不同豆?jié){制備工藝活性成分與DPPH自由基清除能力比較研究

于寒松，張 偉，陳今朝，胡耀輝,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心加工研究室，吉林 長春 130118）

不同豆?jié){制備工藝活性成分與DPPH自由基清除能力比較研究

于寒松1,2，張 偉1，陳今朝1，胡耀輝1,2,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心加工研究室，吉林 長春 130118）

以7個品種的大豆為原料，分別以生漿工藝和熟漿工藝制備豆?jié){，通過福林-酚法、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法、反相高效液相色譜和DPPH法對各個樣品中的總酚含量、總黃酮含量、異黃酮和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力性進行測定。結(jié)果表明：原料、熟漿工藝豆?jié){與生漿工藝豆?jié){總酚和總黃酮含量以及DPPH自由基清除能力均具有顯著性差異（P＜0.05），熟漿工藝豆?jié){的總黃酮、總酚和DPPH自由基清除能力均高于生漿工藝豆?jié){，異黃酮含量差異不顯著（P＞0.05）。

大豆；生漿工藝；熟漿工藝；活性成分；DPPH自由基清除能力

大豆能提供豐富的主要營養(yǎng)元素和微量營養(yǎng)元素，除了自身的營養(yǎng)價值外，大豆還被長期認定為能夠促進肌體健康的功能性食品，同時具有治療能力[1]。大豆還具有降低血糖指數(shù)[2]和預(yù)防乳腺癌[3]作用，對治療心血管疾病和促進骨骼健康也有很好的療效[4]。近期實驗研究證明，大豆具有明顯的抗氧化活性[5-7]。這些結(jié)果表明，大豆作為一種優(yōu)良食物，在預(yù)防疾病和天然抗氧化劑方面都是很好的來源。在各種大豆制品中，豆?jié){的蛋白質(zhì)消化率最高（約為95%），可被人體充分利用，且豆?jié){不含乳糖，不會產(chǎn)生“乳糖不耐癥”等過敏問題，豆?jié){還不含膽固醇和淀粉，適用于患心腦血管疾病的患者和糖尿病以及肥胖癥患者飲用[8]，是老少皆宜的營養(yǎng)食品。

Toda等[8]詳細分析了生漿、熟漿工藝豆?jié){中蛋白、脂肪含量及豆乳黏度等差異，李景妍等[9]分析了生熟漿豆?jié){的香氣差異。豆?jié){作為一種健康飲品，對其活性成分含量和DPPH自由基清除能力研究卻未見報道，對不同制漿工藝即加工工藝對活性成分的影響更是沒有系統(tǒng)的研究。因此，本實驗采用7 種不同的大豆品種分別采用熟漿和生漿制備豆?jié){，對所有樣品進行總酚、總黃酮、異黃酮以及DPPH自由基清除能力檢測分析，并進行比較研究，分析這兩種工藝存在的優(yōu)缺點。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大豆品種五星4號、冀豆12、冀豆15、冀豆17、鐵豐29、鐵豐31和齊黃34由國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心提供。

大豆異黃酮標(biāo)品：染料木苷（genistin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）、大豆苷（daidzin）、黃豆黃素（glycitein） 成都曼斯特生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Trolox標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；福林酚 上海荔達生物科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

InfiniteM200酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；LC20A高效液相色譜 日本島津公司；ALPHA1-2L型冷凍干燥機瑞士布奇公司；GL-20G-Ⅱ離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3方法

1.3.1豆?jié){制備工藝

將大豆原料進行挑選，除雜，分別稱取2 份130 g大豆作為兩種制漿工藝，洗凈后加5 倍水20 ℃浸泡16 h，清洗瀝干添加9 倍大豆質(zhì)量的水磨漿，所得豆糊根據(jù)不同制漿工藝分別采取不同加工方法制備生熟豆?jié){，制漿工藝流程如下：

生漿工藝生產(chǎn)流程：挑選大豆→浸泡→粗磨漿→精磨漿→過濾→煮沸5 min→豆?jié){

熟漿工藝生產(chǎn)流程：挑選大豆→浸泡→粗磨漿→精磨漿→帶渣煮沸5 min→過濾→豆?jié){

1.3.2樣品預(yù)處理

精確稱取0.5 g冷凍干燥豆?jié){粉末，每種樣品分別取3 個平行樣，置于45 mL離心管中，分別向離心管中添加5 mL酸性丙酮溶液（丙酮與蒸餾水與乙酸體積比為70∶29.5∶0.5），并對離心管進行密封，將離心管放置在恒溫培養(yǎng)振蕩器上，常溫300 r/min振蕩3 h，振蕩結(jié)束后，將樣品提取液在黑暗條件下靜置12 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，于4 ℃冰箱中冷藏保存，待測。

1.3.3干物質(zhì)含量測定

精確稱取大豆原料粉末與不同工藝制備豆?jié){的凍干粉末2.000 0 g（精確至±0.000 1 g），在105 ℃烘干

12 h，得到其干物質(zhì)含量。

1.3.4總酚含量測定

采用文獻[10-11]中的福林酚法并稍作修改，以沒食子酸為標(biāo)品，分別配制20、40、60、80、100、120、140 μg/mL梯度的沒食子酸乙醇溶液，以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程：y=0.043 6x+0.044 7（R2=0.991）。

取50 μL標(biāo)品或樣品，加入3 mL蒸餾水，250 μL福林酚試劑和7%Na2CO3溶液，室溫下漩渦混勻，靜置2 h，用200 μL微量移液器分別將混合溶液移至96孔板上，用酶標(biāo)儀于765 nm波長處測定其吸光度。

1.3.5總黃酮含量測定

采用Heimler等[5]的比色法測定。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制 10、20、40、60、80、100、200、300 μg/mL梯度的蘆丁乙醇溶液，以蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程：y=0.006x+0.043（R2=0.999）。

取0.5 mL標(biāo)品或樣品提取液，加95%乙醇1.0 mL，再加入0.25 mL 4% NaNO2溶液 (現(xiàn)用現(xiàn)配)，靜置6 min，再分別加入0.25 mL10% Al(NO3)3溶液，靜置6 min，最后各加入1.5 mL 4%NaOH溶液，用自封膜封好后通過漩渦混合器完全混勻。分別轉(zhuǎn)移不同樣品混合物200 μL至96孔板上，用酶標(biāo)儀于510 nm波長處測定其吸光度。

1.3.6異黃酮含量的檢測

樣品處理：精確稱取1.00 g凍干樣品，加入5 mL乙腈和4.5 mL蒸餾水，室溫下靜止2 h，6 000 r/min離心20 min，用NO.42濾紙過濾后在35 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮液，加5 mL 80%甲醇復(fù)溶，取20 μL進行高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

HPLC分析條件：色譜柱：YMC-Pack ODS-AM-303（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：體積分數(shù)0.1%乙酸的水溶液，流動相B：體積分數(shù)0.1%乙酸的乙腈溶液，梯度洗脫條件如表1所示；流量：1.0 mL/min；柱溫：34 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：262 nm。

表1　高效液相色譜儀的流動相條件Table 1 Mobile phase conditions for HPLC

將5種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品分別配制質(zhì)量濃度10、20、30、40、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)得到不同的異黃酮單體的線性回歸方程：大豆苷：y=350 000x+200 000（R2=0.995 4）；染料木苷：y=200 000x+572 60（R2=0.991 6）；大豆苷元：y=750 000x-170 000（R2=0.994 5）；黃豆黃素：y=210 000x+554 99（R2=0.991 9）；染料木素：y=990 000x+589 69（R2=0.992 4）。

1.3.7DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力采用Chen等[12]的方法，取0.2 mL樣品或Trolox，加入3.8 mL的0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，用自封膜封口，通過漩渦混合器完全混勻，在室溫下靜置30 min。靜置結(jié)束后，分別轉(zhuǎn)移不同樣品混合物200 μL至96孔板上，使用酶標(biāo)儀在517 nm波長處測定吸光度。

分別制備500、250、100、50、20 μmol/L不同濃度梯度的Trolox乙醇溶液。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2.645 4x+0.113 3（R2=0.999 5）。清除率按照下式計算：

式中：A0為空白式樣（95%乙醇）與DPPH溶液混合后所測得的吸光度；Ai為不同濃度梯度Trolox溶液或樣品與DPPH溶液混合后所測得的吸光度。

Trolox濃度當(dāng)量由標(biāo)準(zhǔn)曲線通過樣品的清除率計算。1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均重復(fù)3 次，進行多組樣本間差異顯著性分析時P=0.05，皮爾遜相關(guān)系數(shù)（r）用來評價兩個變量的線性相關(guān)性，分析均采用SAS 9.3軟件，檢測分析結(jié)果表示為

2　結(jié)果與分析

2.1不同樣品干物質(zhì)含量

表2　不同大豆品種原料豆粉及生熟漿粉末的干物質(zhì)含量Table 2 Dry matter contents of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varieties%

2.2不同樣品總酚含量比較分析

表3　不同大豆品種原料豆粉及生熟漿凍干粉末總酚含量Table 3 Total phenol contents of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varietiesmg/g

由表3可知，7 種不同大豆品種的總酚含量差異比較大，變化范圍從2.98～5.24 mg/g，冀豆17號總酚含量為齊黃34號的1.8倍；然而不同大豆品種制備的熟漿中總酚含量均高于生漿的總酚含量，且均具有顯著差異（P＜0.05），其中鐵豐31號，熟生漿的總酚含量差異性最大，其熟漿總酚含量為5.14 μg/mg，生漿總酚含量為3.29 μg/mg，熟漿總酚含量是生漿的1.6倍。熟漿的總酚含量均高于原料的總酚含量，且也具有顯著差異（P＜0.05），這與曹展等[13]的研究結(jié)果一致，分析可能是多酚的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)在加熱時發(fā)生改變而導(dǎo)致溶出率的變化。但是原料與生漿總酚含量相比，除了五星4號外，其他原料品種總酚含量都略高于生漿總酚含量，說明在生漿制漿工藝中，多酚類物質(zhì)損失比較多。

2.3不同樣品總黃酮含量比較分析

表4　不同大豆品種原料豆粉及生熟漿凍干粉末總黃酮含量Table 4 Total flavonoids contents of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varieties mg/g

由表4可知，7 種不同大豆品種的總黃酮含量互相差異均顯著（P＜0.05），變化范圍從24.34～31.71 mg/g；不同大豆品種制備的熟漿中總黃酮含量均高于生漿的總黃酮含量，且均具有顯著差異（P＜0.05）。熟漿的總酚含量均高于原料的總黃酮含量，生漿的總酚含量均低于原料的總黃酮含量，且也具有顯著差異（P＜0.05），說明熟漿溶解出的黃酮含量要高于生漿。

2.4 不同樣品異黃酮含量比較分析

已從大豆中分離出12 種異黃酮類化合物，即9 種異黃酮糖苷和3 種相應(yīng)的糖苷配基[14]。其中主要成分為大豆苷和染料木苷，占總異黃酮量的98%左右。本實驗主要考察不同樣品中染料木苷和大豆苷的含量及其對DPPH自由基清除能力的影響。

表5　不同大豆品種原料豆粉及生熟漿凍干粉末大豆異黃酮含量Table 5 Isoflavone contents of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varietiesmg/g

由表5可知，不同的大豆原料異黃酮含量差別較大，變化范圍從1.93～4.41 mg/g，冀豆17號的異黃酮含量是鐵豐31號的2.3 倍；但冀豆15號、鐵豐31號和齊黃34號的染料木苷含量差異不顯著（P＞0.05），所有的大豆品種不同豆?jié){制備工藝的大豆苷含量差異不顯著（P＞0.05），染料木苷含量只有冀豆12號生漿和熟漿差異顯著（P＜0.05）。因此，熟漿工藝和生漿工藝對豆?jié){中的異黃酮含量影響不大。

表6　不同大豆品種原料豆粉及生熟漿凍干粉末DPPH自由基清除能力Table 6 Free radical-scavenging capacity of soybean powder and two lyophilized soymilk powders from different varieties μmol Trolox /L

由表6可知，熟漿工藝與生漿工藝相比較，不同大豆品種制備的熟漿的抗氧化能力均強于生漿的抗氧化能力，且均具有顯著性差異（P＜0.05）。而除了齊黃34號，不同大豆品種制備的生漿DPPH自由基清除能力均低于大豆原料的DPPH自由基清除能力。

表7　同大豆品種原料豆粉及生熟漿凍干粉末DPPH自由基清除能力與活性成分的相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis between DPPH radical-scavenging capacity and three active components

由表7可知，原料總酚含量與其DPPH自由基清除能力具有明顯的線性正相關(guān)性（r=0.90），熟漿的異黃酮含量與熟漿DPPH自由基清除能力具有線性正相關(guān)性（r=0.88），而生漿的異黃酮含量與其DPPH自由基清除能力沒有線性相關(guān)性（r=-0.15），熟漿的總酚含量與其DPPH自由基清除能力也沒有線性相關(guān)性（r=-0.06）。

3　結(jié) 論

通過對7個不同品種大豆以及不同制漿工藝生產(chǎn)得到的大豆原料和豆?jié){樣品進行分析，得到了不同樣品的總酚含量、總黃酮含量、異黃酮含量的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)熟漿工藝的總酚含量和總黃酮含量都高于原料和生漿工藝相應(yīng)成分的含量，而異黃酮含量在原料、生漿和熟漿工藝中差異均不顯著（P＞0.05），實驗結(jié)果表明熟漿工藝在總酚和總黃酮活性成分的溶出和保留方面要明顯優(yōu)于生漿工藝。

進一步對不同品種大豆原料和豆?jié){樣品的DPPH自由基清除能力分析研究表明，原料總酚含量與其DPPH自由基清除能力具有明顯的線性正相關(guān)性，熟漿的異黃酮含量與熟漿DPPH自由基清除能力具有線性正相關(guān)性，而生漿的異黃酮含量與其DPPH自由基清除能力沒有線性相關(guān)性，熟漿的總酚含量與其DPPH自由基清除能力也沒有線性相關(guān)性。由于黃酮類化合物加熱可以分解為活性成分糖苷配基[14]，所以雖然不同品種的熟漿與生漿、原料的異黃酮含量沒有顯著性差異，但是不同品種的熟漿、生漿和原料的異黃酮含量卻與DPPH自由基清除能力相關(guān)性差異較大（r=0.37、r=-0.15和r=0.88），由此推斷可能是總酚和黃酮類化合物中的活性成分糖苷配基與DPPH自由基清除能力的相關(guān)性更高，該推論有待進一步研究。

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Comparisons of Chemical Components and DPPH Free Radical-Scavenging Capacity of Soymilk from Different Preparation Methods

YU Han-song1,2, ZHANG Wei1, CHEN Jin-zhao1, HU Yao-hui1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Division of Soybean Processing, Soybean Research & Development Center, China Agriculture Research System, Changchun 130118, China)

Soymilk was prepared from seven varieties of soybeans by two different methods, namely filtrating soybean homogenate before boiling (method 1) and filtrating after boiling raw soymilk with okara (method 2). The total phenols, total flavonoids, isoflavones and free radical-scavenging capacity were determined by Folin-Ciocalteu colorimetry, NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetry, reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH) free radical scavenging assay, respectively. The results showed that the contents of total phenol and total flavonoids and free radical-scavenging capacity were significantly different among raw soymilk and cooked soymilk from both methods (P ＜ 0.05). The second method resulted in higher levels of total flavoniods and total phenols and stronger DPPH free radical scavenging capacity in soymilk than the first method, but without a significant difference in isoflavone content (P ＞ 0.05).

soybean; filtration of soybean homogenate before boiling; filtration after boiling; active components; DPPH free radical-scavenging capacity

TS214.2

A

1002-6630（2014）15-0063-05

10.7506/spkx1002-6630-201415013

2013-07-20

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（大豆）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-04）

于寒松（1979—），男，副教授，博士，研究方向為豆制品加工。E-mail：yuhansong@jluhp.edu.cn

*通信作者：胡耀輝（1951—），男，教授，學(xué)士，研究方向為食品生物制造與新資源利用。E-mail：huyaohui@vip.163.com