變性梯度凝膠電泳法初步解析茯磚茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

劉石泉，胡治遠(yuǎn)，趙運(yùn)林,*

（1.湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

變性梯度凝膠電泳法初步解析茯磚茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

劉石泉1,2，胡治遠(yuǎn)1，趙運(yùn)林1,*

（1.湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

為解析茯磚茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和種類(lèi)，對(duì)渥堆過(guò)程中不同時(shí)間段細(xì)菌16S rDNA 的V3可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)細(xì)菌變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）圖譜中條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序和序列比對(duì)。結(jié)果表明：黑毛茶在渥堆過(guò)程中以渥堆24 h為分界點(diǎn)，前后各自細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，但前后的差異較大；從16S rDNA 的V3可變區(qū)比對(duì)結(jié)果證明黑毛茶渥堆過(guò)程中有諾卡氏菌屬、新鞘脂菌屬、短波單胞菌屬、韋龍氏假單胞菌屬、突那梭菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬及不可培養(yǎng)的ε-變形菌、腐敗螺旋菌屬、黏球菌屬、根瘤菌屬和未知分類(lèi)地位的不可培養(yǎng)細(xì)菌6 種。采用DGGE指紋圖譜能更全面、更真實(shí)地反映黑毛茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性變化。.

茯磚茶；渥堆發(fā)酵；變性梯度凝膠電泳；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

茯磚茶是傳統(tǒng)黑茶中保健功效最為顯著的品種之一，據(jù)《明史·茶法》記載，早在明嘉靖三年即公元1 524年前，茯磚茶就被規(guī)定為運(yùn)往西北供少數(shù)民族所需的官茶。茯磚茶與綠茶、紅茶比較，綠茶屬非發(fā)酵茶，紅茶屬半發(fā)酵茶，而茯磚茶屬于后發(fā)酵茶，其加工工藝獨(dú)特，獨(dú)具菌花香[1]。茯磚茶加工比較特殊，經(jīng)黑毛茶拼配、篩分、渥堆、汽蒸壓制、發(fā)花、干燥、成品包裝等加工工序，加工成茯磚茶產(chǎn)品。以前主要銷(xiāo)往邊疆少數(shù)民族地區(qū)，專(zhuān)供新疆、青海、甘肅、寧夏等邊疆少數(shù)民族地區(qū)人民飲用，鑒于茯磚茶的功效被普遍認(rèn)可和接受，發(fā)展前景廣闊，目前正走向內(nèi)地和國(guó)際市場(chǎng)。

茯磚茶加工過(guò)程中渥堆處理被認(rèn)為是形成其獨(dú)特風(fēng)味和功效的關(guān)鍵工序，渥堆過(guò)程中的微生物作用是在茯磚茶品質(zhì)形成過(guò)程中起著決定性的作用因素之一，雖然不同花色品種所采用的渥堆技術(shù)條件不盡相同，但目的都是通過(guò)一定程度的發(fā)酵，形成葉色黑潤(rùn)、味醇和、香氣純正、湯色黃紅明亮的品質(zhì)特征，實(shí)際上就是在微生物及濕熱的作用下使以茶多酚為主的化學(xué)成分發(fā)生一系列的化學(xué)變化，研究渥堆過(guò)程中微生物種類(lèi)和結(jié)構(gòu)，對(duì)于茯磚茶優(yōu)異品質(zhì)的形成和渥堆工序的革新具有重要意義[2-4]。許多學(xué)者已經(jīng)對(duì)茯磚茶加工中微生物種類(lèi)、微生物對(duì)茯磚茶品質(zhì)的影響作了大量研究并取得了重大進(jìn)展[5-6]，文獻(xiàn)檢索表明茯磚茶在渥堆過(guò)程中微生物研究主要集中在真菌，如曲霉、青霉等，而細(xì)菌的研究則主要集中在細(xì)菌的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)上，曾經(jīng)有報(bào)道在渥堆初期有無(wú)芽孢小桿菌、芽孢細(xì)菌、金黃色葡萄球菌等，這些渥堆中特有的細(xì)菌研究，主要是用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)、分離、鑒定方法研究其菌落組成，對(duì)整個(gè)發(fā)酵流程的不同工藝過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌和非優(yōu)勢(shì)菌共同組成的渥堆中特有的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究是零碎的、不系統(tǒng)的，沒(méi)有對(duì)整個(gè)渥堆發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌做動(dòng)態(tài)跟蹤研究。

近年，很多研究者將免培養(yǎng)分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到微生物群落結(jié)構(gòu)的分析中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等基因指紋圖譜技術(shù)由于快速、直觀、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)而被逐漸運(yùn)用于多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中[7]。應(yīng)用PCR-DGGE 技術(shù)能檢測(cè)群落中90%～99%的微生物物種，無(wú)論該物種細(xì)胞處于哪種生理狀態(tài)（活細(xì)胞、死細(xì)胞、不可培養(yǎng)狀態(tài)的活細(xì)胞）[8]。

本實(shí)驗(yàn)主要采用PCR-DGGE及克隆技術(shù)，對(duì)益陽(yáng)茶廠有限公司茯磚茶生產(chǎn)線上渥堆過(guò)程中不同渥堆階段的黑毛茶樣本進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和種類(lèi)分析，并對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，同時(shí)對(duì)渥堆過(guò)程中細(xì)菌DGGE圖譜中主要條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，鑒定其細(xì)菌類(lèi)群，以期能為茯磚茶渥堆微生態(tài)研究提供更多信息，以利于更好地研發(fā)這一特色產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益陽(yáng)茶廠有限公司茯磚茶生產(chǎn)線，渥堆過(guò)程中分別取渥堆0、8、16、24、32、40、48 h的茶葉樣品，用上、中、下3 層分層獨(dú)立取樣后，經(jīng)四分法逐步縮分至500 g左右，置于-20 ℃冰箱保存，對(duì)應(yīng)編號(hào)為W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7，采樣時(shí)間為2013年3月28日-30日。

338F（5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）、GC-338F（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGG CGG GGC GGG GGC GCG GGG GG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518R（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）引物由北京美億美生物技術(shù)有限公司合成；擴(kuò)增試劑購(gòu)自北京美億美生物技術(shù)有限公司；DNA Gel Extraction Kit 美國(guó)Axygen公司；Poly-Gel DNA Extraction Kit 美國(guó)Omega公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PTC220型PCR儀、Gel-Doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；DGGE-2401變性梯度凝膠電泳儀 美國(guó)C.B.S.Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌基因組提取

采用CTAB/SDS方法提取樣本細(xì)菌基因組DNA[9]，DNA的TE溶液用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品后于-20℃冰箱保存。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增與回收

以基因組DNA為模板、采用通用引物GC-338F和518R擴(kuò)增16S rDNA 的V3高變區(qū)序列[10-11]。

PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、GC-338F（20 mmol/L）1 μL、518R（20 mmol/L）1 μL、模板DNA 100 ng、ddH2O補(bǔ)充至50 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物采用DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳

取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、8%的聚丙烯酰胺凝膠（化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol/L和體積分?jǐn)?shù)40%的去離子甲酰胺）在1×TAE緩沖液中150 V、60 ℃電泳4 h，DGGE完畢后采用銀染法染色顯色。

1.3.4 DGGE凝膠條帶回收測(cè)序

用滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶，采用Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶。以2 μL回收產(chǎn)物為模板，338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、338F（20 mmol/L）1 μL、518R（20 mmol/L）1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、55℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

將重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到pEASY-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，由北京美億美生物技術(shù)有限責(zé)任公司對(duì)插入的細(xì)菌16S rDNA片段進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.5 序列片段分析

將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，使用BLAST程序進(jìn)行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16S rDNA序列[12]。

1.4 分析方法

利用分析軟件Quantity One 4.2.3對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類(lèi)和主成分分析（principal component analysis，PCA）。

多樣性指數(shù)H在生態(tài)學(xué)中它被用來(lái)描述生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性，H=-∑PilnPi，式中Pi是第i種在總體中的個(gè)體比例；均勻性指數(shù)E是實(shí)際觀察的物種多樣性指數(shù)與理論上最大的物種多樣性指數(shù)之比，E=H/Hmax，式中H為實(shí)際觀察的物種多樣性指數(shù)，Hmax為最大的物種多樣性指數(shù)，Hmax=lnS，豐度指數(shù)S表示生態(tài)系統(tǒng)中物種的數(shù)目，具體計(jì)算方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13-14]。

利用DNAstar軟件包中的SeqMan程序?qū)NA 序列進(jìn)行人工校對(duì)，并將所有校對(duì)后的序列方向統(tǒng)一為正向，通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索，根據(jù)比對(duì)結(jié)果獲得序列對(duì)應(yīng)的細(xì)菌種屬信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本基因組DNA提取

采用CTAB/SDS方法提取樣本基因組DNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），說(shuō)明成功獲得了W1～W7樣本基因組DNA。

圖1 樣本中提取的細(xì)菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of bacterial genomic DNA extracted from samples

2.2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

以GC-338F和518R為引物擴(kuò)增16S rDNA序列、經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得約200 bp的預(yù)期DNA片段（圖2），用于DGGE分析。

圖2 PCR擴(kuò)增的16S rDNA部分序列瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products from partial 16S rDNA sequence

2.3 PCR產(chǎn)物的DGGE分析

圖3 不同渥堆發(fā)酵階段細(xì)菌16S rDNA-PCR產(chǎn)物DGGE圖譜Fig.3 DGGE map of bacterial 16S rDNA-PCR products from different pile-fermentation stages

表1 不同渥堆發(fā)酵階段細(xì)菌群落特征Table 1 Bacterial community characteristics of samples in different pile-fermentation stages

樣品細(xì)菌種群的16S rDNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分析結(jié)果如圖3所示。茯磚茶渥堆過(guò)程中，16S rDNA的V3高變區(qū)序列類(lèi)型十分豐富，表1表明多樣性指數(shù)H在開(kāi)始渥堆的8 h之內(nèi)稍有提高，隨后下降，渥堆24 h后下降到最低2.501，之后開(kāi)始回升。均勻性指數(shù)E指數(shù)變化不大，豐度指數(shù)S變化趨勢(shì)跟多樣性指數(shù)H變化對(duì)應(yīng)，先降后升，在24 h時(shí)最低（13）后開(kāi)始緩緩回升并穩(wěn)定在16，這可能是由于在茯磚茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中，黑毛茶最先所處的環(huán)境是自然狀態(tài)，渥堆開(kāi)始后濕熱作用促使黑毛茶附生的各種細(xì)菌相繼開(kāi)始萌動(dòng)。多樣性指數(shù)H在開(kāi)始渥堆的8 h之內(nèi)逐漸提高，細(xì)菌的活動(dòng)無(wú)疑會(huì)改變渥堆環(huán)境如濕度、溫度、含氧量等，同時(shí)細(xì)菌間的相互生長(zhǎng)影響，如拮抗、促生等關(guān)系，多樣性指數(shù)H稍微有所下降，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)整逐漸向適應(yīng)這時(shí)渥堆的濕熱環(huán)境轉(zhuǎn)變，加上其他微生物的代謝影響，使適應(yīng)渥堆環(huán)境的細(xì)菌開(kāi)始重新構(gòu)建黑毛茶渥堆細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖4 不同渥堆發(fā)酵階段PCA分析Fig.4 PCA analysis of samples in different pile-fermentation stages

由圖4可知，W1、W2、W3主要分布在第四象限，而W5、W6、W7主要分布在第二象限，W4則單獨(dú)列于第一象限，說(shuō)明在黑毛茶渥堆的0～16 h與32～48 h，渥堆細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是不相同的，其轉(zhuǎn)折點(diǎn)是在渥堆24h（W4）的時(shí)候。

圖5 不同渥堆發(fā)酵階段進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Evolutionary tree for different pile-fermentation stages

由圖5可知，W1、W2、W3和W5、W6、W7的相似性較近，而W4則與它們的差異較大，說(shuō)明了黑毛茶在渥堆過(guò)程中，以渥堆24 h為分界點(diǎn)，前后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化較大。

2.4 DGGE凝膠條帶回收測(cè)序及序列分析

PCR產(chǎn)物純化后連接到pEASY-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行序列比對(duì)，得到條帶所代表的細(xì)菌類(lèi)型。每個(gè)回收條帶選取3 個(gè)克隆，編號(hào)band1、band2、band3 band20表示圖3中位置1～20條帶進(jìn)行了序列測(cè)定，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，使用BLAST程序進(jìn)行同源性比較，獲得最相似典型菌株的16S rDNA序列如表2所示。在比對(duì)出的細(xì)菌種類(lèi)中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）9 株、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）3 株、放線菌門(mén)（Actinobacteria）1 株、擬桿菌門(mén)（Bacteriodetes）1 株。

表2 DGGE凝膠條帶回收序列分析結(jié)果Table 2 Sequence analysis of the recovered DGGE gel bands

用軟件MEGA5[15]對(duì)16S rDNA 的V3高變區(qū)序列和GenBank中相關(guān)種屬代表菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 20個(gè)條帶建立的進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Evolutionary tree for 20 bands

3 討 論

關(guān)于黑茶渥堆發(fā)酵中細(xì)菌的研究，茯磚茶中只是涉及到了在渥堆中有大量的細(xì)菌存在[15]，具體鑒定到種及種的渥堆全過(guò)程變化卻鮮有研究。但在普洱的渥堆中已有初步研究，如李晨晨等[16]對(duì)普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中嗜熱細(xì)菌的分離和鑒定研究；姚靜等[17]對(duì)普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌種群的分離與分子鑒定研究；樊竹青等[18]對(duì)普洱茶渥堆過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量的變化研究等主要是應(yīng)用平板培養(yǎng)分離進(jìn)行計(jì)數(shù)或進(jìn)行鑒定。本次實(shí)驗(yàn)采用PCRDGGE技術(shù)，通過(guò)DNA序列比對(duì)，監(jiān)測(cè)到了渥堆全程不同時(shí)段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和種類(lèi)。

茯磚茶與普洱同屬于后發(fā)酵茶系列，但從用平板培養(yǎng)分離進(jìn)行鑒定的結(jié)果來(lái)看，姚靜等[16]發(fā)現(xiàn)普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中主要存在7 個(gè)不同屬的細(xì)菌，分別是芽孢桿菌、克雷伯氏菌、鞘氨醇桿菌、短桿菌、紅球菌、假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌。李晨晨等[15]分離了凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、熱嗜淀粉芽孢桿菌、喜熱噬油芽孢桿菌、乳酸片球菌，植物乳桿菌等。本次渥堆過(guò)程中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的細(xì)菌，如假單胞菌、克雷伯氏菌、乳桿菌等，說(shuō)明這些細(xì)菌在黑茶渥堆過(guò)程中是較為普遍存在的。通過(guò)16S rDNA序列比對(duì)也發(fā)現(xiàn)了諾卡氏菌、新鞘脂菌、短波單胞菌、突那梭菌、變形菌、腐敗螺旋菌、黏球菌、根瘤菌以及未知的不可培養(yǎng)細(xì)菌的存在，說(shuō)明茯磚茶與普洱茶分別屬于不同的發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)。而且由圖3可知，條帶7、13、17和19為渥堆過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，將條帶的16S rDNA 的V3高變區(qū)序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，在GenBank中使用BLAST程序進(jìn)行同源性比較，條帶7為韋龍氏假單胞菌屬（Pseudomonas veronii）、條帶17為克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）XC-08、條帶13和19為不可培養(yǎng)細(xì)菌，更說(shuō)明我們對(duì)黑毛茶渥堆發(fā)酵中細(xì)菌的作用的了解還只是冰山一角。

本實(shí)驗(yàn)分離得到細(xì)菌產(chǎn)生的各種活性物都具有較為明顯的作用，有些放線菌等能產(chǎn)生大量茶多酚、氨基丁酸等對(duì)人體健康有益的物質(zhì)，如本次檢測(cè)到的諾卡氏菌[19]實(shí)驗(yàn)證明能分泌生物活性物，能顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，具有抗病原微生物感染及明顯的抑瘤作用，假單胞菌屬[20]、新鞘脂菌[21]屬能降解呋喃丹，短波單胞菌能產(chǎn)L-脯氨酸[22]，植物乳桿菌[23]生長(zhǎng)溫度范圍為10～53 ℃，耐酸，最適pH值為5.0，在更低pH值也可以生長(zhǎng)，其代謝可產(chǎn)生有機(jī)酸，此外還能產(chǎn)生多種酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。細(xì)菌對(duì)茯磚茶發(fā)酵過(guò)程中pH值變化及茶葉風(fēng)味和品質(zhì)的形成起著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了克雷伯氏菌、短波單胞菌、假單胞菌和黏球菌等，姚靜等[16]也曾在普洱茶中分離了類(lèi)似細(xì)菌。通常被認(rèn)為這些細(xì)菌是條件致病菌，可感染人和動(dòng)物使其患病，能在茯磚茶渥堆發(fā)酵過(guò)程樣品中被檢出，說(shuō)明它們?cè)谲虼u茶發(fā)酵過(guò)程中肯定有一定作用，但所起到的具體作用機(jī)理、作用大小有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)對(duì)黑毛茶渥堆發(fā)酵中不同時(shí)間段的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同渥堆時(shí)間段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不相同，尤其以渥堆前半段和后半段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異相對(duì)較大，以渥堆24 h為分界點(diǎn)，前后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化較大。通過(guò)16S rDNA 的V3高變區(qū)序列和GenBank中相關(guān)種屬代表菌株的16S rDNA序列比對(duì)，證明細(xì)菌種類(lèi)比較豐富，共檢測(cè)到在黑毛茶渥堆過(guò)程中存在諾卡氏菌屬、新鞘脂菌屬、短波單胞菌屬、韋龍氏假單胞菌屬、突那梭菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌屬和不可培養(yǎng)的腐敗螺旋菌屬、黏球菌屬、根瘤菌屬、ε-變形菌等，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了6 種不可培養(yǎng)細(xì)菌，研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法中都未曾檢出，因此采用DGGE指紋圖譜更全面、更真實(shí)地反映黑毛茶渥堆發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性變化，同時(shí)也說(shuō)明要全面準(zhǔn)確地了解黑毛茶渥堆發(fā)酵細(xì)菌多樣性，除了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)，更需要先進(jìn)的分子手段，在利用現(xiàn)代分子技術(shù)解析黑毛茶渥堆發(fā)酵細(xì)菌結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌區(qū)系及其相互協(xié)同制約的代謝機(jī)制的分析和探討，以期揭開(kāi)細(xì)菌與茯磚茶風(fēng)味形成之間的神秘面紗。

由于茯磚茶加工過(guò)程中細(xì)菌種類(lèi)組成復(fù)雜，有對(duì)茯磚茶品質(zhì)起促進(jìn)作用的有益菌種，也有影響其品質(zhì)形成的條件致病菌菌種，但其有益菌種和條件致病菌種也是相對(duì)的，茯磚茶加工中條件致病菌細(xì)菌會(huì)同有益微生物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響品質(zhì)。因此，要制成品質(zhì)好的茯磚茶，就必須根據(jù)細(xì)菌種類(lèi)和作用的程度，以不同條件加以控制，有效抑制條件致病生長(zhǎng)，并利用有益菌的生物轉(zhuǎn)化作用改善茯磚茶品質(zhì)，更好地發(fā)揮黑毛茶原料的潛力，提高渥堆效率，充分彰顯茯磚茶保健品質(zhì)特色。

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Preliminary Analysis of Bacterial Community Structure during Pile-Fermentation Process of Fuzhuan Brick Tea by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

LIU Shi-quan1,2, HU Zhi-yuan1ZHAO Yun-lin1,*
(1. College of Chemistry and Environment Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, China; 2. College of Biology and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

In order to explore the bacterial community structure and species during the pile-fermentation process of Fuzhuan Brick Tea, the V3 variable region of bacterial 16S rDNA was amplified at different fermentation times and analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), and the DGGE bands were cloned, sequenced and aligned. The results showed that 24 hours of pile-fermentation was the critical point. A similar bacterial community structure was observed before and after the point, respectively, while a significant difference existed between the two stages. The sequence alignment of 16S rDNA V3 variable region showed that Millisia brevis, Novosphingobium sp., Brevundimonas aurantiaca, Pseudomonas veronii, Clostridium ultunense, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus plantarum, unculturable strains including Epsilon proteobacterium, Saprospiraceae bacterium, Myxococcales bacterium and Rhizobiales bacterium, and six species of unculturable bacteria with unknown taxonomic status were detected. Therefore, pile fermentation of the black tea involved a large number of bacteria, and the bacterial community during the process was relatively stable. In conclusion, DGGE fingerprint can provide a comprehensive and true reflection of changes in the bacterial community structure and diversity of Fuzhuan brick tea during the fermentation process.

Fuzhuan brick tea; pile-fermentation; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); bacterial community structure

S571.1，Q939.97

A

1002-6630（2014）15-0172-06

10.7506/spkx1002-6630-201415035

2013-07-29

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JJ6074）；湖南省高校產(chǎn)學(xué)研合作示范基地產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（13CY025；11CY003；11CY004）；

湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目（2012WK2013）；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助項(xiàng)目（2014）；

益陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013YK1323）

劉石泉（1969—），男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)楹诓璋l(fā)酵。E-mail：lsq205@tom.com

*通信作者：趙運(yùn)林（1959—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)學(xué)。E-mail：zyl8291290 @163.com