金蕎麥(-)-表兒茶素抗氧化活性研究

黃仁術，易 凡，何惠利，吳宋華親，方嬌嬌，楊 敏

（1.植物細胞工程安徽省工程技術研究中心，安徽 六安 237012；2.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012）

金蕎麥(-)-表兒茶素抗氧化活性研究

黃仁術1,2，易 凡2，何惠利2，吳宋華親2，方嬌嬌2，楊 敏2

（1.植物細胞工程安徽省工程技術研究中心，安徽 六安 237012；2.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012）

研究金蕎麥中(-)-表兒茶素活性物質的抗氧化活性。超氧陰離子自由基清除實驗表明其抗氧化率達到83.08%；羥自由基清除實驗表明活性物質質量濃度對清除率的影響差異極顯著（P＜0.01），質量濃度為0.350 mg/mL時清除率達77.30%；還原力測定實驗表明其還原力達到同質量濃度VC的48.02%，且質量濃度對還原力的影響差異極顯著（P＜0.01）；乙醇提取物中活性物質含量達1.40 mg/mL，占塊根干物質質量的2.52%。實驗證明金蕎麥(-)-表兒茶素活性物質具有很好的抗氧化活性，可作為一種天然、高效的抗氧化劑。

金蕎麥；(-)-表兒茶素；抗氧化

所有需氧生物的生理過程均會產生自由基，氧自由基損傷與人類的l00 種疾病有直接關系，如動脈粥樣硬化、肝病、糖尿病、癌癥等[1-2]。而抗氧化劑能對抗自由基的氧化作用，有效防止正常細胞的癌變[3]。現有研究表明，植物中的多酚類、多糖、維生素類、萜類、生物堿類、苷類、讖醇類、氨基酸、蛋白質等化合物都具有抗氧化功能，能抵御自由基、延緩衰老[4]。

金蕎麥（Fagopyrum cymosum (Trev.) Meism）系蓼科蕎麥屬多年生草本植物，屬國家二級保護的野生藥用植物，分布于我國黃河以南各省區(qū)[5]。金蕎麥的藥用部位為塊根，其塊根的乙醇提取物中含有原花色素的縮合性單寧混合物，主要由(-)-表兒茶素，少量的(+)-兒茶素，以及二者的二聚體和沒食子酸酯構成[6]?，F代藥理研究表明這些類黃酮次生代謝產物具有抗腫瘤、降血糖、調節(jié)血脂、抗氧化、鎮(zhèn)痛解熱等多種功效[7]。近年來，有關蕎麥屬植物抗氧化活性研究的報道較多，涉及的物質包括多酚類、黃酮類、多糖、植物性膳食纖維、蛋白質等。但研究對象多為栽培品種甜蕎麥和苦蕎麥的芽、苗、皮、粉。如楊芙蓮等[8]研究了甜蕎麥殼中原花青素提取及抗氧化性；方玉梅等[9]研究了苦蕎麥苗期黃酮類化合物的抗氧化性；任順成等[10]研究了蕎麥粉、皮、芽中黃酮類化合物抗氧化性；孫國娟等[11]研究了不同生長階段蕎麥芽總黃酮的抗氧化活性；鐘耕等[12]研究了苦蕎麥粉乙醇提取物抗氧化作用；李光等[4]研究了野生品種金蕎麥葉的抗氧化活性。實質上，蕎麥抗氧化活性的大小不僅與其抗氧化物質的含量有關，而且與蕎麥種類和生育時期有關[2]。為此，開展金蕎麥藥用部位塊根的乙醇提取物――(-)-表兒茶素活性物質的抗氧化活性研究，以期從野生藥用植物中尋找一種天然、高效的抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金蕎麥塊根采集自安徽省潛山縣。

(-)-表兒茶素（純度≥98%） 中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇 江蘇強盛功能化學股份有限公司；香莢蘭素（純度≥99.0%） 北京化學試劑公司；濃鹽酸、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸、三氯乙酸 汕頭西隴化工有限公司；鄰苯三酚（AR）、抗壞血酸（純度≥99.7%） 天津市博迪化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷 上海山浦化工有限公司；鄰菲羅啉 上海凌峰化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉 上海榮潤化工有限公司；過氧化氫 蚌埠驕陽藥業(yè)有限公司；鐵氰化鉀 中國上海試劑一廠；三氯化鐵 廣東臺山化工廠。

1.2 儀器與設備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；202-1型電熱恒溫干燥箱 上海浦東英豐科學儀器有限公司；HH-2/HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金蕎麥(-)-表兒茶素的提取與測定

1.3.1.1 金蕎麥(-)-表兒茶素的提取

取金蕎麥塊根干燥粉碎物3 g，在20℃于54 mL、60%乙醇中浸泡30 min，提取物以4 000 r/min的速度離心5 min，取上清液過濾，用60%乙醇定容至54 mL，室溫保存待用[13]。

1.3.1.2 金蕎麥(-)-表兒茶素的測定

香莢蘭素-鹽酸分光光度法對表兒茶素含量測定的標準曲線：Y=0.226 2X-0.012 6，R=0.999 3，式中，Y為吸光度（A），X為測定液質量濃度/（μg/mL）；金蕎麥提取液測定時，取0.1 mL提取液和10 mL乙醇于50 mL容量瓶中，用質量濃度為10 g/L的香莢蘭濃鹽酸定容，測定吸光度，根據吸光度和標準曲線可計算測定液中(-)-表兒茶素質量濃度[14]。

1.3.2 超氧陰離子自由基（O2-·）清除實驗

O2-·清除采用鄰苯三酚自氧化法測定[15]。

1.3.2.1 鄰苯三酚的自氧化速率測定

自氧化組于試管中加入蒸餾水0.5 mL和pH 8.2的0.1 mol/LTris-HCl-EDTA緩沖液4.5 mL，25 ℃恒溫10 min，再加入22.5 mmol/L鄰苯三酚0.01 mL，迅速搖勻倒入1 cm比色皿中，在325 nm波長處測定吸光度，每隔30 s測定1次，共測8次。同時用空白對照組（蒸餾水代替鄰苯三酚）調零，作吸光度隨時間變化的回歸方程，計算其自氧化速率△A1。

1.3.2.2 金蕎麥乙醇提取物的抗氧化率測定

同上，抗氧化組以等量金蕎麥乙醇提取物替代蒸餾水，做4個重復，空白對照組（蒸餾水代替鄰苯三酚）調零，測定吸光度，作回歸方程計算鄰苯三酚自氧化速率△A2。

1.3.3 羥自由基（·OH）清除實驗

·OH清除采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定[15]。

取1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液于試管中，依次加入2 mL pH 7.4的0.2 mol/L磷酸緩沖溶液和2 mL蒸餾水，充分混勻后，加1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液混勻，37 ℃保溫1 h，于536 nm處測定吸光度A0。實驗重復4次。同上，以1 mL 3%雙氧水替代1 mL蒸餾水作為損傷管，測定吸光度A1；以1 mL金蕎麥乙醇提取物和1 mL雙氧水替代2 mL蒸餾水作為實驗管，測定吸光度A2。

1.3.4 還原力測定

還原力測定采用普魯士蘭法測定[15-16]。

1.3.4.1 金蕎麥(-)-表兒茶素與VC還原力的比較

向1 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L、pH 6.6）中依次加入質量分數1%的鐵氰化鉀溶液1 mL、樣品液1 mL，混勻，50℃反應20 min，冷卻后加入質量分數10%的三氯乙酸1 mL，混勻后以3 000 r/min的速度離心10 min，取上清液2 mL與蒸餾水2 mL、質量分數0.04%的三氯化鐵溶液2 mL混勻，室溫下反應10 min，于700 nm波長處測定其吸光度，重復4 次。以蒸餾水組為對照組，測定質量濃度均為1 mg/mL的金蕎麥(-)-表兒茶素（取1.4 mg/mL的提取液10 mL，用60%乙醇定容至14 mL）及VC的還原力。1.3.4.2 金蕎麥(-)-表兒茶素還原力的測定

同上，將金蕎麥(-)-表兒茶素的提取液稀釋1、5、10、15倍，測定其不同稀釋倍數下的還原力，探討質量濃度對還原力的影響。

1.4 數據分析

數據方差分析采用F檢驗，對F檢驗存在差異顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）的處理，其各處理間具體的差異性檢驗采用新復極差法（SSR）檢驗。

2 結果與分析

2.1 金蕎麥(-)-表兒茶素的含量測定

由表1可見，金蕎麥的乙醇提取物中(-)-表兒茶素活性物質含量達到1.40 mg/mL，其塊根中(-)-表兒茶素活性物質含量占到干物質質量的2.52%。

表1 金蕎麥(-)-表兒茶素的含量Table 1 (-)-Epicatechin content in the root tubers of Fagopyrum dibottrryyss

2.2 金蕎麥(-)-表兒茶素對O2-·的清除作用

圖1 鄰苯三酚自氧化回歸方程Fig.1 Pyrogallol oxidation rate regressive equation

由圖1可知，自氧化組回歸方程為y=0.006 5x+ 1.031 1，鄰苯三酚的氧化速率△A1=0.006 5，抗氧化組回歸方程為y=0.001 1x+2.043 4，鄰苯三酚的氧化速率△A2=0.001 1，金蕎麥乙醇提取物的抗氧化率達到83.08%。

2.3 金蕎麥(-)-表兒茶素對·OH的清除作用

不同質量濃度金蕎麥(-)-表兒茶素的·OH清除率見表2。經F檢驗，F=33.61＞F0.01(5,18)=4.25，各處理間存在極顯著差異（P＜0.01）；進一步用SSR法檢驗具體處理間的差異，發(fā)現隨著金蕎麥(-)-表兒茶素質量濃度的增加，對·OH的清除率影響差異極顯著（P＜0.01）。當金蕎麥(-)-表兒茶素質量濃度達到0.350 mg/mL時，其對·OH的清除率達到77.30%。

表2 金蕎麥(-)-表兒茶素的·OH清除能力Table 2 Hydroxyl radical scavenging activity of (-)-epicatechin from the root tubers of Fagopyrum dibotrys

2.4 金蕎麥(-)-表兒茶素與VC還原力的比較

1 mg/mL的金蕎麥(-)-表兒茶素與1 mg/mL的VC溶液的還原力比較見表3。經F檢驗，F=58 701.12＞F0.01(2,9)= 8.02，各處理間差異極顯著（P＜0.01）；進一步用SSR法檢驗具體處理間的差異，發(fā)現金蕎麥(-)-表兒茶素的還原力顯著低于VC（P＜0.01），其還原能力只有VC的48.02%。

表3 金蕎麥(-)-表兒茶素與VC的還原力比較Table 3 Comparison of reducing power between (-)-epicatechin from the root tubers of Fagopyrum dibotrys and VC

2.5 金蕎麥(-)-表兒茶素質量濃度對還原力的影響

不同質量濃度金蕎麥(-)-表兒茶素的還原力比較見表4。經F檢驗，F=11.349 0＞F0.01(2,9)=5.95，各處理間存在極顯著差異（P＜0.01）；進一步用SSR檢驗具體處理間的差異，發(fā)現隨著金蕎麥(-)-表兒茶素質量濃度的升高，其還原力逐漸增強，并且當質量濃度高于0.280 mg/mL時，其還原力顯著高于0.140 mg/mL及以下低質量濃度組（P＜0.01）。

表4 不同質量濃度金蕎麥(-)-表兒茶素的還原力Table 4 Reducing power of (-)-epicatechin from the root tubers of Fagopyrum dibotrys

3 結 論

黃酮類化合物包括黃酮類和黃酮醇類、二氫黃酮類和二氫黃酮醇類、異黃酮類和二氫異黃酮類、查耳酮和二氫查耳酮類、橙酮類、花色素類和黃烷醇類、雙黃酮類、高異黃酮、呋喃色原酮、苯色原酮等15 種[17]。其中，黃烷醇類是一類廣泛存在于天然植物中的多元酚化合物，又以兒茶素類活性物質為代表[18]。本實驗測得金蕎麥的乙醇提取物中(-)-表兒茶素活性物質含量達到干物質重的2.52%，即25.2 mg/g。李光等[4]研究報道金蕎麥葉的總黃酮含量為89.395 9 mg/g?？梢?，金蕎麥的黃酮類物質豐富，且以黃烷醇類中的(-)-表兒茶素為主。

金蕎麥(-)-表兒茶素活性物質的抗氧化實驗顯示，其對O2-·有明顯的清除作用，清除率達到83.08%；金蕎麥(-)-表兒茶素的質量濃度極顯著地影響·OH清除率，當藥物質量濃度達到0.350 mg/mL時，對·OH清除率達到77.30%；1 mg/mL金蕎麥(-)-表兒茶素的還原力達到同質量濃度VC的48.02%，隨著金蕎麥(-)-表兒茶素質量濃度的升高，其還原力極顯著增強。

在蕎麥屬其他植物抗氧化活性研究中，何永艷等[2]報道，苦蕎麥地上部分乙醇提取物的抗氧化性高于甜蕎，且以盛花期最強，·OH的清除率達57.1%；而甜蕎除盛花期外，在苗期和收獲期幾乎對·OH沒有清除率。方玉梅等[9]報道，苦蕎麥苗乙醇提取黃酮類化合物的質量濃度為46.674 3 μg/mL，在質量濃度為0.004 67 μg/mL時，對O2-·抑制率達到最高為84.38%，對·OH的抑制率隨著黃酮質量濃度的增大而增大，46.674 μg/mL時抑制率達到最大為37.23%。黃酮類化合物的抗氧化功能是因黃酮類化合物能成為自由基的接受體，阻斷自由基連鎖反應；黃酮類化合物和金屬生成螯合物，抑制了金屬的氧化作用；黃酮類化合物還能抵抗脂肪氧化酶催化反應[19]。

綜上所述，蕎麥屬植物乙醇提取物對O2-·的抑制率相近，且其活性物質的質量濃度對·OH的抑制率影響差異顯著。金蕎麥作為蕎麥屬的野生品種，其藥用有效活性成分和效果，遠遠高于栽培品種[20]。鑒于(-)-表兒茶素活性物質在金蕎麥中含量高，提取方法簡單，又具有很好的抗氧化活性，可作為一種天然、高效的抗氧化劑加強開發(fā)，今后還需進一步研究其在動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等病理學研究中的潛在價值。

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Antioxidant Activity of (-)-Epicatechin from the Root Tubers of Fagopyrum dibotrys

HUANG Ren-shu1,2, YI Fan2, HE Hui-li2, WU Song-hua-qin2, FANG Jiao-jiao2, YANG Min2
(1. Engineering Technology Research Center of Plant Cell Engineering, Anhui Province, Lu’an 237012, China; 2. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu’an 237012, China)

The antioxidant activity of (-)-epicatechin extracted with ethanol from the root tubers of Fagopyrum dibotrys was evaluated in this study. Results showed that the (-)-epicatechin extract could scavenge 83.08% of superoxide anion radical; its hydroxyl radical scavenging capacity was very significantly affected by its concentration (P ＜ 0.01), and 77.30% of hydroxyl radical was scavenged at a concentration of 0.350 mg/mL. The epicatechi extract, showing a significant concentration-effect relationship (P ＜ 0.01), was only 48.02% as effective as vitamin C at the same concentration in reducing Fe3+. The ethanol extract contained 1.40 mg/mL active components, accounting for 2.52% of the dried root tubers of Fagopyrum dibotrys. This study proves that (-)-epicatechin from the root tubers of Fagopyrum dibotrys has strong antioxidant activity as a natural potent antioxidant.

Fagopyrum dibotrys; (-)-epicatechin; antioxidant

R931.6

A

1002-6630（2014）15-0118-04

10.7506/spkx1002-6630-201415024

2013-10-14

安徽省高校省級自然科學研究重點項目（KJ2012A280）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201210376004）

黃仁術（1976—），女，副教授，碩士，主要從事天然活性物質開發(fā)研究。E-mail：ahhrs@126.com