層層自組裝法制備雙重修飾脂質(zhì)體及其體外消化穩(wěn)定性

劉 珍，鄒立強(qiáng)，劉 偉*，劉瑋琳，牛 靜

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

層層自組裝法制備雙重修飾脂質(zhì)體及其體外消化穩(wěn)定性

劉 珍，鄒立強(qiáng)，劉 偉*，劉瑋琳，牛 靜

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

以粒徑、電位、包覆率、沉淀量為指標(biāo)，采用層層自組裝法制備海藻酸鈉（sodium alginate，AL）、殼聚糖（chitosan，CH）雙重修飾脂質(zhì)體海藻酸鈉-殼聚糖-脂質(zhì)體（AL-CH-L），研究AL-CH-L的物化性質(zhì)、微觀形貌及其體外消化穩(wěn)定性。結(jié)果表明：0. 6%殼聚糖和0.5%海藻酸鈉制備的AL-CH-L平均粒徑為（330.6±37.3）nm，分布集中，Zeta電位為（-15.8±0.7）mV，透射電鏡觀察雙重修飾脂質(zhì)體的外層成功包裹了海藻酸鈉和殼聚糖聚合物，呈現(xiàn)典型的核-殼結(jié)構(gòu)。以鈣黃綠素為熒光標(biāo)記物對(duì)未修飾和雙重修飾脂質(zhì)體進(jìn)行體外消化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明雙重修飾脂質(zhì)體表現(xiàn)出更高的體外消化穩(wěn)定性。

雙重修飾脂質(zhì)體；殼聚糖；海藻酸鈉；層層自組裝；消化穩(wěn)定性

脂質(zhì)體（liposome）是由磷脂雙分子層形成的內(nèi)部包含水相的封閉囊泡[1]，具有緩釋性、細(xì)胞親和性、組織相容性和靶向性等優(yōu)點(diǎn)[2]，已成功應(yīng)用于生物醫(yī)藥、化工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。脂質(zhì)體用于包裹營(yíng)養(yǎng)素、酶、食品添加劑、食品抗菌劑等食品運(yùn)載體系顯示出誘人前景[4]， 然而脂質(zhì)體作為一種微粒分散體系，在貯藏過(guò)程中存在著 顆粒絮凝、粒徑易變大、藥物滲漏等問(wèn)題[2]。近年來(lái)，為了增加脂質(zhì)體雙層膜結(jié)構(gòu)和體內(nèi)外釋放的穩(wěn)定性，通過(guò)物理化學(xué)作用在脂質(zhì)體表面包覆蛋白、多糖或者其他物質(zhì)來(lái)修飾脂質(zhì)體的研究成為熱點(diǎn)。自組 裝技術(shù)是分離或交聯(lián)的組分在適當(dāng)條件下自發(fā)地形成有序結(jié)構(gòu)的過(guò)程[5]，層層自組裝技術(shù)是基于溶液中帶有相反電荷的物質(zhì)交替吸附形成自組裝多層膜，由于這種技術(shù)操作條件的溫和性（室溫、常壓和在水溶液中進(jìn)行）和對(duì)物化性質(zhì)的可控性，使得其發(fā)展迅速[6]。本實(shí)驗(yàn) 在采 用動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)制備納米脂質(zhì)體（nano liposomes，NL）改善其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上[7]，進(jìn)一步采用聚電解質(zhì)層層自組裝技術(shù)，以海藻酸鈉（algin，AL）中分子鏈上大量的羧基為負(fù)電荷，以殼聚糖（chitosan，CH）分子鏈上大量的伯氨基為正電荷，通過(guò)正、負(fù)電荷靜電作用層層交替形成聚電解質(zhì)膜，組裝在納米脂質(zhì)體模板表面。殼聚糖和海藻酸鈉是存在于自然界中天然線性多糖[8]，一些學(xué)者對(duì)殼聚糖-海藻酸鈉復(fù)合物修飾運(yùn)載體系進(jìn)行了研究，如Ai yuefei等[9]制備了殼聚糖-海藻酸鈉微膠囊；Tarane等[10]制備了海藻酸鈉-殼聚糖納米顆粒，但是基于殼聚糖與海藻酸鈉雙重修飾脂質(zhì)體的研究依舊甚少。

消化穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體性質(zhì)以及應(yīng)用的重要指標(biāo)，其又分為體內(nèi)消化穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性，其中體外消化穩(wěn)定性主要是通過(guò)模擬人體胃腸液環(huán)境來(lái)展開(kāi)研究。Parmentier等[11]利用模擬人體腸液以脂質(zhì)體粒徑和磷脂的消化變化來(lái)研究了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性；Carafa等[12]利用一種多糖對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，研究了其在模擬胃腸道環(huán)境中的釋放性；Filipovic-Grcic等[13]制備了殼聚糖-脂質(zhì)體，證實(shí)了其在模擬胃液中的穩(wěn)定性高于未修飾脂質(zhì)體。前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察不同來(lái)源磷脂制備的脂質(zhì)體在體外消化過(guò)程中粒徑、電位、微觀結(jié)構(gòu)和膜滲透性等的變化，研究了脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)完整性[14-15]。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，雙重修飾脂質(zhì)體的體外消化穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步展開(kāi)。

本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)制備NL，以粒徑、電位、分散系數(shù)、包覆率和沉淀量為指標(biāo)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)質(zhì)量濃度的CH-L后再優(yōu)化制備海藻酸鈉-殼聚糖-脂質(zhì)體（AL-CH-L），并對(duì)AL-CH-L的物化性質(zhì)（粒徑、電位、分散系數(shù)、微觀形貌等）進(jìn)行表征；同時(shí)采用熒光標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)考察包覆于脂質(zhì)體內(nèi)部的熒光物質(zhì)鈣黃綠素的釋放[16]和脂質(zhì)體粒徑、電位的變化比較了AL-CH-L和NL的體外消化穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆磷脂（P3644）、膽固醇（C75209）、殼聚糖（448869）、海藻酸鈉（A0682）、胃蛋白酶（P7125）、胰液素（P1750）、鈣黃綠素（C0875）美國(guó)Sigma公司；乙醇、VE、吐溫-80等均為分析純；磷酸緩沖液（pH 7.4）。

1.2 儀器與設(shè)備

動(dòng)態(tài)超高壓均質(zhì)機(jī)（微射流） 廊坊通用機(jī)械有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；NICOMP380/ZLS激光納米粒度分析儀 美國(guó)PSS公司；D37520高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific公司；Delta320 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器(中國(guó))有限公司；Tecnai G2 Spirit透射電鏡 日本Jeol公司；Agilent 5500原子力顯微鏡 美國(guó)Agilent公司；電子分析天平奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；IKA RCT磁力攪拌器、漩渦混勻器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；FP-6200熒光光度計(jì) 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 空白NL的制備

根據(jù)Bangham等[17]方法制備粗脂質(zhì)體：將磷脂、膽固醇、吐溫-80和VE按照質(zhì)量比6∶1∶1.8∶0.12混合加入無(wú)水乙醇中，在40 ℃條件下用磁力攪拌器混勻，待脂類物質(zhì)完全溶解后于真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇形成薄膜，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗膜，得到粗脂質(zhì)體懸濁液。在120 MPa壓力下經(jīng)動(dòng)態(tài)高壓微射流處理二次即得到納米脂質(zhì)體[7]。

1.3.2 CH-L的制備

CH-L的制備參考Mady[18]、Gonzaléz-Rodríguez[19]等的方法，分別取不同質(zhì)量濃度的pH 5.5的殼聚糖溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 g/100 mL）按照體積比1∶1進(jìn)行修飾脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體緩慢滴入殼聚糖溶液中，邊攪拌邊加入，滴加完畢后使用NaOH、HCl稀溶液調(diào)節(jié)CH-L的pH 5.5，靜置1 h讓其充分反應(yīng)。以粒徑、電位和包覆率為指標(biāo)，考察并分析確定最優(yōu)質(zhì)量濃度的殼聚糖，得到最優(yōu)配方的CH-L。其中，利用試劑盒方法進(jìn)行包覆率的測(cè)定[20]：取適量的殼聚糖包覆的脂質(zhì)體溶液在15 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心1 h，使包覆的CH-L充分沉淀。用等體積的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，得到CH-L溶液。通過(guò)測(cè)定離心前后的磷脂含量來(lái)確定CH-L的制備的優(yōu)化工藝。按照式（1）計(jì)算包覆率。

式中：m為沉淀物中磷脂含量/g；m0為總磷脂含量/g。

1.3.3 AL-CH-L的制備

在優(yōu)化條件下制備CH-L樣品基礎(chǔ)上，分別取不同質(zhì)量濃度的pH 5.5的海藻酸鈉溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 g/100 mL）進(jìn)行第2層修飾脂質(zhì)體，按照體積比1∶1，將最優(yōu)配方的CH-L，逐滴加入至海藻酸鈉溶液中，邊攪拌邊加入，滴加完畢后使用NaOH、HCl稀溶液調(diào)節(jié)AL-CH-L溶液的pH值至5.5，靜置1 h讓其充分反應(yīng)。得到的雙重修飾脂質(zhì)體在3 000×g離心15 min，過(guò)濾后稱量沉淀物質(zhì)量。以粒徑、電位和沉淀量為指標(biāo)，確定最優(yōu)質(zhì)量濃度的海藻酸鈉。利用稱量法按式（2）計(jì)算得到沉淀的質(zhì)量。

式中：m1為離心管與沉淀的總質(zhì)量/g；m0為離心管質(zhì)量/g；m為沉淀的質(zhì)量/g。

1.3.4 AL-CH-L的性質(zhì)表征

1.3.4.1 平均粒徑、分散系數(shù)和表面電荷的測(cè)定

取適量AL-CH-L用磷酸緩沖液稀釋3倍，未修飾的脂質(zhì)體稀釋10倍，利用NICOMP380/ZLS激光納米粒度分析儀測(cè)定平均粒徑、分散系數(shù)及Zeta電位。

1.3.4.2 微觀形貌的表征

利用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察AL-CH-L和未修飾脂質(zhì)體的微觀形態(tài)特征。將稀釋適當(dāng)倍數(shù)后的樣品滴加到云母片上，室溫過(guò)夜干燥后置于原子力顯微鏡下觀察。將適量稀釋后的樣品，滴于銅網(wǎng)上，使用2%醋酸鈾負(fù)染4 min，過(guò)量的液體用濾紙吸干，室溫干燥后置于透射電鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)。

1.3.5 AL-CH-L的體外消化穩(wěn)定性研究

模擬胃液的制備：2 g氯化物溶解于蒸餾水中，加入濃鹽酸，稀釋至1 L，調(diào)節(jié)pH 1.2；模擬腸液的制備：6.8 g K2HPO4溶190 mL 0.1 mol/L NaOH中，膽汁質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，稀釋至1 L，調(diào)節(jié)pH 7.4。在消化實(shí)驗(yàn)之前，模擬胃液與模擬腸液放置在37 ℃恒溫水浴中95 r/min持續(xù)攪拌[21]。

鈣黃綠素的釋放率[14]：制備熒光標(biāo)記物鈣黃綠素的納米脂質(zhì)體，方法參照1.3.1節(jié)，同時(shí)采用殼聚糖、海藻酸鈉對(duì)其進(jìn)行雙重修飾得到AL-CH-L。AL-CH-L與模擬胃液或模擬腸液按體積比4∶3混合，未修飾的脂質(zhì)體則按照體積比1∶3加入模擬胃液、模擬腸液，37 ℃恒溫水浴振蕩，分別從加入胃蛋白酶、胰蛋白酶液時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔0、1、5、15、30、60、120 min取出適當(dāng)樣品，使用熒光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，按式（3）計(jì)算鈣黃綠素的釋放率。

式中：It為時(shí)間t測(cè)定的熒光強(qiáng)度；I0為0 min時(shí)的熒光強(qiáng)度；Imax加入2%曲通破乳后測(cè)定的總熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 AL-CH-L的制備條件優(yōu)化

圖1 CH-L的粒徑、電位、包覆率隨CH質(zhì)量濃度的變化Fig.1 Changes in particle size, zeta potential and coating efficiency of CH-L with chitosan concentration

CH修飾后改變了納米脂質(zhì)體的粒徑分布、帶電性和包覆率。由圖1可知，未修飾的NL粒徑為（79.8±3.8）nm，表面帶有負(fù)電荷為（-6.7±1.2） mV，隨著CH質(zhì)量濃度的增大，C H-L的平均粒徑逐漸增大至（255.8±34.8） nm；Zeta電位由負(fù)電反轉(zhuǎn)為正電，當(dāng)CH質(zhì)量濃度為0.6 g/100 mL時(shí)，電位增大至（2.3±0.7）mV。隨后變化不大；同時(shí)，當(dāng)CH質(zhì)量濃度為在0.1 g/100 mL時(shí)，CH-L的包覆率曲線達(dá)到拐點(diǎn)隨后趨于平穩(wěn)。然而，由于0.1 g/100 mL CH修飾得到的CH-L帶電量?jī)H為（-0.075±1.1）mV，接近中性，與AL的靜電作用則很弱。綜合分析粒徑分布、帶電性和包覆率等指標(biāo)，確定使用0.6 g/100 mL的CH為制備單層修飾脂質(zhì)體CH-L的最佳質(zhì)量濃度。

CH是由甲殼素經(jīng)脫乙酰作用得到的α-（1,4）-2-氨基-β-D-葡萄糖，結(jié)構(gòu)中含有大量的伯氨基—NH2，由于CH-NH3+的pKa值為6.5[22]，在本實(shí)驗(yàn)中，制備的NL其疏水尾部聚集在一起，親水頭部暴露在水相，磷脂雙分子層的表面極性頭帶有負(fù)電而使用pH 5.5的CH進(jìn)行第一層修飾時(shí)，按Motwani等[23]報(bào)道，在此pH值條件下，CH氨基質(zhì)子化得到-NH3+，形成陽(yáng)離子聚合物，通過(guò)靜電作用或疏水作用與脂質(zhì)體的磷脂極性頭結(jié)合[24]，從而在NL表面形成穩(wěn)定的離子-聚合物層獲得CH-L。

由于CH在胃液的強(qiáng)酸性環(huán)境中溶解性很強(qiáng)，單純的采用CH修飾脂質(zhì)體并不能滿足提高其穩(wěn)定性的需要，因此本實(shí)驗(yàn)采用AL再次修飾pH 5.5的CH-L。AL是β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接形成的一類線性鏈狀陰離子聚合物[10]，呈堿性，當(dāng)加入高pH值的AL時(shí)，CH的質(zhì)子化程度減弱并且會(huì)沉淀析出，所以調(diào)節(jié)AL使其pH值為5.5，在此條件下AL的羧基離子化形成—COO-[23]。并且調(diào)節(jié)雙重修飾后的溶液使其pH值依舊為5.5，在pH 5.5的條件下，CH的氨基質(zhì)子化形成-NH3+和AL羧基離子化形成—COO-，二者通過(guò)靜電作用在修飾脂質(zhì)體（CH-L）的外層上層層組裝形成聚合物層（AL-CH）而獲得雙重修飾脂質(zhì)體AL-CH-L。在實(shí)驗(yàn)中，AL修飾后，AL-CH-L的粒徑分布和帶電量發(fā)生再次改變，并且AL與游離的CH之間形成大量的聚合物導(dǎo)致了沉淀的產(chǎn)生。

圖2 AL-CH-L的粒徑、電位、沉淀量隨AL質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Changes in particle size, zeta potential and sedimentation amount of AL-CH-L with sodium alginate concentration

由圖2可知，當(dāng)AL質(zhì)量濃度低于0.5 g/100 mL時(shí)，得到的AL-CH-L的帶電量較低；當(dāng)AL質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL時(shí)，AL-CH-L的粒徑為（330.6±37.3）nm，帶電量達(dá)到最大（-15.8±0.7）mV；當(dāng)AL質(zhì)量濃度繼續(xù)增大至2.5 g/100 mL，粒徑突變達(dá)到（3 229.7±203.4）nm，且分散很不均勻，系數(shù)達(dá)到0.8。另外，從制備過(guò)程中沉淀量的變化曲線可知，當(dāng)AL附著在CH-L外層時(shí)，沉淀量隨著AL的質(zhì)量濃度增加發(fā)生變化。在低質(zhì)量濃度的AL加入時(shí)，AL修飾CH-L的程度較低，隨著質(zhì)量濃度增大到0.5 g/100 mL時(shí)，AL與CH-L的結(jié)合增強(qiáng)，同時(shí)AL與游離的CH作用同步增強(qiáng)，導(dǎo)致形成的沉淀量增加。隨著體系中AL質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大至1 g/100 mL，制備得到的AL-CH-L粒徑達(dá)到（1 170.3±404.5） nm，并且其帶電量低于0.5 g/100 mL AL-CH-L。此時(shí)AL與游離的CH作用愈加明顯，其相互纏結(jié)的更為緊密，導(dǎo)致暴露的帶電基團(tuán)減少，體系中的帶電量的減少引起聚合物之間相互排斥力的減弱，故而1 g/100 mL AL修飾時(shí)形成的相對(duì)沉淀量增加到最大。此后相對(duì)沉淀量一直減小，這可能是由于AL的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，纏結(jié)的沉淀更為緊致導(dǎo)致其吸收的水分更少，故而引起相對(duì)沉淀物的質(zhì)量逐漸減小。由此綜合分析確定0.5 g/100 mL AL制備AL-CH-L效果最佳。

2.2 AL-CH-L的微觀形貌

利用激光納米粒度儀，原子力顯微鏡和透射電鏡，以未修飾的NL作為對(duì)照組，對(duì)制備的層層自組裝脂質(zhì)體AL-CH-L的微觀形貌進(jìn)行了表征。

圖3 未修飾的NL（a）和AL-CH-L（b）的原子力顯微鏡3D圖Fig.3 Atomic force microscopic images of NL (a) and AL-CH-L (b)

由圖3可知，NL顆粒清晰，粒徑為（79.8±3.8）nm，大小及分布皆比較均勻（圖3a）；而制備的AL-CH-L粒徑較大，粒徑為（330.6±37.3）nm（圖3b）。溶液中除了突起的大顆粒AL-CH-L外，還有分散著許多附著物。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AL-CH-L制備過(guò)程中產(chǎn)生了些許沉淀物，原子力顯微鏡3D形貌同時(shí)也驗(yàn)證了制備過(guò)程中沉淀量的變化。

圖4 未修飾的NL（a）和AL-CH-L（b）的透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron micrographs of NL (a) and AL-CH-L (b)

由圖4可知，未修飾脂質(zhì)體NL呈球形，并且分布較均勻，可知其成型較好（圖4a）；而雙重修飾脂質(zhì)體AL-CH-L呈球形，結(jié)構(gòu)完整，粒徑明顯大于未修飾的脂質(zhì)體，并且呈現(xiàn)出典型的核-殼結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為飽和度較高的亮白色，外層覆蓋上較為透明的聚合物層（圖4b）。據(jù)Mady等[18]報(bào)道，采用殼聚糖修飾薄膜分散法制備的脂質(zhì)體也會(huì)出現(xiàn)這樣的核-殼結(jié)構(gòu)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)中AL-CH-L的形成，選擇實(shí)驗(yàn)中的AL-CH-L、CH-L和NL樣品進(jìn)行粒徑分布的對(duì)比，結(jié)果如圖5所示。

圖5 NL、CH-L和AL-CH-L的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanoliposome, CH-L and AL-CH-L

根據(jù)納米粒度儀測(cè)得的NL、CH-L和最優(yōu)配方下的AL-CH-L粒度分布圖（圖5）可知，修飾后的脂質(zhì)體粒徑明顯高于未修飾的脂質(zhì)體。NL的平均粒徑為（79.8±3.8）nm，CH-L的平均粒徑為（158.2±4.4）nm，這與Mady等[18]報(bào)道的殼聚糖修飾后的脂質(zhì)體粒徑較修飾前增大（92±27.1）nm一致，而本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上再次修飾上AL后，制備的AL-CH-L粒徑增加到（330.6±37.3）nm，明顯大于殼聚糖-脂質(zhì)體與納米脂質(zhì)體?？梢?jiàn)，AL-CH聚合物層的存在，明顯改變了脂質(zhì)體微粒的大小及分布。

2.3 體外消化穩(wěn)定性

在模擬人體胃腸液環(huán)境中，通過(guò)測(cè)定分析NL和AL-CH-L隨消化時(shí)間的性質(zhì)變化（平均粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位）和包裹的熒光物質(zhì)鈣黃綠素的釋放曲線，從而比較脂質(zhì)體修飾前后的消化穩(wěn)定性。結(jié)果如表1和圖6所示。

表1 NL和AL-CH-L在模擬胃腸液中消化120 min后的粒徑、分散系數(shù)和電位值Table 1 Particle size, PDI and zeta potential of NL and AL-CH-L after 120 min of digestion in SGF and SIF

由表1結(jié)合2.2節(jié)的結(jié)果可知，在模擬人體胃液環(huán)境中消化120 min后，NL和AL-CH-L的粒徑和電位變化均較小，NL的粒徑由（79.8±3.8）nm變化為（8 0.2±6.3）n m，A L-C H-L的粒徑由（330.6±37.3）nm變化為（299.5±15.2）nm；NL的電位由（-6.7±1.2）mV變化為（-4.4±0.6）mV，AL-CH-L的電位由（-15.8±0.7）mV變化至（-17.9±0.2）mV，可見(jiàn)其均呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，這與Rowland等[25]的報(bào)道一致，即大多數(shù)的脂質(zhì)體在通過(guò)胃液低pH值的環(huán)境時(shí)受到的影響較小。在模擬人體腸液環(huán)境中消化120 min后，兩種脂質(zhì)體則呈現(xiàn)不同的變化：NL粒徑由（79.8±3.8）nm增大為（124.1±12.1）nm，A L-C H-L的粒徑則由（3 3 0.6±3 7.3）n m變化至（5 1 3.6±1 5.0）n m；N L的電位由（-6.7±1.2）mV變化至（-32.2±6.0）mV，AL-CH-L的電位由（-15.8±0.7）mV變?yōu)椋?22.2±0.2）mV，可見(jiàn)NL電位明顯增大，其變化較AL-CH-L更為明顯。AL-CH-L在腸液中粒徑增大，可能是在pH 7.4的環(huán)境下，CH質(zhì)子化的程度降低，帶電量減少，CH與AL的靜電結(jié)合作用則減弱，導(dǎo)致了結(jié)構(gòu)的松散和溶液介質(zhì)滲透進(jìn)粒子內(nèi)部，故而粒徑增大；AL-CH-L消化120 min后帶電量沒(méi)有明顯變化，NL的帶電量則表現(xiàn)為明顯增大，原因可能是NL在胰蛋白酶和膽酸鹽的協(xié)同作用下，NL中磷脂的有序結(jié)構(gòu)容易被破壞，引起脂質(zhì)體的聚集融合，導(dǎo)致了粒徑的增大，同時(shí)磷脂的水解產(chǎn)物覆蓋在脂質(zhì)體表面或者破壞后的脂質(zhì)體與膽酸鹽結(jié)合形成囊泡，導(dǎo)致了其帶電量的增加[12]，而AL-CH-L在腸液中，因?yàn)槭艿紸L-CH聚合物層的保護(hù)，其電位變化較小。

圖6 NL和AL-CH-L中鈣黃綠素在模擬胃腸液中的釋放Fig.6 Calcein release from nanoliposome and AL-CH-L in SGF and SIF

由圖6可知，在SGF中，兩種脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)未受到太多破壞，鈣黃綠素的釋放量少且區(qū)別不是很明顯，均表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。然而，在腸液中，消化15 min后，NL中鈣黃綠素的釋放為（35±9）%，而AL-CH-L中其釋放率僅為（15±1）%，消化120 min后，NL中鈣黃綠素釋放率為（58±2）%，而AL-CH-L釋放率僅為（38±2）%，并且從整個(gè)釋放曲線可以看出，AL-CH-L中鈣黃綠素的釋放率始終明顯低于NL。在NL中，脂質(zhì)體中磷脂經(jīng)過(guò)水解，形成了不穩(wěn)定的微束結(jié)構(gòu)[12]，導(dǎo)致了脂質(zhì)體膜的通透性增強(qiáng)，故而鈣黃綠素的釋放增加。ALCH-L中鈣黃綠素釋放率的逐漸增加，可能是因?yàn)锳L屬于腸溶性壁材，在胃液中，制備的AL-CH-L因AL的不溶性保護(hù)了脂質(zhì)體，表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定；而在腸液中，AL逐漸溶解，包埋物也逐漸釋放。綜合分析可以看出，AL與CH在脂質(zhì)體外層形成的保護(hù)層，可以在一定程度上提高脂質(zhì)體在胃腸液中的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

殼聚糖和海藻酸鈉作為天然多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、無(wú)毒性，可作為脂質(zhì)體安全的修飾劑材料。本實(shí)驗(yàn)采用層層自組裝技術(shù)成功制備了海藻酸鈉-殼聚糖雙重修飾脂質(zhì)體，通過(guò)原子力顯微鏡、透射電鏡和激光納米粒度儀對(duì)AL-CH-L的形貌和性質(zhì)進(jìn)行表征，并比較了修飾前后脂質(zhì)體的體外消化穩(wěn)定性，結(jié)果表明AL-CH-L較NL顯示出更好的體外消化穩(wěn)定性。后期可以研究包埋多種模型藥物來(lái)進(jìn)一步考察層層自組裝脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

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Preparation and in vitro Digestive Stability of Double Modified Liposomes through Layer-by-Layer Self-Assembly

LIU Zhen, ZOU Li-qiang, LIU Wei*, LIU Wei-lin, NIU Jing
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Sodium alginate (AL) and chitosan (CH) were coated onto liposome through layer by layer self-assembly technique. The physicochemical and morphological characteristics and in vitro digestive stability of AL-CH-L were observed. The results showed that 0.6% CH and 0.5% AL were the best choice to prepare AL-CH-L. Thus, the AL-CH-L revealed a size of (330.6 ± 37.3) nm with a centralized distribution and a zeta potential of (-15.8 ± 0.7) mV, and a polymer fi lm was successfully coated on the surface of liposome as observed under a transmittance electron microscope (TEM). Meanwhile, an obvious core-shell structure was observed. The in vitro digestion experiment carried out using the fl uorescence marker calcein showed better digestive stability of AL-CH-L when compared with common nanoliposomes.

double modif i ed liposome; chitosan; alginate; layer by layer self-assembly; digestive stability

TS201.2

A

1002-6630（2014）15-0005-06

10.7506/spkx10 02-6630-201415002

2013-07-31

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（21266021）；食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索項(xiàng)目（SKLF-ZZB-201311）

劉珍（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭澄铮ê镔|(zhì)）資源的開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：ncuskliuzhen@163.com

*通信作者：劉偉（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称犯咝录夹g(shù)與資源綜合利用。E-mail：liuwei@ncu.edu.cn