tǒng)醇沉法，乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取的多糖樣品中蛋白含量僅為1.20%，具有較好的除蛋白效果及脫色素作用。因此，可以利用其精制紫菜多糖，大大提高了多糖的純度，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

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Extraction of Polysaccharides from Porphyra haitanensis Using Ethanol-Ammonium Sulfate Aqueous Two-Phase System

ZHANG Shu-meng, CHEN Mei-zhen*
(Department of Biology, College of Science, Shantou University, Shantou 515063, China)

The effect of tie line length (TLL) of ethanol-(NH4)2SO4aqueous two phase system (ATPS) on the extraction of polysaccharides from Porphyra haitanensis was investigated. The phase diagram was obtained by cloud point titration, and then different TLLs of ATPS were selected and partition coefficients of polysaccharides were detected. The yield and partition coefficient of polysaccharides were 79.8% and 0.23, respectively, using a system consisting of 27% ethanol and 18% (NH4)2SO4(forming a TLL of 40) with a top/bottom phase volume ratio of 1.1. The removal rate of protein was significantly higher than that reported with traditional ethanol precipitation method (1.20% vs 6.17%). Meanwhile, the proposed method had good decolorization effect. Thus, it can be used for the separation and purification of polysaccharides from Porphyra haitanensis.

aqueous two-phase system; tie line length (TLL); Porphyra haitanensis; polysaccharides

Q547

A

1002-6630（2014）22-0046-04

10.7506/spkx1002-6630-201422009

2014-05-08

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B0203012005）；汕頭市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011-156）；2013年汕頭大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心項(xiàng)目

張鉥孟（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：30434390@163.com

*通信作者：陳美珍（1956—），女，教授，本科，研究方向?yàn)榛钚晕镔|(zhì)研究與開發(fā)。E-mail：chenmz@stu.edu.cn