蝦蛄肉酶法制備抗氧化肽的工藝優(yōu)化和活性研究*

李云濤 陳 博 馬劍茵

(浙江海洋學院 食品與藥學學院 舟山316004)

將蛋白質通過酶解制備成生物活性肽是目前食品、藥品科學界的研究熱點,許多研究資料顯示,多肽有很強的抗氧化活性及抗菌、免疫調節(jié)、抑制胰島細胞凋亡、改善胰島素抵抗、抗高血壓、降血脂、誘導腫瘤細胞凋亡或分化、抗血管生成等作用(王導等,2011;王靜鳳等,2007),多肽對許多疾病的發(fā)生、發(fā)展和臨床治療有重要意義。抗氧化肽是一種重要的多肽,它具有清除人體內多余自由基,減輕機體所受損傷,抗衰老、抗腫瘤、解毒等作用(Je等,2005)。國內外的科學工作者以海洋生物蛋白為原料,通過酶解法制備抗氧化肽多有報道,如李志英等(2012)用木瓜蛋白酶水解虎紋海參(Holothuriapervicax),在加酶量12.0%,水解2h,溫度55°C,pH8.0時得到的酶解液有很好的抗氧化作用。Kim等(2001)用鏈霉蛋白酶E水解阿拉斯加鱈魚(Theragrachalcogramme)得到的多肽在亞油酸體系中有很高的抗氧化活性,可開發(fā)成一種天然的抗氧化劑。Qian等(2008)分別用多種酶水解牛蛙(Ranacatesbeiana)皮蛋白,從中提取并分離純化得到多肽,有很高的抗氧化活性。Binsan等(2008)從白蝦(Litopenaeusvannamei)頭胸部提取出了抗氧化肽等。

蝦蛄(Oratosquillaoratoria)屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、口足目(Stomatopoda)、蝦蛄科(Squillidae)、口蝦蛄屬(Oratosquilla),俗稱“螳螂蝦”、“琵琶蝦”、“蝦爬子”等,產量大,分布廣,絕大多數(shù)種類生活于熱帶和亞熱帶,在中國南海已發(fā)現(xiàn)80余種。目前對蝦蛄的藥用研究主要集中在甲殼素和乙醇提取物抗腫瘤方面(顧帝水等,2004;楊丹等,2006),而對蝦蛄肉酶解多肽的研究尚未見報道。

本研究以蝦蛄肉為原料,用胰蛋白酶酶解制備抗氧化肽。并綜合運用正交試驗和響應面法分析優(yōu)化蝦蛄肉抗氧化肽的酶解條件,既可以讓數(shù)據點分布均勻合理,又可以分析各項的顯著性和影響因素之間的交互作用,使分析結果更可靠,更有說服性,從而為蝦蛄肉抗氧化肽的開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料:新鮮蝦蛄采集自浙江舟山近海海域,去殼、頭部、背部,洗凈用勻漿機攪碎為肉糜。

試劑:胰蛋白酶,鄰二氮菲,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH);其它試劑均為分析純。

儀器設備:85-2恒溫磁力攪拌器;ZD-420不銹鋼新型電熱恒溫水槽;FE20實驗室pH計;BSA323S電子天平;JJ-2組織搗碎機;CF16RXII高速冷凍離心機;FD-1000冷凍干燥機;UV1100紫外分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝦蛄肉蛋白酶解多肽的制備工藝 精密稱取蝦蛄肉糜,調 pH值,在水浴保溫條件下加入一定量的蛋白酶酶解,酶解到設定時間時將酶解液在100°C水浴中滅活15min,4000r/min離心20min,取上清液冷凍干燥得到蝦蛄肉蛋白酶解物,取定量配制成5mg/ml的水解液樣品,備用。

1.2.2 抗氧化能力的測定方法 DPPH自由基清除活性的測定是根據Bersuder等(1998)描述的方法稍作修改。取 1.5ml樣品與 1.5ml含 0.02%DPPH的99.5%乙醇溶液混合,振蕩,在暗室室溫下放置30min,然后在波長 517nm處測吸光值。DPPH自由基清除率(R1)按公式(1)計算,其中,空白調零:1.5ml99.5%乙醇+1.5ml蒸餾水,Ac:1.5ml含0.02%DPPH的 99.5%乙醇溶液+1.5ml99.5%乙醇,Aj:1.5ml樣品+1.5ml99.5%乙醇,Ai:1.5ml樣品+1.5ml含0.02%DPPH的99.5%乙醇溶液。

清除羥自由基能力的測定方法參考Elmastasa等(2006)和金銘等(1996)的工作。取0.75mmol/L的鄰二氮菲 2.0ml于試管中,依次加入 2ml磷酸鹽緩沖液(pH7.4)和2ml蒸餾水,充分混勻后,加入0.75mmol/L的硫酸亞鐵溶液 2ml,混勻,加入 1ml 1.0%的 H2O2,37°C水浴6min,測定波長536nm處的吸光度Ap;用1ml蒸餾水代替 1mlH2O2,測得吸光度Ab;用樣品代替1ml的蒸餾水,測得吸光度As。羥自由基清除率(R2)按公式(2)計算。

還原力的測定參考 Shon等(2004)的方法。2ml酶解液樣品加入到 2ml的 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2ml的1%鐵氰化鉀溶液的混合液中。混合物50°C水浴20min,在反應混合物中加入2ml的10%的 TCA(三氯乙酸),混合后以3000r/min離心10min,取上清 2ml,加入 2ml蒸餾水和 0.4ml的 0.1%FeCl3充分混勻反應,10min后測定其在700nm處的吸光值,值越大說明還原力越強。

超氧陰離子清除參考許申鴻等(2001)的工作。對照組:4.5m l50mmol/L的Tris-HCl+4.2ml蒸餾水混勻,于25°C恒溫20min,再加入預熱過的 3mmol/L鄰三苯酚 0.3ml,迅速搖勻,立即倒入比色皿中,在波長325nm處每30s測定一次吸光度值A0,測4min,以時間為橫坐標,A0為縱坐標進行線性回歸分析,得到的直線斜率為反應速率ΔA0。

樣品組:4.5ml 50mmol/LTris-HCl+3.2ml蒸餾水+1ml樣品混勻,于 25°C恒溫 20min,再加入預熱過的3mmol/L鄰三苯酚0.3ml,同上操作測定加樣后的自氧化速率ΔA1。

空白調零:用9ml 10mmol/L的HCl調零。

清除超氧陰離子能力用R3表示,由公式(3)計算得到。

1.2.3 抗氧化肽的組成成分分析方法 水分含量按照 GB/T5009.3-2003測定,灰分含量按照 GB/T5009.4-2003測定,采用 BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質含量,脂肪含量按照GB/T5009.6-2003測定。

1.3 實驗設計

1.3.1 正交試驗 在初步確定酶解工藝的基礎上,選擇料液比(A)、pH值(B)、加酶量(C)、溫度(T)、酶解時間(D)等因素設計 L16(45)正交表,優(yōu)化以確定最佳工藝。選取因素和水平排列見表1,正交實驗及結果見表3。

表1 因素和水平表Tab.1 Design of factors and levels in the experiments

1.3.2 響應面設計 在正交試驗的基礎上,按照Box-Behnken(操龍飛等,2012)中心組合實驗設計原理,以pH值、溫度、酶量為自變量,以R1為響應值,每一個自變量的高、中、低水平分別由1、0、–1編碼表示,設計見表2。

表2 蝦蛄肉酶解響應面實驗因素水平表Tab.2 Coded variables and their coded levels in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

由表3可知,5個因素的極差大小順序為:B＞T＞A＞C＞D,即 pH 值的影響最大,其次是溫度和料液比,影響最小的是時間。對于每一個因素來說,Ti(i=1,2,3,4)是指該因素在表1所示的i水平條件下得到的R1值的均值,根據極差和均值可得出最優(yōu)組合是︰料液比1︰4,pH 值7.0,加酶量1500u/g,溫度50°C,時間 2h。

表3 L16(45)正交實驗設計與結果Tab.3 L16(45)orthogonal design and results

利用SPSS軟件對各因素進行回歸分析,結果見表4和表5,采用逐步回歸的方法,模型經方差分析檢驗得到:F=7.010,P=0.006,在α=0.05水平時,可認為實驗結果和料液比、pH值和溫度之間存在線性關系,則回歸方程為Y=26.187–3.503A+2.498B+2.048T。回歸系數(shù)經過t檢驗得到三個因素的P值分別為0.006,0.033,0.072,水平α=0.10時,三個因素均有顯著性意義。分析結果與極差分析結果一致。由于顯著性因素較多,所以需要通過響應面法進一步優(yōu)化,獲得最佳酶解方案。

表4 正交實驗方差分析表Tab.4 ANOVA analysis of orthogonal design results

表5 正交實驗回歸系數(shù)Tab.5 Regression coefficients of orthogonal design

2.2 響應面分析結果

經過正交實驗結果分析,得到料液比、pH值和溫度是顯著性因素,所以以這三個因素作為自變量,R1作為響應值,具體的因素和水平表見表2,實驗結果見表6。

表6 蝦蛄肉酶解多肽提取響應面實驗設計與結果Tab.6 Experimental design and the results of responsesurface analysis

用Design Expert 8.0.6軟件對表6中的實驗數(shù)據進行多元回歸擬合,顯著性檢驗和回歸模型系數(shù)見表7?；貧w模型的F=23.3,其P=0.0002,表明該模型極為顯著,決定系數(shù)R2=0.9677,表明回歸模型與實際情況擬合性良好,可以用于酶解工藝。模型中,T、T2對R1的影響極為顯著,pH對R1的影響顯著,得到pH值、料液比、溫度的二元回歸模型方程為Y=44.6800+2.10875B+1.23375A+8.11250T–1.21500BA+0.58250BT–0.41250AT–8.33000B2–4.60000A2–6.71750T2。

表7 響應面法方差分析(ANOVA)的分析結果Tab.7 The analysis of variance of the constructed regression model

利用軟件分析各個因素的交互作用,并根據回歸分析的結果繪制相應的響應面和等高線圖,從圖1—圖3中可以看出各個因素均有極值點,對二元回歸方程進行求導,用軟件優(yōu)化分析得到最佳的條件為B=7.070,A=1:3.09,T=51.10°C,R1=47.3466%,經驗證,在響應面所得的最佳條件下得出的R1為49.02 %,與預測結果相比相對誤差為 3.53%,與預測值基本相符,可以作為最佳酶解條件。

圖1 pH和料液比對R1影響的響應面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plot for the effect of cross-interaction between pH and S︰L on R1

圖2 pH和溫度對R1影響的響應面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot for the effect of cross-interaction between pH and temperature on R1

圖3 料液比和溫度對R1影響的響應面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plot for the effect of cross-interaction between S︰L and temperature on R1

2.3 抗氧化肽的組成成分分析

按照 1.2.3中多肽的成分分析方法,測得蝦蛄酶解多肽中水分、蛋白質、脂肪、灰分的含量見表8。

表8 原料成分含量分析Tab.8 Analysis of the ingredient of raw material

2.4 抗氧化實驗結果

以0.1mg/ml維生素C作為陽性對照,R1為74.10%,R2為 38.64%,R3為 40.01%,還原力為A700為 0.265,樣品超氧陰離子測定所得數(shù)據如圖4和圖5所示,ΔA0為0.5646,ΔA1為0.4001,R3為 29.13%,R2為88.9%,還原力A700為0.243。

3 討論與結論

整個實驗采用 L16(45)正交試驗和三因素三水平的響應面分析法(牛瑞等,2011),綜合分析最佳酶解工藝。在正交實驗中存在3個顯著因素,利用Box-Behnken設計原理設計三因素三水平的響應面分析方案,響應面法優(yōu)化實驗中建立的模型回歸效果顯著,擬合性良好,可以很好地預測實驗結果,最終優(yōu)化的最佳酶解條件為︰料液比1︰3.09,pH值7.07,加酶量1500u/g,溫度51.10°C,時間2h。預測R1為47.3466%,經驗證R1為 49.02%,與預測結果相比相對誤差為 3.53 %,說明該方法可行,這可以為海洋生物提取抗氧化肽提供依據,對海洋蝦蛄類生物的深加工和開發(fā)功能性食品有重要的意義。

圖4 對照組鄰苯三酚自氧化速率Fig.4 The control group rate of pyrogallol auto-oxidation

圖5 樣品組鄰苯三酚自氧化速率Fig.5 Sample group rate of pyrogallol auto-oxidation

按照最佳條件提取得到的抗氧化肽粗品,經抗氧化能力的測定,得到R2為88.9%,R3為29.13%,還原力A700為 0.243,與維生素 C陽性對照組相比,表明蝦蛄肉酶解多肽的抗氧化性較強,可以進一步對粗品進行分離純化,利用凝膠滲透色譜、反相高效液相和質譜等分析技術獲得具有較強抗氧化能力的單一多肽。

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