工蜂采集蜂膠的行為觀察及膠源植物的研究

胡 浩，董 捷，張紅城，曾曉雄*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂產(chǎn)品加工分中心，北京 100093）

工蜂采集蜂膠的行為觀察及膠源植物的研究

胡 浩1,2，董 捷2，張紅城2，曾曉雄1,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂產(chǎn)品加工分中心，北京 100093）

蜂膠中大約50%成分來自植物樹脂，不同地區(qū)的蜂膠具有不同的植物來源。本實驗通過對工蜂采集蜂膠的行為進(jìn)行觀察，并運(yùn)用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對加拿大楊樹芽的樹脂（簡稱加楊芽脂）、采膠工蜂后足上的樹脂和蜂箱中蜂膠的多酚類成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：加楊芽脂、工蜂后足上的樹脂和蜂膠不僅在物理狀態(tài)上非常接近，而且在化學(xué)成分及其相對含量上也很相似。因此，中國蜂膠的膠源植物是黑楊派中歐洲黑楊以及它的雜交品種——加拿大楊。

高效液相色譜；蜂膠；膠源植物；加拿大楊芽脂

蜂膠是工蜂采集植物組織分泌的樹脂，并混合蜂蠟、花粉和自身分泌物等物質(zhì)，最終得到的一種具有特殊氣味的黏性混合物[1]。蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，并具有多種生物學(xué)活性[2]，如抗氧化[3]、抗癌[4]、抗血糖[5]、抗菌[6]等。蜜蜂用蜂膠填補(bǔ)蜂箱的縫隙來加固蜂箱以及涂抹在蜂箱表面來抑菌，從而提高整個蜂群抵抗病原微生物的能力[2,7]。不同氣候條件下生長的產(chǎn)膠植物不同，蜜蜂采集蜂膠的植物來源也不一樣[8-11]。不同的膠源植物導(dǎo)致了蜂膠的化學(xué)成分存在差異，從而最終影響到蜂膠的生物學(xué)活性[12]。目前研究報道北半球溫帶地區(qū)的蜂膠屬于楊樹型，其植物來源是楊屬中的黑楊派楊樹；黑楊派又分為歐洲黑楊和美洲黑楊兩個種，以歐洲黑楊作為蜂膠的膠源植物最為常見[13]。我國飼養(yǎng)的采膠蜜蜂主要是意大利蜜蜂（Apis mellifera），其在歐洲采集歐洲黑楊的樹脂生產(chǎn)蜂膠[14]。原產(chǎn)于我國本土的黑楊很少，僅在阿爾泰地區(qū)有歐洲黑楊的天然林分布，及新疆地區(qū)生長著美洲黑楊的一個小種[15]，但我國引種的黑楊派間雜交品種，如加拿大楊（簡稱加楊）、健楊、72楊等分布很廣泛[16]。我國楊樹人工林70%以上都是黑楊派雜交樹種[16]。我國的楊樹資源非常豐富，從新疆到東部沿海，從黑龍江、內(nèi)蒙古到長江流域均有分布，現(xiàn)已成為世界上楊樹人工林面積最大的國家。目前，雖然普遍認(rèn)為我國的蜂膠屬于楊樹型[17-18]，但關(guān)于工蜂采集蜂膠的一系列過程以及具體采自何種楊樹，至今尚無詳細(xì)報道。本實驗通過觀察在北京香山地區(qū)意大利蜜蜂的工蜂采集蜂膠的行為，以及采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析蜂膠、采膠工蜂后足上的樹脂和加拿大楊樹芽的樹脂（簡稱加楊芽脂）的多酚類成分，來研究蜂膠的植物來源。從而為建立中國蜂膠化學(xué)成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供相應(yīng)的依據(jù)，具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

加楊芽脂：在北京植物園內(nèi)采集分泌芽脂的新鮮加拿大樹芽，置于-80 ℃冰箱中1 h，取出置于密封袋中輕輕敲打，脫落下來的紅色物質(zhì)即為加楊芽脂，置于-20 ℃中貯存；采膠工蜂后足上的樹脂 用鑷子在從蜂箱中捕獲的采膠工蜂的后足上刮取，置于-20 ℃中貯存；蜂膠：用刮刀刮自于飼養(yǎng)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所（北京植物園，香山）內(nèi)的蜜蜂蜂箱中，并置于-20 ℃中貯存。

甲醇（CR） 美國Fisher公司；乙醇 北京試劑公司；乙酸（色譜級） 西隴化工股份有限公司；實驗中所用的標(biāo)品均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統(tǒng) 美國Merk Millipore公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5 型低速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；微量移液器 德國Eppendorf公司；HZS-H型水浴搖床 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；LC-6AD高效液相色譜儀（配有二極管陣列紫外檢測器(PDA)、SIL-自動進(jìn)樣器、CTO-10A柱溫箱、LCsolution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 日本島津公司；SONY DSC-T900相機(jī) 日本Sony公司。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂采集蜂膠行為的觀察

本實驗于2013年6月1日—7月31日期間對飼養(yǎng)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所內(nèi)的6箱蜜蜂進(jìn)行觀察，并用照相機(jī)記錄工蜂采集樹脂及其攜帶樹脂回巢后在蜂箱中的行為。期間內(nèi)每周檢查3次蜂箱，每次觀察的時間段分布在上午9時至下午18時之間。如在蜂箱中發(fā)現(xiàn)有攜帶樹脂的蜜蜂，則進(jìn)行觀察記錄，并收集粘在工蜂的后足上的樹脂樣品。此外，在北京植物園中分別采集新鮮的毛白楊（Populus tomentosa Carr）、河北楊（Populus hopeiensis Huet Chow）、小葉楊（Populus simonii Carr）、鉆天楊（Populus nigra varitalica）、加拿大楊（Populus canadensis Moench）的樹芽，插在距離蜂箱周圍1 m的空地上，連續(xù)10 d對工蜂采集蜂膠的行為進(jìn)行觀察（每天必須是新鮮采集的樹芽）。

1.3.2 蜂膠、采膠工蜂后足上的樹脂和加楊芽脂的處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g蜂膠、采膠工蜂后足上的樹脂和加楊芽脂于10 mL的容量瓶中，用75%乙醇溶液定容到10 mL。超聲3 h，功率100 W，溫度25℃。超聲完后，在40 ℃、100 r/min水浴搖床中提取12 h。離心收集提取液，0.22 μm微孔膜過濾，待用；上樣前稀釋6 倍。

1.3.3 HPLC色譜條件

HPLC條件：Shim-Pack PREP-ODS（250 mm× 4.6 mm，5 μm）色譜柱；柱溫箱溫度35 ℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動相：B相 甲醇（0.1%乙酸），A相 水（0.1%乙酸），梯度洗脫程序如下：0～25 min，22%～36% B；25～55 min，36%～52% B；55～90 min，52%～63% B；90～115 min，63%～70% B；115～135 min，70%～75% B；135～150 min，75%～80% B；流速為1 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 工蜂采集蜂膠行為的觀察

蜜蜂具有3對足，分別是前足、中足和后足，它們的大小和形狀都不一樣，最具特色的是前足上的凈角器及工蜂后足上的花粉采集器和花粉框[19]?；ǚ劭蚴怯脕沓休d花粉的，但也用來運(yùn)輸蜂膠。目前已經(jīng)報道蜂膠是工蜂用上顎從植物組織上采集下來，在裝入花粉框中時，并不使用花粉鉗，而是使用前足和中足把樹脂收集起來，直接放在后足花粉框內(nèi)[19-20]。

圖1 工蜂采集蜂膠行為的觀察Fig.1 Photographs of resin-collecting activity of worker bees

圖1為記錄工蜂采集蜂膠行為的照片。觀察表明工蜂采集蜂膠并不像采蜜和花粉那樣每天都會大量采集，而是間隔一段時間采集一次。同時還發(fā)現(xiàn)，對于本實驗所用的5種楊樹樹芽中，工蜂只采集加楊樹芽分泌的樹脂作為其蜂膠的植物來源。加楊是黑楊派中歐洲黑楊和美洲黑楊的雜交品種，其具有和歐洲黑楊樹脂成分相近的樹脂，同時加楊能在樹芽上分泌大量的樹脂，而其他楊樹分泌樹脂的量和化學(xué)成分都具有很大差異[21]。此外，加楊在我國分布范圍很廣，其他種類的楊樹則分布則相對集中[15]。因此，引進(jìn)我國的蜜蜂在長期進(jìn)化過程中選擇加楊替代歐洲黑楊作為新的膠源植物，并不會隨意選擇其他楊樹來替代加楊作為膠源植物[22]。

通過觀察發(fā)現(xiàn)，工蜂首先找到表面分泌有樹脂的加楊樹芽，然后通過口器上顎咬住并來回撕扯得到樹脂，通過前足、中足把樹脂最終傳遞到放入后足的花粉框中（圖1a）。從圖1b可以明顯地看到，采集蜂膠的工蜂返回蜂巢時，在其兩只后足上有液態(tài)的紅色物質(zhì)。從外觀上可以判斷此物質(zhì)不是花蜜或花粉，只可能是樹脂。因為蜜蜂采集花蜜是通過吸食到胃部來運(yùn)輸?shù)?，花蜜不可能出現(xiàn)在后足上；蜜蜂采集花粉雖然也是由后足上的花粉框運(yùn)輸，但其是顆粒的并成團(tuán)狀，此物質(zhì)是液態(tài)的，而且具有很大的黏性，所以也不是花粉。圖1c中心處的工蜂（箭頭指出）正在用后足前后擺動來卸掉后足上的樹脂。通過觀察發(fā)現(xiàn)，采集蜂膠的工蜂回巢后，會在蜂脾上反復(fù)地來回走動。一方面工蜂在尋找到合適的位置，用前足把身體固定在蜂脾上，采用后足來回擺動磨蹭并和腹部產(chǎn)生一些摩擦，靠自身的力量卸下樹脂。其次是利用走動，通過部分卸下來的粘在蜂脾上的樹脂，拉扯下一部分仍粘在后足上的樹脂，這也解釋了在蜂脾上梁上為什么會散落很多一滴滴的紅色樹脂。最后，采膠工蜂通過來回走動，引起蜂脾上其他工蜂的注意，從而其他工蜂會聚集在其周圍，用上顎咬住其后足上的樹脂，并拉扯下來，由于樹脂黏性很大，此時常會被拉成一條很細(xì)長的絲。通過以上3種方式，工蜂最終能完全卸下后足上的樹脂，但整個過程是很耗時費力的。從圖1d可以看出，最終散落在蜂脾及蜂脾上梁的樹脂，再由工蜂用上顎運(yùn)輸，并與蜂蠟、花粉和自身的分泌物混合一起制成蜂膠涂抹在蜂箱內(nèi)壁上及空隙處。蜂膠具有很大的黏附力，蜂箱上的覆布會被緊緊地黏在蜂箱上。

在兩個月的觀察中發(fā)現(xiàn)，雨后蜂箱中的蜂膠會明顯增多，而且一般在雨后次日容易觀察到蜜蜂的采膠行為（圖1中照片拍攝于雨后次日上午）。這可能是因為雨后蜂箱中的縫隙會增大、增多，造成蜂箱滲水；此外，雨后蜂箱也較潮濕，容易染菌。因此工蜂在雨后次日采膠比較多，可能與其生活習(xí)性有關(guān)。另一方面，也可能和加楊樹芽分泌樹脂的生理習(xí)性有關(guān)[16]，雨后加楊芽脂的分泌量會增加，且比晴朗天氣時的黏性要小，利于工蜂采膠。

圖2是在北京植物園內(nèi)采集的分泌樹脂的新鮮加楊樹芽。楊樹的樹脂是由特定組織分泌的，屬于構(gòu)成型樹脂[22]。大多數(shù)楊樹樹脂由楊樹托葉中的表皮細(xì)胞分泌出來，并貯存在表皮細(xì)胞與托葉表面上包裹著一層角質(zhì)層間的空間內(nèi)；當(dāng)分泌達(dá)到一定量的時候，角質(zhì)層會破裂，表皮細(xì)胞分泌的樹脂就會流出到樹芽的表面[22]。加楊樹分泌樹脂的過程屬于這種類型。加楊芽脂富含酚酸和黃酮類物質(zhì)[23]，屬于酚類樹脂，其大部分化學(xué)成分是非揮發(fā)性的，具有保護(hù)加楊的嫩芽和幼葉避免受到害蟲的啃食及抑制水分快速揮發(fā)等生理作用[22]。通過對加楊樹芽分泌樹脂的觀察，發(fā)現(xiàn)每年的5—8月加楊樹上新生的嫩芽表面會包裹著大量液滴狀的紅色樹脂。在圖2可明顯看出，綠色加楊樹芽的表面上粘有一滴紅色的樹脂。加楊芽上的樹脂與圖1b中采膠工蜂后腿上攜帶的樹脂在顏色和狀態(tài)上都很相似，也都具有很強(qiáng)的黏性。此外二者還都具有相似的芬香氣味。因此從物理性質(zhì)上觀察，工蜂后足上的樹脂很可能是來自加楊芽脂。

圖2 加楊樹芽分泌的樹脂F(xiàn)ig.2 Photograph of bud resin secreted by Populus canadensis Moench

2.2 加楊芽脂、工蜂后足上的樹脂和蜂膠的HPLC圖譜

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品（a）、加楊芽脂（b）、工蜂后足樹脂（c）和蜂膠（d）的HPPLLCC圖譜Fig.3 Chromatograms of standard mixture (a), ethanol extracts from bud resin of Populus canadensis Moench (b) and resin collected from honeybee hind legs (c) and propolis (d)

由圖3可知，加楊芽脂、工蜂后足樹脂和蜂膠中都富含酚酸、黃酮和相應(yīng)的酯類[23-25]。除蜂膠中短葉松素-3-乙酸酯的峰（76 min）較后足上的樹脂和加楊芽脂中的高外，三者的圖譜非常接近，無論是在化學(xué)物質(zhì)的種類，還是在各物質(zhì)間的相對含量上。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版軟件》計算三者間的相似度，得到加楊芽脂與工蜂后足上的樹脂的相似度為0.977，蜂膠與加楊芽脂為0.896，蜂膠與工蜂后足上的樹脂為0.911，三者之間的相似度都比較高。加楊芽脂與工蜂后足上的樹脂的相似度非常高（0.977），說明二者的化學(xué)成分非常接近，基本上是同一種物質(zhì)，表明工蜂采集的就是加楊芽脂。蜂膠與工蜂后足上的樹脂的相似度（0.911）比蜂膠與加楊芽脂的（0.896）要高，這說明工蜂后足上的樹脂比加楊芽脂在化學(xué)組分上更接近蜂膠。從上面研究可以發(fā)現(xiàn)，工蜂采集蜂膠的過程是由加楊芽脂到工蜂后足上的樹脂，再到蜂箱中的蜂膠。在這個過程中，可能是工蜂在采集加楊芽脂的時候就混入了少量的其他物質(zhì)，才導(dǎo)致了采膠工蜂后足上的樹脂與蜂膠的成分更為接近。因此，從三者的HPLC圖譜可以判斷，工蜂是采集加楊芽脂作為蜂膠。但要更詳細(xì)地說明三者之間相似度的關(guān)系，則需要建立相應(yīng)的指紋圖譜。本課題組目前已經(jīng)完成了中國蜂膠指紋圖譜；由于工蜂采集蜂膠及加楊分泌樹脂具有季節(jié)性，工蜂后足樹脂和加楊芽脂的指紋圖譜正在完善中。

2.3 加楊芽脂、工蜂后足上的樹脂和蜂膠醇提物中多酚類成分的定量

通過標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對加楊芽脂、工蜂后足上的樹脂和蜂膠醇提物的成分進(jìn)行定量分析。從表1可以看出，三者的醇提物在多酚成分種類及含量上都很接近，其中主要成分包括3,4-二甲氧基肉桂酸、松鼠素、短葉松素-3-乙酸酯和柯因等物質(zhì)，這些基本是楊樹型蜂膠的特征成分[12,19]。加楊芽脂的總酚酸和總黃酮含量分別是153.63 mg/g和154.84 mg/g，與采膠工蜂后足上的樹脂的總酚酸含量（169.39 mg/g）和總黃酮的含量（157.45 mg/g）很接近，并且二者的多酚類成分種類也非常接近。蜂膠中的總酚酸和總黃酮分別是95.43 mg/g和123.82 mg/g，比加楊芽脂和工蜂后足樹脂的總酚酸和總黃酮都要低，但所含的物質(zhì)種類和各物質(zhì)含量之間的比例與它們中的都很接近。然而在單個成分含量比較中，加楊芽脂和后足上樹脂中的短葉松素-3-乙酸酯相對于松屬素的含量比大約都為1∶1，蜂膠中的短葉松素-3-乙酸酯相對于松屬素的含量比大約為2∶1，蜂膠中的短葉松素-3-乙酸酯的含量有所增加。此外，前二者中的5-甲氧基短葉松素和短葉松素與松屬素的含量比大約都為2∶1∶4，而蜂膠中的則為1∶1∶4，說明蜂膠中的5-甲氧基短葉松素的含量有所下降。推測蜂膠中短葉松素-3-乙酸酯含量的增高可能是由于蜂膠在貯存過程中部分5-甲氧基短葉松素發(fā)生了一系列的反應(yīng)，生成短葉松素-3-乙酸酯。但其中具體是怎樣的過程，以及是否還存在其他物質(zhì)對短葉松素-3-乙酸酯含量的增高有所貢獻(xiàn)，則需進(jìn)一步研究。

表1 加楊芽脂、工蜂后足樹脂和蜂膠醇提物中多酚類化合物的含量Table 1 Polyphenolic contents of ethanol extracts from bud resin of Populus canadensis Moench and resin collected from honeybee hind legs and propoliiss mg/g

蜂膠中約含55%的樹脂、30%的蜂蠟、10%的揮發(fā)性油和5%的花粉等物質(zhì)[1]。由表1可知，蜂膠與加楊芽脂及后足上樹脂的總酚酸和總黃酮含量的比例大概分別為3∶5∶5和4∶5∶5。通過換算得到蜂膠中的總酚酸約占加楊芽脂或后足上樹脂總酚酸的60%，約占總黃酮的80%。這樣的比例與蜂膠中含有55%的樹脂的結(jié)論的比較接近，說明蜂膠是蜜蜂在采回蜂巢的樹脂中添加了大約一半的其他物質(zhì)所制得的。此外，蜂膠中總酚酸與總黃酮的含量比例大約為3∶4，而加楊芽脂和工蜂后足上的樹脂中的含量比為1∶1，大體接近；但蜂膠中總黃酮相對總酚酸較多，這可能是因為蜜蜂在蜂膠中添加了富含黃酮類的物質(zhì)或蜂膠在蜂箱的貯藏過程中物質(zhì)發(fā)生了某些變化所造成的。雖然蜂膠、加楊芽脂和后足上樹脂中的各個化學(xué)組分的含量存在一定差異，但三者的化學(xué)組分在整體上還是非常相似的。因此從多酚類成分的含量上，也可推斷出工蜂是采集加拿大楊樹芽分泌的芽脂作為蜂膠的植物來源。

總之，加拿大楊是黑楊派中歐洲黑楊和美洲黑楊的雜交品種，其具有和歐洲黑楊樹脂成分相近的樹脂，同時加楊能在樹芽上分泌大量的樹脂，而與其他楊樹分泌樹脂的量和化學(xué)成分相比，都具有很大差異[23]。此外，加楊在我國分布范圍很廣，其他種類的楊樹則分布則相對集中[16]。因此可以認(rèn)為引進(jìn)我國的意大利蜜蜂，在長期進(jìn)化過程中有目的地選擇加楊替代歐洲黑楊作為新的膠源植物，而不會隨意地選擇其他楊樹作為膠源植物[25]。

3 結(jié) 論

通過對飼養(yǎng)在北京香山地區(qū)蜂箱中工蜂采集蜂膠的行為，進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)了工蜂用口器采集加楊芽脂、在后足花粉框中攜帶樹脂以及在蜂箱中卸下后足上樹脂的過程。再通過HPLC對加楊芽脂、采膠工蜂后足上的樹脂和蜂膠的化學(xué)成分進(jìn)行分析并定量，發(fā)現(xiàn)三者在多酚類成分組成和含量上也基本一致。本實驗結(jié)果表明，中國蜂膠的膠源植物是黑楊派中歐洲黑楊以及它的雜交品種——加拿大楊樹。

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Behavior Observation of Worker Bees Collecting Propolis and Plant Origin of Propolis

HU Hao1,2, DONG Jie2, ZHANG Hong-cheng2, ZENG Xiao-xiong1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. National R&D C entre for Bee Product Processing, Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

Propolis is generally made up of 50% plant resins, and its variety depends on plant origins in the location where honeybees collecte propolis. In this study, it was observed that honeybee workers collected resin from the bud of Populus canadensis Moench, carried the red resin with their hind legs and then removed the pieces of red resin inside the hive. Furthermore, the bud resin of Populus canadensis Moench, resinous substance collected from honeybees’ hind legs and propolis in bee houses were extracted separately with aqueous ethanol solvent for the analysis of polyphenolic components via high performance liquid chromatography (HPLC). The resu lts suggested that their similarity displayed not only in physical properties but also chemical components as well as relative content of each component. Thus, the plant origin of Chinese propolis can be Populus canadensis Moencha, a hybrid variety of Populus nigra L.

high performance liquid chromatography; propolis; plant origin; bud resin of Populus canadensis Moench

S896

A

1002-6630（2014）15-0054-05

10.7506/spkx1002-6630-201415011

2013-10-07

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（蜂）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-45-KXJ18）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD33B04）

胡浩（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：huhaogogo@gmail.com

*通信作者：曾曉雄（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zengxx@njau.edu.cn