蚤狀溞(Daphnia pulex)熱休克蛋白Hsp90基因的克隆與表達分析*

陳 蘋 邱成功 鄒 秀 周健愷 徐善良 王春琳王丹麗① 趙云龍

(1.寧波大學海洋學院 寧波 315211;2.華東師范大學生命科學學院 上海 200062)

蚤狀溞(Daphnia pulex)為一種常見的小型浮游動物,屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、鰓足亞綱(Branchiopoda)、枝角亞目(Cladocera)。枝角類營養(yǎng)豐富,易培養(yǎng),繁殖周期短且繁殖量大,是許多水生動物的優(yōu)良天然活餌料。枝角類有兩種生殖方式,即孤雌生殖(parthenogenesis)和兩性生殖(sexual reproduction)。外界條件適宜時枝角類行孤雌生殖(無性生殖),當外界環(huán)境條件惡化時行兩性生殖(有性生殖)。孤雌生殖有助于其種群的迅速發(fā)展,而兩性生殖形成的休眠卵(冬卵)能確保其渡過惡劣環(huán)境,以維持種群的存在與延續(xù),但種群數(shù)量會在短期內(nèi)迅速下降(Jianget al,1979)。蚤狀溞等枝角類能靈敏準確的判斷外界環(huán)境的優(yōu)良,選擇適應的生殖狀態(tài),從而避免種群滅絕的危機。

熱休克蛋白(heat shock protein,Hsp)是一類在生物進化過程中高度保守并廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白。它是機體在應激情況下細胞內(nèi)迅速合成的一組蛋白質(zhì),由 Ritassa(1964)在 1962年首次從果蠅中發(fā)現(xiàn)。到了 1974年,Tisseres等(1974)發(fā)現(xiàn)熱休克反應中可以轉(zhuǎn)錄合成一組特殊蛋白,而且伴隨著這類蛋白的合成,細胞的其它蛋白合成卻受到抑制,而且昆蟲體內(nèi)熱激蛋白的表達量越高,其耐熱性就越強(Leet al,2001;Murphyet al,2003)。除了高熱之外,多種應激原如重金屬、饑餓、缺氧、缺血等都可以誘導Hsp的表達。根據(jù)分子重量和同源程度,熱休克蛋白分為 Hsp90s(83—99kDa)、Hsp70s(68—80kDa)、Hsp60s,以及小 Hsp(25—28kDa)(Lindquistet al,1988),其中Hsp90家族是較為重要的一族,目前研究較多(徐明波等,1991)。Hsp90是一種ATP依賴的伴侶蛋白,是真核生物中含量最豐富的胞質(zhì)蛋白。Hsp90廣泛參與細胞的信號轉(zhuǎn)導、激素應答及轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程,對細胞在生理、病理及應激條件下的生存發(fā)揮了重要作用。在細胞發(fā)生應激反應時,Hsp90可以和那些由于環(huán)境刺激而使自身構(gòu)象發(fā)生改變的蛋白相互作用,保證蛋白進行適當?shù)恼郫B并防止蛋白非特異性聚集,所以Hsp90有可能通過環(huán)境的改變參與了枝角類的生殖轉(zhuǎn)化調(diào)控。羅文等(2012)也推測到一些化學感應基因(CSP)和熱激蛋白(HSP)基因在枝角類孤雌生殖中起到非常重要的作用。目前已經(jīng)有多種甲殼綱動物包括蝦(Wuet al,2008)、龍蝦(Changet al,1999;Speeset al,2002;Chang,2005)、水蚤(Bondet al,1993;Kotovet al,2006;Soetaertet al,2006)、陸生十足類(Gusevet al,2006)對Hsp90基因進行研究,而且有研究報道表明 Hsp90參與甲殼綱的生理發(fā)育調(diào)解,如對刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)Hsp90的研究顯示Hsp90能調(diào)解雌性激素的信號轉(zhuǎn)導,進而調(diào)解卵黃蛋白原的合成(Wuet al,2008)。對美洲海螯蝦(Homarus americanus)進行滲透脅迫研究,發(fā)現(xiàn)Hsp90 mRNA在腹部肌肉中的表達水平顯著增加(Speeset al,2002);對大型溞(Daphnia magna)的研究顯示Hsp90是幼體發(fā)育的上調(diào)基因,在大型溞的發(fā)育中起到積極作用(Soetaertet al,2006)。但是人們對于蚤狀溞Hsp90基因知之甚少。本研究以蚤狀溞為研究對象,采用同源克隆和RACE-PCR的方法,克隆了蚤狀溞Hsp90的cDNA全長,利用Real-Time PCR技術(shù)分析了Hsp90 mRNA在蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下的表達水平,旨在探索枝角類生殖轉(zhuǎn)化的規(guī)律和分子機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗用蚤狀溞由本實驗室單克隆培養(yǎng)獲得,體長(3.2±0.8)mm。挑選健康活力強的個體暫養(yǎng)于實驗室玻璃培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)溫度(25±1)°C,光周期為 14h光照和10h黑暗。培養(yǎng)于“Banta糞土培養(yǎng)液”(1.5g兔子糞 + 2g干稻草 + 10g土壤 + 950mL自來水經(jīng)煮沸后取上清液),并交叉投喂小球藻等單細胞藻類,每天投喂餌料1次。雄溞的獲得:培養(yǎng)兩周后,當溞密度達到3000只/L以上時,缸內(nèi)溞的生殖方式逐漸轉(zhuǎn)為有性生殖,雄溞出現(xiàn)。

提取總RNA的試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time Kit)為TaKaRa公司;Realtime-PCR采用TaKaRa公司的Premix Ex TaqTMHot Start Version試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄酶及其它主要試劑為 TaKaRa公司產(chǎn)品。3′RACE、5′RACE PCR 擴增使用 Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification試劑盒。PCR的擴增引物由上海桑尼生物公司合成,PCR產(chǎn)物由上海Invitrogen生物公司克隆測序。

1.2 引物設計

從 GenBank中獲得已注冊的迷糊酢蚤(Daphnia ambigua,ABI35828.1)、山形水蚤(Daphniasp.Yamagata,ABI35815.1)、光滑水蚤(Daphnia laevis,ABI35823.1)和紋水蚤(Daphnia dubia,ABI35824.1)基因,根據(jù)此序列,運用Vector NTI 11.0軟件找到Hsp90基因的保守區(qū)域,在保守區(qū)域內(nèi)設計出蚤狀溞Hsp90基因的兼并引物 Hsp90-F/R,進行 PCR擴增,獲得一條長約250bp核心的片段,再根據(jù)此部分片段設計 5′RACE和 3′RACE 特異性引物 HSP-5’RACE 和 HSP-3′RACE擴增出DpHsp90全長cDNA序列,進一步設計出實時熒光定量PCR引物Hsp90-YF和Hsp90-YR。基于蚤狀溞內(nèi)參基因18S(AF014011.1)的cDNA序列設計內(nèi)參基因序列引物18S-F和18S-R,用1對內(nèi)參基因引物18S-F/R 和1對特異性引物Hsp90-YF/YR來檢測蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下Hsp90 mRNA的表達情況(引物見表1)。

表1 試驗中用到的引物名稱及序列Tab.1 Oligonucleotide primers used in the experiments

1.3 蚤狀溞總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

采用 RNA提取試劑盒(RNA Extraction Kit,Axygen)分別提取孤雌幼溞、孤雌溞(帶夏卵)、兩性溞(帶冬卵)、雄溞和休眠卵的總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time Kit)進行上述 RNA 反轉(zhuǎn)錄以得到 cDNA。37°C 反轉(zhuǎn)錄15min,85°C 5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶。合成的cDNA產(chǎn)物于–20°C保存或直接用于PCR。

1.4 Hsp90基因cDNA片段的克隆

以蚤狀溞兩性溞(帶冬卵)cDNA為模板,采用兼并引物HSP-F和HSP-R進行PCR擴增,PCR反應體系為50μL,優(yōu)化后擴增條件:94°C預變性3min;94°C變性30s,53°C退火30s,72°C延伸1min,35個循環(huán);72°C延伸10min;4°C保存。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,送上海Invitrogen生物公司克隆測序。

1.5 Hsp90基因cDNA全長序列的獲得

測序結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行 BlastX分析比對,以上實驗所得Hsp90部分序列與其它物種的Hsp90同源,則根據(jù)測得的序列再設計 5′RACE 和 3′RACE 特異性引物HSP-5′RACE 和 HSP-3′RACE 用于 RACE 擴增。采用SMARTTMRACE cDNA 試劑盒(Clontech)進行 5′RACE和3′ RACE獲得全長cDNA。

1.6 生物信息學分析

用 Protparam軟件(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)進行蛋白理化特性預測,核酸和蛋白序列相似性比較利用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上的BlastX工具進行比對分析;通過NCBI的ORF Finder進行開放閱讀框分析并預測氨基酸序列;SignalP程序分析信號肽;采用Clustal W軟件進行多序列比對分析。用MEGA5.1軟件中的N-Jn(eighborjoining)構(gòu)建進化樹。用自展法(Bootstrap)進行 1000次重復檢驗。

1.7 實時熒光定量PCR分析

實驗室設置3個10L玻璃鋼,每只缸接種密度50只/L孤雌溞,進行充氣培養(yǎng),其它培養(yǎng)條件一樣。當培養(yǎng)密度達到3000只/L以上時進行采樣,從每只缸分別采孤雌幼溞、孤雌溞(帶夏卵)、兩性溞(帶冬卵)、雄溞和休眠卵5種樣本,每種樣本3個平行組。

首先優(yōu)化模板濃度,將各類模板稀釋成10、10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7μmol/L 八個濃度梯度,分別用引物進行擴增,以確定最佳模板濃度。另外對引物退火溫度進行優(yōu)化,優(yōu)化后反應條件如下:95°C預變性30s;95°C變性5s,57°C退火30s,72°C 30s,40個循環(huán)。每種生殖狀態(tài)的樣品設3次重復。反應結(jié)束后確定Real-time PCR的擴增曲線和溶解曲線,數(shù)據(jù)采集和處理在ABI StepOnePlusTMInstrument上進行。

每種生殖狀態(tài)下溞的樣品進行3次重復。試驗所得數(shù)據(jù)以平均值(Mean,M)±標準差(Stdeva,SD)表示,所測數(shù)據(jù)以SPSS 14.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,采用One-Way ANOVA 法進行顯著性檢驗,并用 Duncan檢驗法進行多重比較。本實驗根據(jù)Livak等(2001)的方法進行引物的效率檢測,PCR產(chǎn)物的溶解曲線沒有雜峰,顯示產(chǎn)物特異性好。采用 2-△△Ct法分析處理qRT-PCR結(jié)果,ΔCt定義為內(nèi)標18S Ct值與目的基因(Hsp90)Ct值的差值,以孤雌幼溞對照組的表達量為1。

2 結(jié)果

2.1 蚤狀溞Hsp90基因cDNA全長的克隆

以蚤狀溞 cDNA全長為模版,用兼并引物進行PCR擴增,獲得一條250bp片段,經(jīng)Blast X分析,顯示與已登錄的迷糊酢蚤D.ambigua(ABI35828.1)、山形水蚤D.sp.Yamagata(ABI35815.1)、光滑水蚤D.laevis(ABI35823.1)和紋水蚤D.dubia(ABI35824.1)Hsp90基因的同源性都達到了97%以上,表明該片段是Hsp90基因的一部分。以這段序列設計5′RACE和3′RACE 引物分別進行 5′-RACE 和 3′-RACE,測序后所得序列通過比對拼接得到了一條 2568bp的全長蚤狀溞Hsp90序列(GenBank登錄號:KC845247)(圖1)。為驗證序列的可靠性,重新設計 HSP-CDS-F、HSP CDS-R克隆Dptra全長序列,結(jié)果與拼接結(jié)果一致,證明完整 cDNA克隆成功。將該溞Hsp90基因的全長cDNA序列命名為Daphnia pulexHsp90(DpHsp90)。

2.2 蚤狀溞DpHsp90蛋白序列特征分析

蚤狀溞 Hsp90全長核苷酸序列和推導出的氨基酸序列如圖1所示,cDNA全長為2568bp,包含了一個 164bp的 5′-UTR 區(qū)域和一個 249bp的 3′-UTR(非編碼區(qū))區(qū)域,其中包括一個終止密碼子(TGA)、多聚腺苷酸信號序列(ATTAAA)和polyA尾。2155bp的開放閱讀框(ORF)編碼了718個氨基酸,含有多個磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylation site)和N-糖基化位點(N-glycosylation site)。結(jié)構(gòu)域分析顯示HSP90在編碼區(qū)存在 5個該蛋白家族的特有的保守信號區(qū):NKEIFLRELISNSSDALDKIR(34—54aa):LGTIAKSGT(101—109aa);IGQFGVGFYSPYLVTD(125—140aa);IKLYVRRVF(346—354aa);GVVDSEDLP LNISRE(372—386 aa);一個GxxGxG序列,一個LxxLL模塊,同時在HSP90羧基末端存在一個保守的MEEVD序列(714—718 aa),這與已知的所有昆蟲HSP90基因結(jié)構(gòu)一致(Peteret al,1998),與細胞質(zhì)HSP90羧基末端的保守基序相同。

圖1 蚤狀溞Hsp90基因的cDNA全長及推斷氨基酸Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of D.pulex Hsp90 cDNA

2.3 蚤狀溞Hsp90結(jié)構(gòu)分析

DNAMAN預測的 Hsp90蛋白的等電點是 5.01,相對分子質(zhì)量為 82552.61。Hsp90蛋白含有一個HATPase_c結(jié)構(gòu)域(殘基36—149位)、一個Hsp90蛋白結(jié)構(gòu)域(殘基190—718位)和一個Mg2+結(jié)合位點(殘基45位-天冬酰胺)(圖2)。

圖2 蚤狀溞Hsp90蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.2 Hsp90 protein structure domain of D.pulex

2.4 蚤狀溞Hsp90氨基酸序列同源性分析

利用ClustalW對蚤狀溞Hsp90和NCBI中其它甲殼綱動物(共14種)Hsp90的多序列比對見圖3。分析表明:這些比對的序列之間的同源性較高。蚤狀溞Hsp90與日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)和刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)的同源性最高為 85%,與其它 11個種類:中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、矮小擬鏢劍水蚤(Paracyclopina nana)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)、真寬水蚤(Eurytemora affinis)、日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)、劍水蚤(Tigriopus japonicus)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)、紅螯相手蟹(Chiromantes haematocheir)的同源性都在79%以上。

利用MEGA5.1軟件對NCBI中部分節(jié)肢動物的Hsp90基因序列進行了分子系統(tǒng)學分析,在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的基礎上研究了蚤狀溞和其它種類 Hsp90蛋白之間的進化關(guān)系(見圖4)。從進化樹中,可以看出蚤狀溞Hsp90首先與劍水蚤(T.japonicus)、日本沼蝦(M.nipponense)、紅螯相手蟹(C.haematocheir)、擬穴青蟹(S.paramamosain)、中華絨螯蟹(E.sinensis)等甲殼綱聚為一類,然后再與蛛形綱的肩突硬蜱(Ixodes scapularis)、龍骨三色蝎(Opistophthalmus carinatus)聚為一亞群。昆蟲綱的印度跳蟻(Harpegnathos saltator)、刺柚釉小蜂(Quadrastichus erythrinae)、褐飛虱(Nilaparvata lugens)、白背飛虱(Sogatella furcifera)、中華稻蝗(Oxya chinensis)、豆莢草盲蝽(Lygus hesperus)等聚為另一亞群。

2.5 Hsp90 mRNA在蚤狀溞各生殖狀態(tài)下的表達差異

Hsp90基因在孤雌幼溞、孤雌溞(帶夏卵)、兩性溞(帶冬卵)、雄溞和休眠卵(冬卵)中的表達差異如圖5所示。從圖5中可以看出:Hsp90 mRNA在雄溞體中表達量最高,其次為兩性溞(帶冬卵),孤雌溞(帶夏卵)次之,在休眠卵中的表達量最低。Hsp90 mRNA在兩性溞(帶冬卵)和雄溞中的表達量顯著高于孤雌溞(帶夏卵)和孤雌幼溞(P<0.05)。

3 討論

Hsp90蛋白家族是一類在生物進化過程中高度保守并廣泛存在的分子伴侶,在非應激和正常生理狀態(tài)下占細胞蛋白總量的1%—2%,其具體功能尚未明確,它能夠識別并調(diào)節(jié)胞內(nèi)基質(zhì)的活性并在環(huán)境脅迫時發(fā)揮功能。為進一步了解HSP90基因特點,本文獲得蚤狀溞HSP90 cDNA的完整序列,2155bp的開放閱讀框(ORF)編碼了 718個氨基酸,在蚤狀溞基因組中定位于 scaffold_173:115844—118680(GenBank accession:GL732695.1),編碼718 氨基酸。通過氨基酸序列比對,作者發(fā)現(xiàn)蚤狀溞Hsp90與已知的甲殼綱具有共同的序列特征,包含HSP90家族的5個特征信號序列(NKEIFLRELISNSSDALDKIR、IGQFGVGFYSAFLVAD、LGTIAKSGT、IKLYVRRVFI和 GVVDSEDLP LNISRE)(見圖1),有研究表明,植物、動物和真菌的HSP90家族中均存在這5條特征序列(Gupta,1995),大多數(shù)生物的這5條特征序列幾乎完全相同(Farcyet al,2007;Liet al,2009),僅有少數(shù)生物存在個別氨基酸差異(Bruntet al,2004)。這些信號特征可被 HOP(HSP70 and HSP90 organizing protein)的 TPR(Tetra-tricopeptide repeat)區(qū)段識別,進而與熱休克蛋白 70構(gòu)成分子伴侶復合體(Chenet al,2005)。在同源性比對結(jié)果中還發(fā)現(xiàn) GxxGxG、LxxLL模塊。GxxGxG模塊是Hsp90與ATP結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(Prodromouet al,1997),它的存在對Hsp90功能的正常發(fā)揮具有重要作用;LxxLL模塊在Hsp90功能調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮著重要的作用(Michaelet al,2005);其C末端的MEEVD序列說明此Hsp90存在于細胞質(zhì)中,為胞質(zhì)蛋白(Pelham,1989;Gupta,1995)。這些功能結(jié)構(gòu)都存在于保守區(qū)(圖3),與翟會芳等(2010)報道的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、張道偉等(2012)報道的白背飛虱(Sogatella furcifera)的Hsp90的功能保守結(jié)構(gòu)一致。結(jié)構(gòu)分析說明蚤狀溞Hsp90與其它物種Hsp90基因具有相似的功能。另外根據(jù)是否含有豐富的谷氨酰胺片段,Hsp90可分為Hsp90α和 Hsp90β(Hickeyet al,1989)。蚤狀溞HSP90不含有 Hsp90α所特有的磷酸化位點序列TQTQDQ(Picard,2002),因此可以判定本文克隆的是Hsp90β基因。

圖3 蚤狀溞Hsp90與其它物種氨基酸序列比對Fig.3 The predicted amino acid sequence of Hsp90 of D.pulex was compared with Hsp90 of other species

圖4 Hsp90基因的進化樹分析圖Fig.4 Phylogenetic tree connecting the Hsp90 genes

圖5 Hsp90 mRNA在不同生殖狀態(tài)下的表達水平Fig.5 The level of Hsp90 mRNA transcription of different reproductive modes

從系統(tǒng)發(fā)育樹中,作者發(fā)現(xiàn)節(jié)肢動物Hsp90明顯分為兩大類群,甲殼綱和蛛形綱聚為一亞群,昆蟲綱聚為另一亞群,說明節(jié)肢動物甲殼綱和蛛形綱的親緣關(guān)系比較近。蚤狀溞Hsp90與劍水蚤、日本沼蝦、紅螯相手蟹等甲殼綱的親緣關(guān)系最近;其次與蛛形綱的肩突硬蜱、龍骨三色蝎相關(guān)聯(lián);與印度跳蟻、刺柚釉小蜂、褐飛虱等昆蟲綱動物在分子進化上距離相對較遠。

為了驗證 Hsp90與枝角類的生殖轉(zhuǎn)化是否有相關(guān)性,本論文用Real Time PCR的方法檢測了Hsp90 mRNA在蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下的表達水平。結(jié)果顯示 Hsp90在孤雌幼溞和孤雌溞中的表達量并無顯著性差異,這一結(jié)果說明 Hsp90的表達與性成熟不相關(guān)。Hsp90 mRNA在雄溞中的表達量最高,其次是兩性溞(帶冬卵),且在冬卵中的表達量最低。在相同環(huán)境條件下Hsp90 mRNA在雄溞和兩性溞(帶冬卵)中的表達量明顯高于孤雌溞(帶夏卵),這說明Hsp90可能與兩性溞(帶冬卵)和雄溞的形成有關(guān),兩性溞(帶冬卵)和雄溞是在高密度等環(huán)境惡化的的條件下產(chǎn)生的,高密度的應激條件誘導了Hsp90的表達,保護兩性溞和雄溞在環(huán)境脅迫條件下的發(fā)育生長,從而也提高雄溞和兩性溞(帶冬卵)抵抗環(huán)境中由高密度引起的低溶氧、低pH和食物稀少的能力。關(guān)于大型溞Hsp90也有研究報道,在環(huán)境壓力條件下,Hsp90在胚胎發(fā)育過程中起到積極作用,Hsp90在環(huán)境壓力條件下有保護胚胎細胞的作用(Sasset al,1997;Federet al,1999;Lewiset al,1999;Soetaertet al,2006)。Hsp90在蚤狀溞冬卵中的表達量最低,可能是因為冬卵處于休眠狀態(tài)中,新陳代謝非常緩慢(幾乎停滯),故mRNA的表達水平也低于其它四種生殖狀態(tài)。本實驗還發(fā)現(xiàn),Hsp90 mRNA在兩性溞和雄溞中的表達也有顯著差異(P<0.05),在雄溞中的表達量明顯高于兩性溞,這說明Hsp90可能參與了精子的形成過程。王楓(1997)也報道了Hsp90在草魚的睪丸和腦中表達量最高。同樣Huang等(1999)報道,在精子冷凍的過程中,Hsp90的含量急劇下降,從而導致了精子活力下降;另外Huang等(2000)也發(fā)現(xiàn),把GA(一種Hsp90蛋白的特異性抑制劑)加入到精子稀釋液中,會導致精子活力下降。張瑩(2011)也發(fā)現(xiàn)Hsp90與精子活力、頂體完整率和精子畸形率均有一定相關(guān)性。Fatima(2013)明確提出Hsp90能為精子的形成過程提供動力。以上研究表明 Hsp90基因有可能在調(diào)控生殖轉(zhuǎn)化上發(fā)揮作用。至于Hsp90基因在蚤狀溞中的具體作用及其作用機理等問題,作者將會通過 RNA干擾、相關(guān)功能基因過量表達以及免疫組化技術(shù)等,進行更深入的研究。

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