苦丁茶提取物質(zhì)量分析

胡順莉，俞 致，吳 虹，李 輝，陳縉筠，陳 建，代苗苗，王 偉，孫亮亮

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽合肥 230031；2.安徽省婦幼保健院藥劑科，安徽合肥 230001）

·方藥研究·

苦丁茶提取物質(zhì)量分析

胡順莉1，俞 致2，吳 虹1，李 輝1，陳縉筠1，陳 建1，代苗苗1，王 偉1，孫亮亮1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，安徽合肥 230031；2.安徽省婦幼保健院藥劑科，安徽合肥 230001）

目的 對苦丁茶藥材水提物進行質(zhì)量分析。方法 以槲皮素、山柰素作為對照品，采用薄層色譜法對苦丁茶藥材中黃酮類化合物進行定性鑒別；采用反相高效液相色譜法測定苦丁茶藥材中槲皮素和山柰素含量。結(jié)果 薄層色譜鑒別結(jié)果表明，供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點。槲皮素、山柰素進樣量分別在0.1～3.2μg、0.01～0.32μg范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好（槲皮素r1＝0.999 9；山柰素r2＝0.999 8），槲皮素及山柰素的平均加樣回收率分別為102.34％和101.24％，RSD分別為3.26％和3.15％（n＝9）。結(jié)論 薄層色譜法和反相高效液相色譜法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為苦丁茶藥材水提物的質(zhì)量分析方法。

苦丁茶；質(zhì)量分析；薄層色譜法；反相高效液相色譜法

苦丁茶是大葉冬青（Ilex latifolia Thunb）系冬青科冬青屬常綠喬木的樹葉，大葉冬青主要分布于浙江、江蘇、安徽、福建、湖北等地，是華東地區(qū)苦丁茶的主要原植物，是一種傳統(tǒng)的純天然保健飲料。苦丁茶中含有苦丁皂苷、氨基酸、維生素C、多酚類、黃酮類、咖啡堿、蛋白質(zhì)等200多種成分。其成品茶清香味苦、而后甘涼，具有清熱消暑、明目益智、生津止渴、利尿強心、潤喉止咳、降壓減肥、抑癌防癌、延緩衰老、活血脈等多種功效［1－2］，素有“保健茶”“美容茶”“減肥茶”“降壓茶”“益壽茶”等美稱。隨著人們自我保健意識的增強，發(fā)掘利用苦丁茶的藥用保健價值已成為廣大科技工作者關(guān)注的課題。

近年來對苦丁茶的研究較多，其種類以及提取部位的化學(xué)成分、藥理作用、保健功能等也越來越明確［34］。已有關(guān)于苦丁茶含片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，但苦

丁茶藥材水提物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究暫無文獻報道。本實驗對苦丁茶藥材水提物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行初步研究，為苦丁茶藥材的廣泛應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200液相色譜儀（DAD檢測器）；RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵；KQ200－KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；CP255D型萬分之一電子天平：德國Sartorius公司；芬蘭百得移液槍；HB－RO／05純水機：杭州惠邦凈水設(shè)備有限公司；Milli－Q超純水機：Reference公司；ZK－8ZA型真空干燥箱：上海實驗儀器總廠。

1.2 試劑和試藥 甲醇和磷酸均為色譜純；水為純化水、超純水；山柰素對照品（批號110861－220707）和槲皮素對照品（批號100081－200406）：均由中國藥品生物制品檢定所提供；冬青科大葉苦丁茶藥材（批號130101－130105）：產(chǎn)地四川省。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物制備方法 取5批苦丁茶（批號分別為130101、130102、130103、130104、130105）適量，據(jù)課題組前期研究，各加12倍的水浸泡20min，加熱微沸后開始計時，60min后，冷卻過濾。濾渣重復(fù)上述操作提取2次，合并煎液，蒸發(fā)得浸膏，置真空干燥箱中干燥得干浸膏，研細(xì)?？喽〔杷幉乃嵛锍庶S褐色，味微苦。

2.2 鑒別 取“2.1”項下研細(xì)后的苦丁茶藥材提取物粉末2g，加入甲醇40ml，超聲處理20min，放冷，過濾，濾液蒸干。殘渣加正丁醇15ml，水浴溫浸15min，并時時振搖。放冷，過濾，濾液蒸干。殘渣加2ml無水乙醇使溶解，作為供試品溶液。另取槲皮素和山柰素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加無水乙醇制成1mg／ml的混合對照溶液。再取苦丁茶對照藥材水提浸膏1g，按供試品制備方法制備對照藥材溶液。按薄層色譜法（2010年版《中華人民共和國藥典》［5］一部附錄ⅥB）試驗。分別吸取上述各種溶液各10μl，點于同一含4％醋酸鈉的硅膠G板上，以乙酸乙酯－丙酮－甲醇－水（10∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，以2％三氯化鋁乙醇溶液浸板顯色，紫外燈（365 nm）下檢視。

供試品色譜中，在對照品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯現(xiàn)相同顏色的熒光斑點。見圖1。

圖1 苦丁茶藥材提取物中槲皮素和山柰素薄層色譜圖

2.3 重金屬和砷鹽檢查

2.3.1 重金屬檢查：按照2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄ⅨE重金屬檢查法第二法進行檢查。實驗結(jié)果符合藥典規(guī)定。

2.3.2 砷鹽檢查：按照2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄ⅨF砷鹽檢查法第一法進行檢查。實驗結(jié)果符合藥典規(guī)定。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗：色譜柱：依利特Hpersil ODS2（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇－0.5％磷酸（53∶47）；檢測波長：360nm；流速：1.0ml／min；柱溫：40℃；理論塔板數(shù)按槲皮素峰計算應(yīng)不低于8 000。在此色譜條件下，槲皮素的保留時間約為7min；山柰素的保留時間約為10 min，結(jié)果見圖2。

圖2 槲皮素和山柰素對照品（A）和苦丁藥材水提物供試品（B）高效液相色譜圖

2.4.2 溶液的制備

1）槲皮素、山柰素對照品溶液的制備：精密稱取槲皮素對照品和山柰素對照品適量，加甲醇制得濃度為0.040mg／ml的槲皮素對照液和濃度為0.002 mg／ml的山柰素對照液。

2）供試品溶液的制備：精密稱取“2.1”項下苦丁茶藥材水提物粉末2.0g，至100ml錐形瓶中，精密加入25ml甲醇，稱定質(zhì)量。超聲30min，取出放冷后，補足減失質(zhì)量。過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液10ml至25ml量瓶中，精密加入25％鹽酸溶液5ml，用色譜甲醇定容至刻度，搖勻。精密移取10ml，至磨口瓶中，稱定質(zhì)量，回流1h，冷卻后補足減失質(zhì)量，取適量過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.3 線性關(guān)系考察：分別精密吸取“2.4.2”第一項下配制的槲皮素對照液和山柰素對照液各50、100、200、400、800、1 600μl置同一10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按上述色譜條件，進樣20 μl，測定槲皮素及山柰素的峰面積。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。槲皮素回歸方程為：y1＝59 576 x1＋101.33（r1＝0.999 9）；山柰素回歸方程為：y2＝73 466 x2－1.766 8（r2＝0.999 8）。結(jié)果表明，槲皮素的進樣量在0.1～3.2μg范圍內(nèi)，山柰素的進樣量在0.01～0.32μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4 精密度實驗：精密吸取上述混合對照品溶液（槲皮素0.04mg／ml；山柰素0.002mg／ml）20μl，連續(xù)進樣6次，結(jié)果槲皮素峰面積的RSD＝0.06％，山柰素峰面積的RSD＝0.88％。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗：精密吸取新制供試品溶液20 μl，分別在0、2、4、6、8、10、12、18h測定。測得槲皮素和山柰素含量的RSD分別為0.36％和1.45％（n＝6），結(jié)果表明在18h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性實驗：取同一批苦丁茶藥材水提物樣品6份，每份2g，分別按“2.4.2”項下第二項方法制備供試品溶液，進樣測定含量。測得槲皮素和山柰素含量的RSD分別為1.95％和1.77％（n＝6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收率實驗：精密稱取9份已知含量的同一批苦丁茶藥材提取物樣品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于槲皮素0.123 5mg、山柰素0.022mg），分別精密加入一定量的槲皮素和山柰素對照品，按照“2.4.2”項下第二項方法“精密加入25ml甲醇”操作，制備供試液，濾過（0.45μm），棄去初濾液，取續(xù)濾液在上述色譜條件下進樣20μl，按樣品含量測定方法測定，計算平均回收率，結(jié)果見表1和表2。槲皮素的平均回收率為102.34％，RSD＝3.26％（n＝9）；山柰素的平均回收率為101.24％，RSD＝3.15％（n＝9）。

表1 槲皮素加樣回收率實驗

表2 山柰素加樣回收率實驗

2.4.8 樣品含量測定：精密稱取5份苦丁茶藥材提取物按“2.4.2”項下第二項方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，分別精密吸取“2.4.2”項下對照品溶液及上述供試品溶液各20μl進樣，測定各自峰面積，按外標(biāo)峰面積法計算苦丁茶藥材中槲皮素及山柰素的含量。見表3。

表3 苦丁茶藥材水提物樣品中槲皮素、山柰素含量

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇 有文獻報道，苦丁茶中黃酮類（槲皮素、山柰素等）化合物含量豐富［6－7］，因此本實驗選擇上述主要成分作為鑒別和含量測定的指標(biāo)性成分。

3.2 薄層色譜法鑒別時的條件選擇 薄層板的選擇：對苦丁茶藥材水提物中槲皮素和山柰素進行薄層色譜法鑒別時，起初用的是普通的硅膠G板，結(jié)

果發(fā)現(xiàn)槲皮素和山柰素兩種成分的斑點分離度不佳，考慮到兩者極性差別小，利用兩者酸堿性的差異（化學(xué)結(jié)構(gòu)式相差一個酚羥基），將硅膠板用4％ NaAc改性，然后進行薄層鑒別分析，所得斑點分離度較好。

3.3 供試品制備方法的選擇 制備含量測定用供試品溶液時，曾用加熱回流1h和超聲提取1h（200 W，40kHz）兩種方式，進樣所得色譜圖顯示：超聲提取1h檢測槲皮素和山柰素含量不如加熱回流1 h的含量大，最終選用加熱回流1h的方式制備供試品溶液。

3.4 高效液相色譜法條件選擇 參照《中華人民共和國藥典》銀杏葉片中總黃酮醇苷的測定方法規(guī)定的色譜條件對樣品中成分分離進行考察。發(fā)現(xiàn)以甲醇－0.1％磷酸（50∶50）為流動相進行洗脫時，槲皮素的保留時間為10min。將流動相調(diào)整為甲醇－0.5％磷酸（53∶47），并將柱溫升高至40℃后，槲皮素的保留時間提前為7min，樣品中各組分獲得較好的分離。

［1］莊輝發(fā).大葉冬青苦丁茶的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景［J］.熱帶學(xué)，2009，29（8）：51－54.

［2］劉韶，秦勇，杜方麓.苦丁茶化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2003，28（9）：834－836.

［3］任廷遠，安玉紅，王華.苦丁茶的研究進展［J］.蠶桑茶葉通訊，2008（5）：22－24.

［4］王新，陸慧寧，林少琨.苦丁茶冬青葉化學(xué)成分及藥理作用研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（3）：366－370.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［6］黃雪梅，蒙大平.苦丁茶的研究進展及開發(fā)利用［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2008，30（7）：1022－1025.

［7］石敏娟，朱衛(wèi)豐，劉耀明.苦丁茶中的熊果酸和齊墩果酸的含量測定［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2007，35（2）：45－46.

Quality Analysis of Kudingcha Aqueous Extract

HU Shun－li1，YU Zhi2，WU Hong1，LI Hui1，CHEN Jin－yun1，CHEN Jian1，DAI Miaomiao1，WANG Wei1，SUN Liang－liang1
（1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine ＆Anhui Key Laboratory of Chinese Medicine Research and Development，Anhui Hefei 230031，China；2.Department of Pharmacy，Anhui Maternal and Child Health Hospital，Anhui Hefei 230001，China）

Objective To analyze the quality of Kudingcha aqueous extract.Methods With quercetin and kaempferol as

ubstances，thin－layer chromatography（TLC）was adopted for the identification of flavonoids in Kudingcha.Reversed－phase high－performance liquid chromatography（RP－HPLC）was used to determine the content of quercetin and kaempferol in Kudingcha.Results The TLC showed that the test samples had the dots of the same color at the corresponding positions as the reference samples.The sample amounts of quercetin and kaempferol showed a good linear relationship with peak areas within 0.1－3.2μg and 0.01－0.32μg（quercetin r1＝0.999 9；kaempferol r2＝0.999 8）.The average recovery rates of quercetin and kaempferol were 102.34％and 101.24％，with relative standard deviations of 3.26％and 3.15％（n＝9）.Conclusion The TLC and RP－HPLC methods are simple，accurate，and repeatable and can be used for the quality analysis of Kudingcha aqueous extract.

Kudingcha；quality analysis；thin－layer chromatography；reversed－phase high－performance liquid chromatography

R284.1

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.028

2013－10－07）

胡順莉（1988－），女，碩士研究生

吳虹，hongw＠aliyun.com