氮離子注入蛹蟲(chóng)草選育高效富硒菌株的研究

王 陶，李 文，陳宏偉，李同祥*，趙天蘭

（徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008）

氮離子注入蛹蟲(chóng)草選育高效富硒菌株的研究

王 陶，李 文，陳宏偉，李同祥*，趙天蘭

（徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221008）

為了更好地開(kāi)發(fā)蛹蟲(chóng)草資源，對(duì)蛹蟲(chóng)草菌株富集微量元素硒的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇最佳參數(shù)的低能離子束注入蛹蟲(chóng)草，通過(guò)石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)注入前后菌絲體中硒元素的含量。結(jié)果表明：蛹蟲(chóng)草發(fā)酵富硒的最優(yōu)培養(yǎng)條件為蛋白胨質(zhì)量濃度3 g/100 mL、葡萄糖質(zhì)量濃度3 g/100 mL、亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為8 μg/mL、pH值為7，此時(shí)，富硒率為21.58%。離子束最佳注入?yún)?shù)為：注入離子為N+，注入能量10 keV，注入劑量1.82×1015ions/cm2，選育出富集微量元素硒較高的10 株菌株，最高富硒率為30.97%，比出發(fā)菌株提高了近42%。

蛹蟲(chóng)草；硒；低能離子束；富集；注入

硒是人體必需的微量元素，它通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、輔酶Q與VE維持自由基的正常代謝來(lái)維持人體正常生理機(jī)能[1-3]，具有增強(qiáng)免疫能力，防止糖尿病，防止克山病、大骨節(jié)病、關(guān)節(jié)炎，防治肝病、保護(hù)肝臟，解毒排毒等功能[4-5]。中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)制定硒的日供應(yīng)量1 歲以內(nèi)為15 μg，1～3 歲為20 μg，4～6 歲為40 μg，5 歲至成年人為50 μg。然而我國(guó)成人硒的攝入量?jī)H為26.6 μg，屬于低硒水平[6]。有機(jī)硒的補(bǔ)劑由于在毒理安全性、生理活性及吸收率的優(yōu)越性，已經(jīng)成為廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)[7-10]。開(kāi)發(fā)生物源有機(jī)硒食品或食品添加劑是給機(jī)體提供硒源的有效途徑。

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）又名北蟲(chóng)草、蛹草、北冬蟲(chóng)夏草，屬子囊菌亞門、核菌綱、球殼菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬，含有蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素等核苷類化合物、多種氨基酸、糖醇和甾醇、多種維生素等，其藥理作用與冬蟲(chóng)夏草相似，能顯著地提高機(jī)體的免疫力，有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、抗放療，以及延緩衰老的功效[11-14]。蛹蟲(chóng)草對(duì)微量元素具有明顯的富集作用，并能夠?qū)o(wú)機(jī)態(tài)轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)，使其吸收利用率大大提高，并能降低其毒性。

低能離子束生物學(xué)效應(yīng)自1995年由余增亮研究員發(fā)現(xiàn)以來(lái)[15]，已廣泛運(yùn)用于多種農(nóng)作物、工業(yè)微生物的誘變育種中[16]。在VC、L-乳酸、檸檬酸生產(chǎn)菌等方面也有重要的研究結(jié)果[17-19]。但未見(jiàn)利用低能離子束作用蛹蟲(chóng)草菌株進(jìn)行微量元素硒富集的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)低能離子注入修飾蛹蟲(chóng)草菌株，優(yōu)化最佳注入?yún)?shù)，并在微量元素硒最佳發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件下，大量篩選突變體菌株，以期找到微量元素硒富集率高的菌株，從而提高蛹蟲(chóng)草的綜合利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）13號(hào)菌株：徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存，通過(guò)反復(fù)優(yōu)化培養(yǎng)，其生物量是實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌株中最多的。

亞硒酸鈉（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

離子注入機(jī) 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院；TSA-990原子吸收儀、TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HYG搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：SDAY培養(yǎng)基（葡萄糖4 g/100 mL、蛋白胨1 g/100 mL、酵母浸膏1 g/100 mL、瓊脂2 g/100 mL）；種子培養(yǎng)基：SDY培養(yǎng)基（去掉瓊脂的SDAY培養(yǎng)基）；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨3 g/100 mL、酵母浸膏3 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL、KH2PO40.1 g/100 mL、無(wú)水氯化鈣0.01 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL、Na2SeO310 μg/mL；篩選培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯 150 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、硫酸鋅1 g、瓊脂30 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂1 g、蒸餾水1 000 mL。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 斜面培養(yǎng)

將接種后的斜面于22 ℃培養(yǎng)7 d。

1.4.2 種子培養(yǎng)

于22 ℃、122 r/min，培養(yǎng)3 d。裝液量：250 mL三角瓶裝入50 mL液體培養(yǎng)基。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

于接種量5%、22 ℃、122 r/min振蕩培養(yǎng)5～7 d。

1.5 微量元素硒富集方法

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)考察碳源質(zhì)量濃度、氮源質(zhì)量濃度、pH值和亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)蛹蟲(chóng)草微量元素硒富集的相互影響，并確定蛹蟲(chóng)草菌絲體富集微量元素硒的最佳工藝參數(shù)。

1.6 誘變方法

1.6.1 樣品的前期準(zhǔn)備

在含玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)放置50 mL生理鹽水，再裝入由培養(yǎng)7 d的斜面上刮取的孢子塊，搖勻、打散，后經(jīng)雙層滅菌紗布過(guò)濾3 次，再在振蕩器上振蕩混勻，即成單孢懸液。

把孢子懸液，按照10-1稀釋后取0.1 mL孢子懸液均勻涂布于無(wú)菌平皿上，于超凈工作臺(tái)風(fēng)干后進(jìn)行離子注入。

1.6.2 離子注入條件

注入靶室的真空度為10-3Pa，束流量為1 mA。注入能量：5、10、15、20、25、30 keV，注入劑量：（10、30、50、70、90、110、130、160、190）×2.6×1013ions/cm2。注入離子種類：N+。

1.6.3 突變菌株的篩選

經(jīng)離子注入處理后的樣品用1 mL磷酸緩沖液洗脫下來(lái)，10 倍稀釋法稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基上分離，于恒溫培養(yǎng)箱22 ℃培養(yǎng)7 d。挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落中心附近直徑0.5 cm同等大小菌絲體接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，種子液中培養(yǎng)5 d，再接種于正交優(yōu)化后的最佳硒富集發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d。測(cè)定微量元素硒的含量，篩選富硒蛹蟲(chóng)草菌株。

1.7 分析檢測(cè)方法

1.7.1 生物量的測(cè)定

通過(guò)低溫離心分離收集菌體，將菌體冷凍干燥至恒質(zhì)量，稱量得生物量。

1.7.2 無(wú)機(jī)硒的去除

通過(guò)低溫離心分離收集菌體，將菌體冷凍干燥至恒質(zhì)量，稱量得生物量。稱取1 g樣品，放在煮開(kāi)的透析袋中，進(jìn)行流水透析，時(shí)間為36 h，去除菌絲體表面的無(wú)機(jī)硒（無(wú)機(jī)硒通過(guò)流水透析已去除，以下用石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)到的都是有機(jī)硒）。

1.7.3 微波消解

將透析好的樣品于消解罐中，移取7 mL濃硝酸滴入其中溶解，放入微波消解儀中消解。消解完后用超純水將所得的消解液定容至50 mL。

1.7.4 石墨爐原子吸收法測(cè)定硒含量

將定容好的樣品吸取10 μL加入石墨爐中，利用石墨爐原子吸收法進(jìn)行硒含量的測(cè)定。設(shè)定的工作參數(shù)為：波長(zhǎng)213.9 nm，灰化溫度500 ℃，原子化溫度1 900 ℃，消化溫度2 000 ℃。

1.7.5 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用移液管分別移取0.1 mg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行稀釋，配制硒質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、600 ng/mL。以硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=0.000 9x+0.004 4（R2=0.999 2）。

1.7.6 富集率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)蛹蟲(chóng)草富集硒元素能力的影響

2.1.1 碳源對(duì)硒富集的影響

表1 碳源種類對(duì)菌絲體生物量和富硒率的影響Table 1 Effects of different carbon sources on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

碳源分別為3 g/100 mL的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糊精、淀粉對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量和硒富集率的影響見(jiàn)表1。葡萄糖為碳源時(shí)，生物量最高為2.178 g/100 mL，可能由于葡萄糖是單糖，蛹蟲(chóng)草對(duì)單糖提供的碳源更易吸收，而蔗糖，乳糖和麥芽糖是二糖，糊精和淀粉是多糖，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入二糖或多糖時(shí)影響菌體的生長(zhǎng)，生物量不高。當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)，蛹蟲(chóng)草菌絲體富硒率最高為19.60%。由此說(shuō)明碳源種類為葡萄糖時(shí)，蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)較好，同時(shí)富硒能力強(qiáng)，因此，葡萄糖為最適碳源。

2.1.2 氮源對(duì)硒富集的影響

表2 氮源種類對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量和硒富集率的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

氮源分別為3 g/100 mL的尿素、蛋白胨、大豆粉、玉米粉、硝酸鉀、硫酸銨對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量和硒富集率的影響見(jiàn)表2。尿素、蛋白胨、大豆粉、玉米粉是有機(jī)氮源，硝酸鉀和硫酸銨屬于無(wú)機(jī)氮源。由表可知，培養(yǎng)基有機(jī)氮源的比無(wú)機(jī)氮源的生物量高很多，其中蛋白胨的生物量為最大，為3.134 g/100 mL。加入氮源為蛋白胨時(shí)，蛹蟲(chóng)草菌絲體富硒率最大為16.85%。由此說(shuō)明氮源種類為蛋白胨時(shí)，蛹蟲(chóng)草富硒能力強(qiáng)，則蛋白胨為最優(yōu)氮源種類。

2.1.3 pH值對(duì)硒富集的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，不同pH值對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體的生物量和富硒率的影響可見(jiàn)表3。隨著pH值的增長(zhǎng)，生物量先增加后降低，在pH 6.5時(shí)，生物量達(dá)到最大，蟲(chóng)草菌絲體的富硒能力最大，其富硒率為18.64%。這樣的pH值使蛹蟲(chóng)草更易生長(zhǎng)，使蛹蟲(chóng)草的富集能力增強(qiáng)。過(guò)酸過(guò)堿的環(huán)境都抑制蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)。

表3 不同pH值對(duì)菌絲體生物量和富硒率的影響Table 3 Effect of different medium pH values on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

2.1.4 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)硒富集的影響

表4 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)菌絲體生物量和富硒量的影響Table 4 Effect of different Na2SeO3concentrations on biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia

在基本培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉，對(duì)蛹蟲(chóng)草的生物量和富硒率的影響見(jiàn)表4。亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，生物量達(dá)到最大為3.106 g/100 mL。加入的亞硒酸鈉質(zhì)量濃 度為10 μg/mL時(shí)，蟲(chóng)草菌絲體的富硒能力最大，達(dá)到19.87%。在基本培養(yǎng)基中加入的亞硒酸鈉質(zhì)量濃度過(guò)低，蛹蟲(chóng)草富硒未達(dá)到飽和，而加入的亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度過(guò)高，抑制了蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)，富集能力也有所降低。

2.1.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

結(jié)合前面的單因素試驗(yàn)，選擇碳源質(zhì)量濃度、氮源質(zhì)量濃度、pH值以及亞硒酸鈉的加入量為影響因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表及正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。各因素對(duì)微量元素硒富集的影響次序?yàn)锽＞A＞D＞C，即蛋白胨添加量＞葡萄糖添加量＞亞硒酸鈉添加量＞pH值，其最優(yōu)方案為B2A2D1C3。最佳富集硒元素的培養(yǎng)條件為蛋白胨添加量3 g/100 mL、葡萄糖添加量3 g/100 mL、亞硒酸鈉添加量為8 μg/mL、pH值為7。最優(yōu)條件下，硒的富集率達(dá)21.58%。最優(yōu)方案為B2A2D1C3在試驗(yàn)組合中，不需做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal array design

2.2 低能離子注入最佳參數(shù)的確定

2.2.1 離子種類的選擇

離子的種類很多，不同離子注入對(duì)菌種的損傷效應(yīng)也各不相同，表現(xiàn)出來(lái)的敏感程度也不同。但就H+、N+和Ar+這3 種常用的注入離子來(lái)說(shuō)，N+的誘變率最高[20]，因?yàn)镹+是組成DNA堿基的重要元素之一，N+注入不僅可以直接引起DNA堿基分子結(jié)構(gòu)的變化，還可以參與細(xì)胞的重組和修復(fù)，產(chǎn)生較多突變，所以通常用于微生物和植物的誘變育種。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇N+作為注入離子。

2.2.2 注入能量的選擇

選擇注入劑量為1.3×1015ions/cm2，劑量率為2.6×1013ions/cm2，研究不同能量N+與菌株存活率之間的關(guān)系，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同能量N+對(duì)菌株存活率的影響Fig.1 Effect of N+energy on survival rate

由圖1可知，注入離子能量較低情況下，菌株的存活率呈緩慢下降的趨勢(shì)，當(dāng)注入能量增加到5 keV以上后其存活率急劇下降，當(dāng)注入能量繼續(xù)增加到10 keV以上時(shí)，其存活率下降速度又明顯減緩。為了確保在誘變選育時(shí)既有一定的存活率又有較多的正突變，本實(shí)驗(yàn)選擇10 keV能量對(duì)蛹蟲(chóng)草菌種進(jìn)行離子注入處理。

2.2.3 注入劑量的確定

在10 keV能量下，不同N+注入劑量對(duì)蛹蟲(chóng)草菌種的存活率的影響見(jiàn)圖2，其存活曲線呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，屬于“馬鞍型”變化。這種特有的“馬鞍型”曲線被認(rèn)為是能量、動(dòng)量作用下的損傷效應(yīng)和質(zhì)量、電荷作用下的保護(hù)和綜合刺激作用的結(jié)果[21]。當(dāng)注入劑量在0～2.6×1014ions/cm2時(shí)，存活率急劇下降，隨著劑量的增加，存活率又緩慢上升，當(dāng)劑量增加到70×2.6×1013ions/cm2時(shí)，存活率又開(kāi)始緩慢下降。

因此，本實(shí)驗(yàn)選擇離子最佳注入?yún)?shù)為：N+，能量10 keV，劑量70×2.6×1013ions/cm2峰值間的劑量，即60×2.6×1013～80×2.6×1013ions/cm2，這樣既保證一定的存活率，又有一定的正突變率。

圖2 N 2 N+注入菌株的存活率曲線Fig.2 Survival curve of the original strain after N+beam implantation

2.3 低能離子注入后篩選得到部分突變子照片

在最佳注入?yún)?shù)下，進(jìn)行了大批量的N+注入實(shí)驗(yàn)，在PDA篩選培養(yǎng)基上得到了大量的單菌落，見(jiàn)圖3，并對(duì)長(zhǎng)勢(shì)較好、菌落大的單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，進(jìn)而在前面優(yōu)化的蛹蟲(chóng)草富硒發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)。

圖3 離子束注入后得到的單菌落Fig.3 Colonies after N+beam implantation

2.4 富硒蛹蟲(chóng)草菌種的篩選

按照優(yōu)化后的富硒蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)工藝條件，對(duì)近160 個(gè)低能離子束修飾后的單菌落進(jìn)行微量元素硒的富集培養(yǎng)，利用石墨碳原子吸收法測(cè)定菌絲體中硒的含量。富硒率較高的10 株菌株見(jiàn)表6。離子注入前后蛹蟲(chóng)草菌株的生物量有了比較大的變化，注入后生物量比對(duì)照提高最多達(dá)50%。可見(jiàn)低能離子束的誘變效應(yīng)首先體現(xiàn)在對(duì)菌體生長(zhǎng)上。通過(guò)最佳注入?yún)?shù)的低能N+修飾蛹蟲(chóng)草菌株后，在最佳富集培養(yǎng)條件下，篩選得到了菌絲體中硒含量較高的菌株，最高達(dá)（309.684±0.010）μg/g干質(zhì)量，同時(shí)富集率達(dá)30.97%，比對(duì)照高了近42%。這可能是由于低能N+的質(zhì)量沉積、能量交換和電荷轉(zhuǎn)移三因子效應(yīng)的綜合作用的結(jié)果[21]，使得蛹蟲(chóng)草中菌絲體細(xì)胞的通透性增加，從而有利于微量元素的富集。對(duì)高效富硒的菌株在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行了6 次傳代培養(yǎng)，每次檢測(cè)得到的硒含量均在300.000 μg/g干質(zhì)量左右，富硒率在30%與對(duì)照相比，增幅均在40%左右（表7），這些菌株的遺傳穩(wěn)定性較好，可以進(jìn)行下一步的研究。

表6 離子束注入前后菌絲體生物量及富硒率Table 6 Biomass and selenium enrichment rate of Cordyceps militaris mycelia before and after ion beam implantation

表7 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性Table 7 Genetic stability of the mutant strain No. 3

3 結(jié) 論

采用能量為10 keV，不同劑量的N+注入蛹蟲(chóng)草菌株的存活率呈比較典型的馬鞍型曲線，最佳注入劑量為1.82×1015ions/cm2，這樣既保證一定的存活率，又有一定正突變率。優(yōu)化蛹蟲(chóng)草菌株富集微量元素硒的發(fā)酵條件：蛋白胨質(zhì)量濃度3 g/100 mL、葡萄糖質(zhì)量濃度3 g/100 mL、亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為8 μg/mL、pH值為7。在最佳注入?yún)?shù)下，經(jīng)過(guò)大量的N+注入發(fā)現(xiàn)：低能離子束對(duì)生物體的誘變效應(yīng)首先表現(xiàn)在對(duì)菌體生長(zhǎng)上，生物量比對(duì)照提高。篩選得到了菌絲體中硒含量較高的菌株，最高達(dá)（309.684 ± 0.010）μg/g干質(zhì)量，同時(shí)富硒率達(dá)30.97%，比對(duì)照高了近42%。這些菌株生長(zhǎng)性能較好，具有較好的遺傳穩(wěn)定性，為綜合開(kāi)發(fā)利用蛹蟲(chóng)草資源奠定了一定的基礎(chǔ)。當(dāng)然，低能離子注入微生物體內(nèi)作用機(jī)理十分復(fù)雜，是質(zhì)量沉積、電荷轉(zhuǎn)移和能量交換三因子于一體的綜合過(guò)程。蟲(chóng)草具有多種生物學(xué)功能，富硒能增強(qiáng)其功效，對(duì)于低能離子注入得到高效富硒蛹蟲(chóng)草菌株僅僅做了初步的探索，關(guān)于低能離子束注入蛹蟲(chóng)草菌株后的誘變效應(yīng)機(jī)理、富硒蛹蟲(chóng)草中硒的存在形式以及蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖等生物活性成分還有待于進(jìn)一步的研究。

[1] HATFIELD D L, BERRY M J, GLADYSHEV V N. Selenium, its molecular biology and role in human health[M]. Nether lands: Kluwer Academic Publishers, 2001: 99-313.

[2] RAYMAN M P. The importance of selenium to human health[J]. Lancet, 2000, 356(9): 233-241.

[3] DHUR A, GALAN P, HERCBERG S. Relationship between selenium, immunity and resistance against infection[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology, 1990, 96(2): 271-280.

[4] 齊秀蘭, 曾紅, 田洪麗, 等. 啤酒酵母菌對(duì)無(wú)機(jī)硒的有機(jī)轉(zhuǎn)化[J]. 微生物學(xué)雜志, 2007, 7(3): 6-10.

[5] 尚德靜, 王關(guān)林. 四種食用菌富硒能力的比較研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 1999, 6(3): 17-20.

[6] 曹素芳, 吳法憲, 李先鋒, 等. 提高食用菌中硒含量的研究[J]. 中國(guó)食用菌, 1992, 11(5): 10-12.

[7] DEMIRCI A, POMETTO A L. Production of organically bound selenium yeast by continuous fermentation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47: 2491-2495.

[8] 黃淵澤, 殷國(guó)健, 王光燦, 等. 富硒食用菌中的硒含量[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1997, 19(4): 341-343.

[9] 齊睿婷, 顏炳祥, 潘道東, 等. 乳酸乳球菌富硒及其硒多糖抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(11): 67-71.

[10] 范秀英, 郭雪娜, 傅秀輝, 等. 高生物量富硒酵母的選育及培養(yǎng)條件初步優(yōu)化[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2003, 19(3): 720-724.

[11] NG T B, WANG Hexiang. Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2005, 57(12): 1509-1519.

[12] CUNNINGHAM K G, HUTCHINSON S A, MANSON W. Cordycepin, a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.) Link.[J]. Nature, 2010, 166(8): 949-952.

[13] MAO Xianbin, ZHONG Jianjiang. Significant effect of NH4+on cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 12(5): 343-350.

[14] ROTTENBERG M E, MASOCHA W, FERELLA M. Treatmentof African trypanosomiasis with cordycepin and adenosinedeaminase inhibitiors in a mouse model[J]. Journal of Infectious Diseases, 2005, 192(9): 1658-1665.

[15] YU Zengliang. Ion beam application in genetic modification[J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2000, 28(1): 128-132.

[16] 王陶, 李文, 陳宏偉, 等. 低能離子束生物工程及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].徐州工程學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 24(1): 6-10.

[17] 虞龍, 許安, 王紀(jì), 等. 低能離子束注入在VC高產(chǎn)菌株選育中的應(yīng)用[J].激光生物學(xué)報(bào), 1999, 8(3): 217-222.

[18] 李文, 王陶, 余增亮. 離子注入選育L(+)-乳酸耐酸菌及去中和劑發(fā)酵研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(12): 13-17.

[19] 虞龍, 潘濤, 周劍, 等. 氮離子注入檸檬酸生產(chǎn)菌的誘變選育[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào), 2005, 23(4): 233-236.

[20] SHAO C L, YU Z L. Irradiation induced damage of adenine by low energy N+implantation[J]. International Journal of Radiation Research, 1996, 14(3): 157-161.

[21] YANG Jianbo, WU Lijun, LI Li, et al. Sequence analysis of lacZ mutations induced by ion beam irradiation indouble-stranded M13 mp 18 DNA[J]. Science in China: Series C, 1997, 40(1): 107-112.

Breeding of Cordyceps militaris Strain with High Selenium Enrichment by Low-Energy Ion Beam Implantation

WANG Tao, LI Wen, CHEN Hong-wei, LI Tong-xiang*, ZHAO Tian-lan
(Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

In the present study, investigations were carried out to optimize the medium components for enhanced enrichment of the dietary microelement selenium (Se) in Cordyceps militaris mycelia. The Cordyceps militaris strain No.13 preserved in our laboratory was improved by low-energy nitrogen ion beam implantation under optimal operating conditions to increase Se enrichment in the mycelia. The Se contents in the original and mutant strains were determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS). Results showed that the optimal medium components for Se enrichment in Cordyceps militaris mycelia were determined as follows: peptone 3 g/100 mL, glucose 3 g/100 mL and Na2SeO38 μg/mL at pH 7.0, resulting in a selenium enrichment rate of 21.58%. The optimal parameters for lowenergy nitrogen ion beam implantation were achieved at an energy of 10 keV and a dose of 1.82×1015ions/cm2. Ten mutant strains showing higher Se-enriching capacity were obtained. The highest Se enrichment rate of 30.97% was observed, nearly 42% higher than that of the original strain.

Cordyceps militaris; selenium; low-energy ion beam; enrichment; implantation

Q939.96

A

1002-6630（2014）15-0136-05

10.7506/spkx1002-6630-201415028

2013-06-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273004；31270577）；江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目（10KJD180006）

王陶（1976—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)殡x子束生物工程學(xué)和資源微生物學(xué)。E-mail：wangtaohf@126.com

*通信作者：李同祥（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锕こ碳跋嚓P(guān)技術(shù)。E-mail：litx@xzit.edu.cn