植物乳桿菌β-D-葡萄糖苷酶的定位及活性研究

張 哲，樊明濤,*，董 梅，李愛霞，劉延琳

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

植物乳桿菌β-D-葡萄糖苷酶的定位及活性研究

張 哲1，樊明濤1,*，董 梅1，李愛霞1，劉延琳2

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

以對硝基苯基β-D-葡萄糖苷為底物，通過比色法從5 株植物乳桿菌中篩選出2 株有較高β-D-葡萄糖苷酶酶活力的菌株，并利用 差速離心分級沉淀對其β-D-葡萄糖苷酶進(jìn)行定位。根據(jù)對植物乳桿菌的生長狀況的分析，測定其在不同生長條件下β-D-葡萄糖苷酶的酶活力。結(jié)果表明：目的菌株體內(nèi)的β-D-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，屬于細(xì)胞膜結(jié)合酶；該酶在對數(shù)生長末期（培養(yǎng)至12 h）酶活力最高，最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為改良MRS培養(yǎng)基；以完整細(xì)胞為參照對象，植物乳桿菌520、XJ-25菌株所產(chǎn)的β-D-葡萄糖苷酶均受纖維二糖及熊果苷的誘導(dǎo)，熊果苷的誘導(dǎo)作用較強(qiáng)。

植物乳桿菌；β-D-葡萄糖苷酶；定位；酶活力

β-D-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC 3.2.1.21）是催化水解烴基或芳香基與糖基之間的糖苷鍵生成芳香物質(zhì)和葡萄糖的一種水解酶[1-2]，主要存在于細(xì)菌、真菌和植物中，不同來源的酶在分子大小及催化特性等方面存在較大差異[3]。在葡萄和葡萄酒中除了游離的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)外還有大量的以β-D-葡萄糖苷形式存在的非揮發(fā)性風(fēng)味前體物質(zhì)[4]。β-D-葡萄糖苷酶能將其水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)[5]，另外，還可與其他風(fēng)味酶協(xié)同作用釋放出揮發(fā)性糖苷配基，起到增香作用[6]。因此，開發(fā)β-D-葡萄糖苷酶作為水果風(fēng)味增香酶在葡萄酒釀造中具有重要意義。

由于植物來源的β-D-葡萄糖苷酶含量低，成本高，目前的很多研究集中于黑曲霉、酵母菌、乳酸菌等微生物中β-D-葡萄糖苷酶[7-9]。國內(nèi)對黑曲霉中β-D-葡萄糖苷酶研究較多，但其存在食品安全隱患，在食品加工中受到限制[10]。而與酵母菌相比，乳酸菌是在酒精發(fā)酵結(jié)束后接種于葡萄酒中[11]，其生長環(huán)境比酒精發(fā)酵的葡萄醪環(huán)境穩(wěn)定，因此不易在酶的作用下生成不利于葡萄酒質(zhì)量的副產(chǎn)物。作為下一代蘋果酸乳酸發(fā)酵的發(fā)酵劑，植物乳桿菌有潛在啟動蘋果酸乳酸發(fā)酵的能力[12]。與常被用于蘋果酸乳酸發(fā)酵的酒酒球菌相比，植物乳桿菌含有更高的β-D-葡萄糖苷酶和酚酸脫羧酶，對于葡萄酒增香應(yīng)用具有廣闊的前景[13]。此外，有關(guān)研究[14-15]表明該酶的存在形式分胞內(nèi)、胞外兩種。存在形式不同，其分離提取的手段也各不相同。胞外酶容易提取，利用離心方法即可獲得；而胞內(nèi)酶則需通過破碎細(xì)胞來釋放酶，細(xì)胞破碎則成為酶分離提取的關(guān)鍵。因此，酶的定位研究是其分離純化的前提，為其后續(xù)分離純化方法和條件的選擇提供參考和依據(jù)。目前關(guān)于植物乳桿菌糖苷酶活性及定位的研究較少，本實(shí)驗(yàn)對不同來源的5 株植物乳桿菌進(jìn)行了酶活力測定及其定位分析，為該酶在食品行業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也對該酶的分離純化及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株

植物乳桿菌520（由泡菜中分離）由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；植物乳桿菌CS-1、XJ-14、XJ-25、XJA-2（由葡萄酒中分離）由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉4 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·4H2O 0.05 g/L、乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸銨 2 g/L、吐溫80 1 mL/L，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

改良MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不添 加磷酸氫二鈉，添加胰蛋白胨15 g/L代替蛋白胨10 g/L，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至4.8，121 ℃滅菌20 min。

ATB培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、Mg SO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·4H2O 0.05 g/L、鹽酸半胱氨酸0.5 g/L、番茄汁250 mL/L，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至4.8，121 ℃滅菌20 min。

MRST培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、果糖5 g/L、酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·4H2O 0.05 g/L、鹽酸半胱氨酸0.5 g/L、吐溫-80 1 mL/L、番茄汁100 mL/L，用1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至5.0，121 ℃滅菌20 min[14]。

對硝基苯基-β-葡萄糖苷 上海寶曼生物科技有限公司；溶菌酶 美國Sigma公司；葡萄糖、纖維二糖、熊果苷 美國Amersc公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DH-420A電熱恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；HS-840U型水平層流單人凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；pH計 上海雷磁儀器廠；UV-1700 紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；VC-130 超聲波細(xì)胞破碎儀 美國Sonics & Materials公司。

1.3 方法

1.3.1 高酶活力菌株的篩選及β-D-葡萄糖苷酶的初步定位研究

初步定位研究方法參照文獻(xiàn)[16]，并稍加改動。分別取1 mL培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的菌液，4 ℃、5 000×g離心10 min，得菌液上清及沉淀，用150 mmol/L NaCl洗滌沉淀2 次，得完整細(xì)胞。將完整細(xì)胞懸浮于細(xì)胞緩沖液中，冰浴條件下130 W超聲破碎15 min（間隔2 s）得破碎液，破碎液經(jīng)4 ℃、12 000×g離心10 min后，得破碎上清液及細(xì)胞碎片。將完整細(xì)胞及細(xì)胞碎片重 懸浮于1 mL蒸餾水中，進(jìn)行酶活力測定，菌液上清、破碎液及破碎上清液直接進(jìn)行酶活力測定。

酶活力測定方法：方法參照文獻(xiàn)[16]，并有所改動。一定量酶液（調(diào)整酶液量以確保最終比色值在0.2～0.8）用蒸餾水稀釋到500 μL，然后和500 μL 2×檸檬酸磷酸緩沖液/對硝基苯-β-D-葡萄糖苷（終pH 5.0，底物濃度 5 mmol/L）混合，在37℃下水浴1 h后4 ℃、12 000×g離心10 min，將上清加入2 mL、1 mol/LNa2CO3終止反應(yīng)，在400 nm波長下比色。對照組為用蒸餾水代替處理樣品。

酶活力的定義：在反應(yīng)體系中，1 min內(nèi)1 g干質(zhì)量菌體催化生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為1 個酶活力單位，表示為1 μmol/（g·min）。

1.3.2 植物乳桿菌的的生長特性及最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基的選擇

將1.3.1節(jié)確定的高產(chǎn)酶植物乳桿菌分別以2%的接種量接入200 mL的MRS、改良MRS、ATB、MRST液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)（屬于兼性厭氧培養(yǎng)），每隔2 h取樣測定其OD600nm值并繪制生長曲線。根據(jù)生長曲線，測定各菌株在不同培養(yǎng)基中對數(shù)末期的酶活力，篩選出最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

1.3.3 菌體不同生長時期的酶活力分布

根據(jù)1.3.2節(jié)中的各菌株生長曲線，分別對其對數(shù)生長中期、對數(shù)生長末期、穩(wěn)定期取樣，按照初步定位方法進(jìn)行各部位酶活力測定。

1.3.4 不同碳源對β-D-葡萄糖苷酶酶活力的誘導(dǎo)

將篩選出的高酶活力植物乳桿菌分別在碳源為纖維二糖（10 g/L）、熊果苷（20 g/L）、葡萄糖（10 g/L）加熊果苷（10 g/L）、葡萄糖（10 g/L）加纖維二糖（5 g/L）的培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，測其酶活力。以葡萄糖（20 g/L）碳源為對照組。

1.3.5 β-D-葡萄糖苷酶的進(jìn)一步定位研究

參照文獻(xiàn)[17]方法并稍加修改。取8 mL菌液，4 ℃、5 000×g離心10 min，然后用0.5 mol/L蘋果酸鈉緩沖液（pH 6.6）洗滌沉淀，4 ℃、5 000×g再次離心10 min，得完整細(xì)胞，并將其懸浮于8 mL、0.5 mol/L蘋果酸鈉緩沖液中（pH 6.6），然后加入溶菌酶（終質(zhì)量濃度75 μg/mL），37 ℃水浴2 h，直到細(xì)胞壁完全破裂。破壁后4 ℃、7 000×g離心20 min，用0.5 mol/L蘋果酸鈉緩沖液（pH 6.6）洗滌沉淀，再次4 ℃、7 000×g離心20 min，得原生質(zhì)體。兩次離心所得上清混合在 一起命名為上清液A。原生質(zhì)體再懸浮于8 mL低滲溶液中（10 mmol/L 蘋果酸鈉緩沖液，pH 6.6）使其破裂，將裂解液在4 ℃、24 000×g下離心1.5 h，得細(xì)胞膜和可溶性酶；上清液A在4 ℃、24 000×g下離心1.5 h，得細(xì)胞壁碎片和細(xì)胞周質(zhì)。對所得各組分進(jìn)行酶活力測定，確定β-D-葡萄糖苷酶的存在位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-D-葡萄糖苷酶的初步定位

圖1 植物乳桿菌β-D-葡萄糖苷酶初步定位Fig.1 β-D--glucosidase activity of different fractions from five strains

由圖1可知，5 株植物乳桿菌均具有β-D-葡萄糖苷酶酶活力，其中植物乳桿菌520、XJ-25酶活力較高。此外，其不同部位酶活力顯示，完整細(xì)胞酶活力最高，破碎液與細(xì)胞碎片次之，而菌液上清及破碎上清液幾乎無酶活力。此與前人報道的β-D-葡萄糖苷酶主要存在于乳酸菌的完整細(xì)胞上，而菌液上清及破碎液上清液基本無酶活的結(jié)果一致[18]，與一些研究者篩選出胞外及胞內(nèi)β-D-葡萄糖苷酶的研究結(jié)果存在一定差異[14-15]。該結(jié)果也表明：β-D-葡萄糖苷酶屬于胞內(nèi)酶，主要為不可溶性酶。

2.2 植物乳桿菌生長狀況

圖2 520菌株在不同培養(yǎng)基中的生長情況Fig.2 Growth curves of strain 520 in different media

圖3 XJ-25菌株在不同培養(yǎng)基中的生長情況Fig.3 Growth curves of strain XJ-25 in different media

由圖2、3可知，植物乳桿菌520、XJ-25在不同的培養(yǎng)基上具有相同的生長趨勢，且不同培養(yǎng)基對其生長無顯著影響。菌株接種后0～2 h均為延滯期，菌體濃度基本保持不變，隨后進(jìn)入對數(shù)生長期，接種12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的選擇

圖4 520菌株在不同培養(yǎng)基中的β-D-葡萄糖苷酶酶活力Fig.4 Determination of the highest activity of strain 520 in four media

圖5 XJ-25菌株在不同培養(yǎng)基中的β-D-葡萄糖苷酶酶活力Fig.5 Determination of the highest activity of strain XJ-25 in four media

圖4 、5顯示了植物乳桿菌520、XJ-25在4 種培養(yǎng)基中的酶活力情況，2 株菌株在不同培養(yǎng)基中均是完整細(xì)胞及破碎液酶活力較高，在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，β-D-葡萄糖苷酶酶活力最高，在MRS培養(yǎng)基中次之，而適合酒酒球菌生長及產(chǎn)高酶活力的ATB、MRST培養(yǎng)基對植物乳桿菌并沒有展現(xiàn)出高酶活力的能力。

2.4 菌體在不同生長時期的酶活力分布

圖6、7顯示了菌株520、XJ-25的菌液上清、完整細(xì)胞和破碎液在對數(shù)生長中期（6 h）、對數(shù)生長末期（12 h）和穩(wěn)定期（24 h）的β-D-葡萄糖苷酶活力。2 株菌的菌液上清及破碎上清液在3 個不同時期的酶活力都幾乎為零，這與細(xì)胞初步定位時的一致，而完整細(xì)胞、破碎液和細(xì)胞碎片酶活力均隨著生長時期的變化而呈現(xiàn)先增后降的趨勢。由此可知，2 株菌株均在對數(shù)生長末期具有最高β-D-葡萄糖苷酶酶活力。

圖6 520菌株不同生長時期的β-D-葡萄糖苷酶酶活力Fig.6 Effects of growth phages on β-D--glucosidase activity of strain 520

圖7 XJ-25菌株不同生長時期的β-D-葡萄糖苷酶酶活力Fig.7 Effects of growth phages on β-D--glucosidase activity of strain XJ-25

2.5 不同碳源對β-D-葡萄糖苷酶酶活力的誘導(dǎo)

圖8 不同碳源對5200菌株β-D-葡萄糖苷酶酶活的誘導(dǎo)Fig.8 Induction of β-D--glucosidase activity of strain 520 by different carbon sources

圖9 不同碳源對XJ-255菌株β-D-葡萄糖苷酶酶活力的誘導(dǎo)Fig.9 Induction of β-D--glucosidase activity of strain XJ-25 by different carbon sources

由圖8、9可知，在有熊果苷作為碳源時上清液具有一定的酶活力，且顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組的酶活力，此原因可能是培養(yǎng)基中的熊果苷分解產(chǎn)生對羥基苯酚和葡萄糖，而對羥基苯酚在堿性條件下顯黃色，影響了酶活力的測定[19]；對于完整細(xì)胞及細(xì)胞破碎液來說，在有纖維二糖或熊果苷作為碳源時的酶活力顯著高于以葡萄糖作為碳源時的酶活力，且在有熊果苷作為碳源時的酶活力要高于有纖維二糖作為碳源時的酶活力，這說明2 株菌株的酶活力在含有糖苷鍵碳源的誘導(dǎo)下會有不同程度的提高。

2.6 β-D-葡萄糖苷酶的進(jìn)一步定位

由2.1節(jié)的初步定位研究（圖1）可知，本實(shí)驗(yàn)所采用的5 株植物乳桿菌均具有β-D-葡萄糖苷酶酶活力，且該酶屬于胞內(nèi)不可溶性酶。為了對該酶進(jìn)行深入的了解，探尋其在細(xì)胞內(nèi)的確切存在位置，故對其進(jìn)行了進(jìn)一步的定位研究，其結(jié)果如圖10、11所示。細(xì)胞壁β-D-葡萄糖苷酶活力很低，幾乎為零，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間的周質(zhì)腔內(nèi)有一定的酶活力，且其酶活力幾乎等于上清A的酶活力，說明上清A的酶活力主要來自于周質(zhì)腔內(nèi)的酶活力；原 生質(zhì)體也具有酶活力，原生質(zhì)體裂解、離心后得到的上清（可溶酶）和沉淀（細(xì)胞膜）中都有酶活力，且沉淀的酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上清中的酶活力，說明原生質(zhì)體內(nèi)的β-D-葡萄糖苷酶主要為不可溶性酶，多存在于原生質(zhì)體的細(xì)胞膜中，為膜結(jié)合酶。

圖10 5200菌株β-D-葡萄糖苷酶細(xì)胞定位Fig.10 Cellular localization of β-D--glucosidase from strain 520

圖11 XJ-255菌株β-D-葡萄糖苷酶細(xì)胞定位Fig.11 Cellular localization of β-D--glucosidase from strain XJ-25

3 討論與結(jié)論

目前所發(fā)現(xiàn)的β-D-葡萄糖苷酶中有兩種：膜結(jié)合酶和非膜結(jié)合酶。因兩者之間的性質(zhì)差異極大，其分離提取的方法也各不相同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合國外的先進(jìn)技術(shù)，采用差速離心分級沉淀對植物乳桿菌中的β-D-葡萄糖苷酶進(jìn)行定位，結(jié)果表明其β-D-葡萄糖苷酶主要為胞內(nèi)不可溶性酶，存在于細(xì)胞膜上，屬于膜結(jié)合酶。膜結(jié)合酶因其不可溶、難提取等特點(diǎn)很少被用于分離純化的研究中，但研究膜結(jié)合酶十分必要。分離純化制得酶液或酶制劑應(yīng)用于實(shí)踐，不僅工序繁瑣而且價格昂貴不適合工業(yè)的大批生產(chǎn)，而具有高膜結(jié)合酶活性的菌株可直接被投入生產(chǎn)應(yīng)用，對葡萄酒的釀造具有重要意義。

作為一種食品安全菌種，不同來源的2 株植物乳桿菌在4 種培養(yǎng)基中均能良好生長且無顯著差異，生長趨勢一致，說明培養(yǎng)基的成分差異對其生長幾乎無影響，但不同培養(yǎng)基下的酶活力差異， 則表明培養(yǎng)環(huán)境對產(chǎn)酶及酶活力有較大影響。2 株高酶活力菌株能否在葡萄酒苛刻條件（高酒精含量、低pH值、高糖及高SO2含量）下展現(xiàn)出高酶活力成為了目前探討的問題[12]。

本實(shí)驗(yàn)從5 株植物乳桿菌中篩選出2 株高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶菌株并對其進(jìn)行定位及活性分析，結(jié)果表明該酶主要為胞內(nèi)不可溶性酶，屬于細(xì)胞膜結(jié)合酶，且其在對數(shù)生長末期酶活力最高，最適培養(yǎng)基為改良MRS培養(yǎng)基。此外，不同碳源下的誘導(dǎo)結(jié)果顯示，該酶為組成型酶，但在纖維二糖和熊果苷的誘導(dǎo)下酶活力有不同程度的提高。

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Localization and Activity of β-D-Glucosidase from Lactobacillus plantarum

ZHANG Zhe1, FAN Ming-tao1,*, DONG Mei1, LI Ai-xia1, LIU Yan-lin2
(1. College of Food Scienc e and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

In this study, two strains of Lactobacillus plantarum (L. plantarum) with the highest β-D-glucosidase activity were obtained from five L. plantarum strains with p-nitro-phenyl-β-D-glucopyranoside as the substrate and their cellular localization of β-D-glucosidase was studied by using fractional precipitation with differential centrifugation. In addition, the enzymatic act ivity of β-D-glucosidase was determined under different growth conditions, followed by analyzing the growth of L. plantarum. Our results supported the conclusion that β-D-glucosidase was membrane-associated and might be insoluble. The highest activity was displayed at the late exponential phase and an improved MRS was verified as the optimal medium. For whole cells, β-D-glucosidase was induced by cellobiose and arbutin, but arbutin played more important role in the enzymatic activity.

Lactobacillus plantarum; β-D-glucosidase; cellular localization; enzymatic activity

TS261.1

A

1002-6630（2014）15-0161-05

10.7506/spkx1002-6630-201415033

2013-09-29

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（nycytx-30-ch-03）

張哲（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：871805936@qq.com

*通信作者：樊明濤（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：fanmt@nwsuaf.edu.cn