牙鲆(Paralichthys olivaceus)β諾達病毒衣殼蛋白重組表達及復(fù)性條件優(yōu)化*

蔣嫣冉 張亦陳① 劉逸塵 耿緒云 孫金生,

(1.天津市動植物抗性重點實驗室 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津 300387;2.天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心 天津 300221)

β諾達病毒(Betanodavirus)亦被稱為神經(jīng)壞死病毒(viral nervous necrosis,NNV),是已發(fā)現(xiàn)的最小魚類病毒(Chiet al,2001;Groveet al,2003;黃劍南等,2005),其基因組包括2條正義的、不含有poly(A)末端的單鏈RNA,分別為RNA1和RNA2。RNA1的大小約為3.1kb,編碼非結(jié)構(gòu)A蛋白,A蛋白是病毒的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependant RNA polymerase,RdRp)(Johnsonet al,2000;Tanet al,2001)。RNA2 的大小約為 1.4kb,編碼病毒主衣殼蛋白(major capsid protein,MCP)(Krondiriset al,2002)。該病毒能感染5個目17科的40多種經(jīng)濟魚類,引發(fā)病毒性神經(jīng)壞死癥(Viral nervous necrosis,VNN),對仔魚和稚魚的致死率極高,是國際獸疫組織確定的嚴(yán)重疫病[Mundayet al,1992;世界動物衛(wèi)生組織(OIE)魚病專家委員會,2001]。該病自1985年暴發(fā)至今,已在世界范圍蔓延,我國水產(chǎn)養(yǎng)殖也深受其害。Lin等(2001)首次在我國大陸地區(qū)的石斑魚體內(nèi)分離獲得β諾達病毒,基因型分析顯示屬于 RGNNV型。2006年本實驗室從天津地區(qū)養(yǎng)殖牙鲆體內(nèi)也檢出該病毒(PONNV毒株)(毛海濤,2008),其基因型與RGNNV型相似性最高,這是我國大陸地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病毒感染牙鲆的病例,近幾年本地區(qū)β諾達病毒感染養(yǎng)殖牙鲆的狀況頻發(fā),亟需建立有效的防控方法。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)屬硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鰈形目、鰈亞目、鲆科、牙鲆屬,是名貴海水經(jīng)濟魚類,極具經(jīng)濟價值,在我國漁業(yè)養(yǎng)殖中占有非常重要的地位。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大和養(yǎng)殖密度提高,各種病害暴發(fā)越來越頻繁,其中由β諾達病毒引起的病毒性神經(jīng)壞死癥是嚴(yán)重危害魚苗的重大病害之一,由于魚苗普遍易感染,且死亡率極高,經(jīng)濟損失巨大(顧中華等,2012)。研制有針對性的疫苗對病毒性疫病的防控至關(guān)重要,基于天然病毒的滅活和減毒疫苗雖然具有較好的免疫效果,但安全性等方面亦存在問題,因此通過基因工程手段制備亞單位疫苗等方法越來越受到重視。利用大腸桿菌表達外源基因,具有工藝簡單、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點,但直接表達的蛋白質(zhì)通常會形成包涵體,需復(fù)性后才具有生物學(xué)活性,因此,復(fù)性效率的高低對產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)成本至關(guān)重要(吳正輝等,2008)。不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象復(fù)雜多樣,復(fù)性條件差別較大,因此,有針對性地探索目的蛋白的包涵體復(fù)性條件對工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。本研究構(gòu)建了感染牙鲆的β諾達病毒完整衣殼蛋白原核表達載體,優(yōu)化誘導(dǎo)表達參數(shù),在獲得目的蛋白高效表達的基礎(chǔ)上,利用正交分析獲得包涵體復(fù)性的最適條件,為今后的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 實驗材料、菌株、質(zhì)粒E.coliDH5α和BL21(DE3)plsS菌株購自天根生化科技有限公司,表達載體Pet21a和帶有PONNV毒株RNA2完整cDNA序列的質(zhì)粒RNA2-PMD18T 由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

試劑:LA-Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DL-2000 DNAMarker和Premixed Protein Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購自 Axygen;PageRuler Unstained Protein Ladder購自Fermentas。

儀器:PCR儀(Bio-Rad);Duo flow蛋白純化儀(BIO-RAD);LGJ-10C凍干機(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司);JY92-2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);蛋白電泳儀(BIO-RAD);微量核酸蛋白測定儀(BIO-RAD);臺式冷凍離心機(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù) PONNV毒株序列特點(KF841612),使用Primer Premier 5.0軟件在其衣殼蛋白完整編碼框兩端設(shè)計正反向引物,并在終止密碼子前引入His標(biāo)簽編碼序列。引物序列如下:正向引物(NYQf0001e):5’-CATATG GTACGCAAAGGTGAG-3’,反向引物(NYQr1014He):5’-AAGCTT AGTGGT GGTGGTGGTGGTGGTTTTCCGAGTCAACCCT-3’。引物序列下劃線為酶切位點。引物由生工生物(上海)有限公司合成。

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建 使用前述設(shè)計的引物,以RNA2-PMD18T質(zhì)粒為模板擴增病毒衣殼蛋白編碼區(qū),PCR反應(yīng)體系為:10×LA-Taq buffer 2.5μL,上下游引物(10μmol/L)各 1μL,LA-Taq DNA 聚合酶1U,dNTP(10mmol/L)2μL,模 板 1μL,雙 蒸 水17.3μL。PCR 反應(yīng)條件為:94°C 預(yù)變性 4min;94°C 變性 1min,50—55°C退火 1min(6個循環(huán),每循環(huán)降1°C),72°C延伸1min;94°C變性1min,51°C退火1min,72°C延伸1min,24個循環(huán);72°C總延伸 10min。擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分離,目的條帶采用Axygen凝膠回收試劑盒抽提并以 2.5μL擴增片段,2.1μL Solution I和 0.4μL PMD-18T 載體的體系 16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細胞,經(jīng)氨芐平板篩選轉(zhuǎn)化子進行PCR檢測后送北京華大生物公司測序并保種。抽提帶有克隆片段的質(zhì)粒和Pet21a質(zhì)粒,分別經(jīng)NdeI和HindIII雙酶切后將帶有His標(biāo)簽的病毒衣殼蛋白克隆片段接入Pet-21a質(zhì)粒構(gòu)建表達載體 RNA2-Pet21a,連接接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,經(jīng) PCR及測序檢測無誤后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與質(zhì)譜鑒定 將 RNA2-Pet21a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌株BL21(DE3)plsS,挑取陽性克隆接種于含有氨芐和卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37°C震蕩培養(yǎng)至OD = 0.5—0.6,取1mL未誘導(dǎo)菌液作為對照,其余加入 IPTG至終濃度為 1mmol/L,分別于誘導(dǎo) 0.5h、1h、2h、3h、4h、5h收集菌液,10000g離心2min,棄上清。用PBS清洗沉淀后,10000g離心2min 加入 1mL Lysis Buffer(50mmol/L NaH2PO4?2H2O,300mmol/L NaCl,10mmol/L Iminazole),進行超聲破碎,程序為:400W,5s/次,間隔5s,破碎5min,至半透明。4°C,10000g離心20min,收集上清與沉淀,分別適量加 1×SDS上樣緩沖液,煮沸 10min,10000g離心1min后,取上清經(jīng) 15% SDS-PAGE分離,將目的條帶切下送華大生物科技公司進行質(zhì)譜鑒定。

1.2.4 重組蛋白的純化 將1L誘導(dǎo)表達的重組菌液經(jīng) 10000r/min離心 10min收集菌體,按 1g濕菌10mL BufferA破碎緩沖液(含 1% TritionX-100,2mmol/LEDTA)的比例重懸菌體,冰浴超聲破碎3次。破碎后溶液4°C,10000r/min,離心10min,棄去上清留沉淀。BufferB洗滌緩沖液(300mmol/L NaCl,50mmol/L NaH2PO4?2H2O,5mmol/L Iminazole,2mmol/L Urea,pH 7.4)洗滌沉淀3次,可得初步純包涵體。上述包涵體經(jīng) WashI buffer(500mmol/L NaCl,20mmol/L Iminazole,20mmol PB,8mol/L Urea)溶解,渦旋振蕩20min,4°C,10000r/min離心10min,上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾后結(jié)合于鎳離子親和柱純化,具體操作按照Bio-Scale Mini profanity IMAC操作手冊進行。

1.2.5 重組蛋白復(fù)性條件優(yōu)化 參考稀釋復(fù)性主要優(yōu)化條件(吳正輝等,2008;龐懷宇等,2010),以大腸桿菌表達產(chǎn)生的重組衣殼蛋白包涵體為材料,利用正交試驗優(yōu)化重組蛋白的稀釋復(fù)性條件。以鹽離子濃度即PBS濃度(A)、尿素濃度(B)、溫度(C)以及 pH(D)四個因素做為主要優(yōu)化參數(shù),針對每個參數(shù)設(shè)置 4個實驗條件進行綜合正交分析,研究不同因素對重組蛋白復(fù)性影響的大小并找出適宜的匹配條件。參照表1設(shè)計將分別將 400μL濃度為1.06μg/μL的重組包涵體蛋白溶液加入到 4mL不同復(fù)性緩沖液中在不同溫度下復(fù)性 12h。復(fù)性產(chǎn)物10000g離心10min,收集上清凍干后用1×PBS溶解,利用微量核酸蛋白測定儀進行蛋白濃度測定,計算可溶蛋白總量。

表1 重組蛋白復(fù)性中的因素與水平參數(shù)值Tab.1 Refolding factors and levels of recombinant protein

2 結(jié)果

2.1 原核表達載體的構(gòu)建

以RNA2-PMD18T質(zhì)粒為模板,利用引物NYQf0001e和NYQr1014He擴增長度為1017bp的β諾達病毒衣殼蛋白編碼區(qū),電泳檢測在約1kb處有單一條帶,測序結(jié)果與預(yù)期一致。目的片段經(jīng)HindIII和NdeI雙酶切連入表達載體Pet-21a,測序顯示含有T7啟動子驅(qū)動的C端融合His標(biāo)簽的完整病毒衣殼蛋白表達盒,表明載體構(gòu)建成功。

2.2 目的蛋白誘導(dǎo)表達與質(zhì)譜鑒定

含有RNA2-Pet21a表達載體的大腸桿菌在37°C條件下培養(yǎng)至OD = 0.5—0.6,加入IPTG至終濃度為1mmol/L,進行誘導(dǎo)表達,分別在0、0.5、1、2、3、4、5h點取樣,破碎菌體后分別取上清和沉淀,經(jīng)15%SDS-PAGE分離檢測。結(jié)果顯示對照組在預(yù)期大小沒有明顯條帶,實驗組在 37kDa左右有預(yù)期大小條帶,且隨誘導(dǎo)時間延長表達量也隨之增加并在約5h后達到峰值(圖1)。用潔凈手術(shù)刀小心切取目標(biāo)條帶經(jīng)質(zhì)譜鑒定,利用 LC-ESI-MS進行分析和鑒定,結(jié)果采用BioWorks軟件與SEQUEST數(shù)據(jù)庫進行比對,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白有-ISQAVLPAGTGTDGYVVVDATIVPDLLPR-、-LILLCVGNNTDVVNVSVLC R-、-FAGNAGTPAGWFR-、-QILLPVGTVCTR-4條肽段與預(yù)期蛋白中的相應(yīng)氨基酸序列完全匹配(圖2),由此判定上述蛋白條帶即為表達的重組衣殼蛋白。

圖1 重組衣殼蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)plsS中的表達Fig.1 Expression of recombinant capsid protein in E.coli BL21(DE3)plsS

2.3 衣殼蛋白純化及復(fù)性條件優(yōu)化

離心收集誘導(dǎo)后的發(fā)酵菌體,破碎后取上清經(jīng)鎳離子親和柱純化,SDS-PAGE電泳檢測表明獲得單一條帶,純度>98%(圖3)。正交試驗中包涵體溶液經(jīng)12h稀釋復(fù)性后,離心取上清,凍干后用1×PBS溶解并測量蛋白濃度,計算可溶蛋白總量。測量結(jié)果見表2,直接分析表明,重組衣殼蛋白初步復(fù)性的最佳條件為A1B1C1D1,即在溫度為4°C,復(fù)性緩沖液中PBS濃度0.05mol/L,尿素濃度0.8mol/L,pH為7的條件下復(fù)性效果最好,其復(fù)性前蛋白總量為 424μg,復(fù)性后可溶蛋白總量為73.08μg,蛋白復(fù)性率為17.24%。極差大小為B >D >A >C,表明尿素濃度對重組蛋白復(fù)性的影響最大,其次是復(fù)性緩沖液的pH,PBS濃度和溫度對復(fù)性影響較小。方差分析結(jié)果見表3,計算得到因素的偏差平方和、自由度、F比、臨界值,顯示出各因素對重組蛋白復(fù)性影響的顯著性,因素顯著性程度為B >D >C >A。

圖2 重組蛋白的質(zhì)譜鑒定Fig.2 Mass spectrum verified the recombinant capsid protein

圖3 純化后重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

表2 L16(4)4正交試驗結(jié)果分析Tab.2 Analysis of orthogonal test

3 討論

諾達病毒(Nodaviradae)可分為主要感染昆蟲的α諾達病毒屬(Alphanodavirus)以及以魚類為主要感染對象的β諾達病毒屬(Betanodavirus)(劉傳鳳等,2011),其中β諾達病毒根據(jù)來源、感染宿主以及致病性等方面的不同可分為4種基因型。β諾達病毒衣殼蛋白具有大量抗原表位,可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護性抗體,因此可通過體外表達該病毒的衣殼蛋白來研制抗病毒疫苗(Hegdeet al,2002)。但是,不同β諾達病毒株系衣殼蛋白之間雖具有較高的相似性,但也存在差異,主要原因是其復(fù)制所依賴的聚合酶RdRp校正能力弱,容易引發(fā)突變,從而產(chǎn)生針對不同宿主細胞表面受體的表位,因此該病毒具有非常廣泛的宿主侵染性?；讦轮Z達病毒這一特點,有必要研制有針對性的疫苗產(chǎn)品,以提高保護效率;另一方面也可為進一步研究其與特定宿主細胞表面相互識別及結(jié)合位點的信息提供參考。近年來已有一些研究嘗試?yán)迷吮磉_系統(tǒng)制備β諾達病毒衣殼蛋白。陳曉艷等(2005)將斜帶石斑魚(Epinephlus coioides)神經(jīng)壞死病毒(orange-spotted nervous necrosis virus,OGNNV)衣蛋白基因連接到 pet32a表達載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),表達獲得分子量為 55.3kDa的融合蛋白。蘇友祿等(2010)將赤點石斑魚(Epinephelus akaara)神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)主衣殼蛋白(MCP)基因進行原核重組表達,得到分子量約為44.5kDa的重組蛋白。Tanaka等(2001)將七帶石斑魚(Epinephelus septemfasciatusThunberg)β諾達病毒的MCP基因在大腸桿菌中進行了融合表達,提取包涵體溶液免疫動物后,用不同滴度的病毒液進行攻毒。低劑量病毒攻毒組的相對存活率達69%—88%,平均為78.5%,高劑量病毒攻毒組的相對存活率為 35%—37%,因此可利用重組β諾達病毒衣殼蛋白制備疫苗。本研究針對感染牙鲆的β諾達病毒,利用大腸桿菌表達系統(tǒng),構(gòu)建用于制備該病毒衣殼蛋白的表達載體RNA2-Pet21a,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plysS后經(jīng)誘導(dǎo)表達獲得約37kDa的重組蛋白,質(zhì)譜鑒定為β諾達病毒衣殼蛋白,這將有助于進一步研制有針對性的疫苗或檢測制品。

表3 正交試驗方差分析Tab.3 Analysis of variance for orthogonal test

工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白藥物,一半以上是在大腸桿菌中表達的,并多以包涵體形式存在,因此,復(fù)性過程對生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本至關(guān)重要,對工業(yè)生產(chǎn)影響巨大(馮小黎,2001;吳正輝等,2008)。通常,天然構(gòu)象的蛋白較包涵體形式具有更多的抗原表位,免疫原性亦更高,因此利用復(fù)性后的衣殼蛋白有望獲得更佳的免疫效果,但目前對于重組該病毒衣殼蛋白的包涵體復(fù)性條件的分析鮮有報道。本研究構(gòu)建的β諾達病毒衣殼蛋白表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌,經(jīng)誘導(dǎo)表達后利用 SDS-PAGE分析發(fā)酵液以及菌體裂解液等組分,發(fā)現(xiàn)表達的重組蛋白主要以包涵體的形式存在,這與已報道的一些β諾達病毒衣殼蛋白重組表達結(jié)果一致(陳曉艷等,2005;蘇友祿等,2010)。產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和柱純化后得到目的蛋白的單一的條帶,在此基礎(chǔ)上,嘗試了對重組蛋白的包涵體進行復(fù)性條件的優(yōu)化。通過正交試驗著重分析了4種關(guān)鍵因素對復(fù)性效果的影響,數(shù)據(jù)分析中極差是反映試驗因素影響的關(guān)鍵參數(shù),極差越大表明其對試驗結(jié)果的影響越大,本研究中極差最大的為 B,說明尿素對該包涵體復(fù)性的影響較大,其次是復(fù)性緩沖液 pH,PBS濃度和溫度相對影響較小。復(fù)性后蛋白濃度最高的因素組合為A1B1C1D1,即在4°C條件下,利用PBS濃度0.05mol/L,尿素濃度為0.8mol/L,pH為7的緩沖液對包涵體進行稀釋復(fù)性可以獲得較好的效果,其蛋白復(fù)性率為17.24%,是較理想的復(fù)性條件。本研究成功構(gòu)建了β諾達病毒衣殼蛋白原核表達載體,實現(xiàn)重組蛋白高效表達,并優(yōu)化了復(fù)性條件,可為今后批量放大生產(chǎn)提供技術(shù)支持,亦可為同類研究提供重要參考。

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