丹參川芎有效成分配伍對(duì)缺氧損傷大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞的影響

管敏國，張宇燕，萬海同，周 鵬，楊 珍，楊潔紅

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所，浙江杭州 310053）

丹參川芎有效成分配伍對(duì)缺氧損傷大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞的影響

管敏國1，張宇燕2，萬海同2，周 鵬2，楊 珍1，楊潔紅1

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所，浙江杭州 310053）

目的 研究丹參川芎有效成分不同配伍對(duì)缺氧損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat brain microvascular endothelial cells，rBMECs）的影響，并找出較優(yōu)組合。方法 采用體外培養(yǎng)的rBMECs，并進(jìn)行兔抗鼠Ⅷ因子鑒定，建立體外細(xì)胞缺氧模型。對(duì)參芎有效成分丹參素（A）、丹參酮Ⅱa（B）、川芎嗪（C）、藁本內(nèi)酯（D）、阿魏酸（E），以3個(gè)劑量水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，另設(shè)正常組、模型組，觀察不同配伍對(duì)細(xì)胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響。采用正交方差分析、直觀綜合分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多指標(biāo)優(yōu)化。結(jié)果 與模型組比較，各配伍樣品均可提高SOD活性，降低LDH含量，減少細(xì)胞早期凋亡，抑制缺氧誘導(dǎo)的rBMECs發(fā)生G1／S期阻滯的作用。正交方差分析表明：A2B1C3D2E1為SOD的較優(yōu)組合，A3B1C1D2E3為LDH的較優(yōu)組合，A2B1C2D3E2為早期凋亡的較優(yōu)組合，A2B3C3D3E2為G1期的較優(yōu)組合，A2B3C3D2E2為S期的較優(yōu)組合；綜合分析結(jié)果顯示A2B1C1D3E2為多指標(biāo)的較優(yōu)組合。結(jié)論 丹參川芎有效成分不同配伍可在一定程度上保護(hù)缺氧對(duì)rBMEC的損傷，不同配伍作用方式的側(cè)重不同。

缺血性腦血管病；丹參；川芎；正交試驗(yàn)

缺血性腦血管病是指腦血管一時(shí)供血不足導(dǎo)致該供血區(qū)局灶性腦功能障礙，有較高的致殘率和病死率，改善缺血半暗帶區(qū)的血液供應(yīng)是治療關(guān)鍵。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有維持管壁通透性、抗凝、抗血栓形成、纖維溶解等廣泛生理功能，它作為組織與血液間的第一道屏障，是最先感受缺氧的細(xì)胞之一［1］，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是腦缺血損害的早期病變和基本動(dòng)因［2］，因此有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是預(yù)防和治療心腦血管疾病的關(guān)鍵。

丹參、川芎屬于活血化瘀藥物，在臨床治療心腦血管疾病中往往配伍使用。以往對(duì)丹參、川芎的化學(xué)成分和藥理活性已進(jìn)行了較多的基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的心腦血管方面活性［3－4］，但大都局限于單一成分研究。而中藥成分復(fù)雜，其特點(diǎn)是多靶點(diǎn)、多渠道、多成分，往往不是一個(gè)有效成分，而是有效成分之間的相互協(xié)同、相加甚至拮抗的共同效應(yīng)發(fā)揮療效，因此中藥應(yīng)作為一個(gè)整體進(jìn)行研究［5］。丹參主要有效部位為丹參水溶性和丹參脂溶性；川芎主要有效部位為川芎生物堿、川芎揮發(fā)油和川芎酚酸性。本實(shí)驗(yàn)從這5個(gè)主要有效部位中分別選取丹參素、丹參酮Ⅱa、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、阿魏酸5個(gè)有效成分，將這5個(gè)有效成分按正交試驗(yàn)方法組成配比不同的18個(gè)組合物，研究其不同配伍對(duì)缺氧損傷大鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞的影響，并進(jìn)行多指標(biāo)評(píng)價(jià)，選出較優(yōu)配伍組合。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD乳鼠10只，雌雄各半，1～3日齡，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2008－0016，上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 藥品與試劑 丹參素鈉：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20120311；丹參酮Ⅱa、鹽酸川芎嗪、阿魏酸：中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110766－200619、110817－201006、110773－200611；藁本內(nèi)酯：天津馬克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20130420。丹參酮Ⅱa、藁本內(nèi)酯分別用終濃度為0.04％、0.0025％的二甲基亞砜溶解（當(dāng)二甲基亞砜≤0.1％時(shí)，不引起細(xì)胞生物學(xué)性狀改變），4℃冷藏備用。M199培養(yǎng)基：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青公司；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、D－Hank液、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記山羊抗兔IgG、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、兔抗鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體、雙金雞納酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑：均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；FITC膜聯(lián)蛋白Ⅴ（An－

nexinⅤ，AV）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、PI／RNase staining緩沖液試劑盒：購自BD公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）：購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器設(shè)備 3111型CO2培養(yǎng)箱：Thermo Scientific公司；SW－CJ－2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZ5－2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；DMI4000B熒光倒置顯微鏡：德國徠卡公司；BD FACSCulibur流式細(xì)胞儀和Thermo Scientific Varioskan Flash酶標(biāo)儀：美國BD公司；自制缺氧罐；Eppendorf移液槍。

2 方法

2.1 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat brain microvascular endothelial cells，rBMECs）的培養(yǎng) 參考吳秀芹等［6］培養(yǎng)rBMECs的方法并加以改進(jìn)。取10只1～3日齡SD乳鼠，頸椎脫臼處死，浸入75％乙醇中1～3min后，沿背正中線剪開頭部皮膚，沿中線剪開顱骨并剝離，無菌取出大腦半球，立即放入含冷D－Hank液的培養(yǎng)皿里，用彎鑷小心去除腦干、小腦、海馬及大腦髓質(zhì)并仔細(xì)剝離大腦皮質(zhì)上軟腦膜和大血管，用D－Hank液清洗2次后，將大腦皮質(zhì)移入無菌的培養(yǎng)皿里，使用眼科剪將大腦皮質(zhì)剪碎成1mm3大小的組織碎塊，以上操作均在冰袋上進(jìn)行。將剪碎的組織用0.25％胰蛋白酶（含乙二胺二乙酸鈉）在37℃下消化20min，中途輕輕搖晃一次或不搖晃，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打均勻，依次通過80、200目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，收集200目上微血管段，離心（1 000r／min，10min），棄上清，在沉淀組織中加入適量0.1％Ⅱ型膠原酶，吹打均勻，37℃消化25min，10min搖晃1次，離心（1 000r／min，10min）。將下層沉淀用M199培養(yǎng)基漂洗1次，再次離心，沉淀用M199完全培養(yǎng)基懸浮，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12h后第一次換液，以后每隔2d換液1次，7～9d細(xì)胞生長成致密單層，出現(xiàn)“鋪路石”征象后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取2～3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用M199完全培養(yǎng)基將傳至第3代的rBMECs接種至6孔板上，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液1次，待細(xì)胞基本融合鋪滿后用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 rBMECs的鑒定 將細(xì)胞用37℃預(yù)熱的PBS漂洗，加入95％乙醇固定5min，PBS洗3遍，吸干，加稀釋10倍的兔抗鼠第Ⅷ因子抗體（陰性對(duì)照不加）和50μg／ml PI，以蓋住細(xì)胞為宜，37℃反應(yīng)30 min，用PBS洗去未結(jié)合的抗體，加羊抗兔IgG－FITC，37℃反應(yīng)30min，用PBS洗去未結(jié)合的抗體，甘油封片，于倒置顯微鏡下觀察。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)甲基噻唑基四唑拒染試驗(yàn)確定各個(gè)藥物的毒性劑量范圍。將丹參素鈉、丹參酮Ⅱa、鹽酸川芎嗪、藁本內(nèi)酯、阿魏酸的用藥濃度和配伍比例按L18（37）正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分組，共分為18組，簡稱給藥正交組。見表1、表2。

表1 L18（37）正交設(shè)計(jì)因素水平表

表2 參芎有效成分L18（37）正交設(shè)計(jì)因素水平表

2.4 分組、給藥與模型復(fù)制 將基本融合鋪滿后的rBMECs分為正常組、模型組和給藥正交組，每組3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)前各孔吸去培養(yǎng)基，PBS洗1遍，正常組加入M199完全培養(yǎng)基1ml，模型組加入無血清M199培養(yǎng)基1ml，給藥正交組加入含相應(yīng)藥物的無血清M199培養(yǎng)基1ml。正常組于37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h，其他各組放入密閉缺氧罐中，持續(xù)通入95％N2＋5％CO2的混合氣體，5min后用封口膜密封缺氧罐接口，置于37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)3h。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

2.5.1 SOD活性和LDH含量檢測(cè)：吸去各孔培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后離心收集細(xì)胞，在沉淀中加入1ml PBS，吹打均勻，再離心收集細(xì)胞沉淀，加入200μl PBS，吹打均勻，用超聲將細(xì)胞裂解，按試劑盒說明書方法測(cè)定SOD活性。收集各孔細(xì)胞上清液20μl，按試劑盒說明書操作，測(cè)440nm處吸光度（absorbance，A）值，計(jì)算LDH含量。

2.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)rBMECs早期凋亡及細(xì)胞

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD和Dunnet檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

周期：收集好細(xì)胞沉淀后，加AV結(jié)合緩沖液0.5 ml，吹打成細(xì)胞懸液，F(xiàn)ITC AV／PI雙染后，黑暗中反應(yīng)30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。

收集好細(xì)胞沉淀后，以70％乙醇，－20℃固定一夜，PBS和Stain緩沖液分別清洗細(xì)胞1次，PI染色30min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。呈正態(tài)分布的連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn)。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用一般線性模型的Univariate程序進(jìn)行正交方差分析。

3 結(jié)果

3.1 rBMECs鑒定 對(duì)用Ⅷ因子及二抗處理的細(xì)胞進(jìn)行掃描，可見細(xì)胞核出現(xiàn)黃色熒光，胞質(zhì)出現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間具有明顯的界限。而對(duì)照組只有細(xì)胞核顯示黃色熒光，胞質(zhì)不出現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間也沒有明顯的界限。結(jié)果表明所培養(yǎng)的細(xì)胞存在Ⅷ因子相關(guān)抗原，可認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞。見圖1。

3.2 對(duì)缺氧損傷的rBMECs形態(tài)的影響 正常組rBMECs外觀呈梭形，形態(tài)飽滿，輪廓清晰，細(xì)胞核圓，核膜清晰，整體呈鋪路石狀。模型組大部分細(xì)胞由原本貼壁生長狀態(tài)變?yōu)槭湛s變圓狀態(tài)，且間隙變大，有出現(xiàn)凋亡及壞死細(xì)胞。給藥正交組對(duì)rBMECs缺氧損傷顯示出不同程度的保護(hù)作用。

圖1 第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定（10×20倍）

3.3 對(duì)缺氧損傷的rBMECs中SOD、LDH的影響 與正常組相比，模型組SOD活性顯著降低，LDH釋放顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，1、2、3、4、6、8、9、13、14組SOD活性顯著升高（P＜0.05）；1、3、4、5、7、8、9、10、12、13、15、16、18組LDH釋放顯著降低（P＜0.05）。見表3。

3.4 對(duì)缺氧損傷的rBMECs早期凋亡的影響 與正常組比較，模型組rBMECs早期凋亡顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，1、2、4、5、6、7、9、10、11、13、14、17組細(xì)胞凋亡顯著減少（P＜0.05）。見表3。

3.5 對(duì)缺氧損傷的rBMECs細(xì)胞周期的影響 與正常組相比，模型組G1期rBMECs顯著增加（P＜0.05），S期和G2期rBMECs顯著減少（P＜0.05）。與模型組相比，2、3、4、5、6、8、9、10、14、15組G1期細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）；2、3、4、5、6、8、9、14組S期細(xì)胞及2、3、4、5、8、9、14、15組G2期細(xì)胞顯著增加（P＜0.05）。見表3。

表3 參芎有效成分配伍對(duì)缺氧損傷的rBMECs中SOD活性、LDH含量、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響（±s，n＝3）

表3 參芎有效成分配伍對(duì)缺氧損傷的rBMECs中SOD活性、LDH含量、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響（±s，n＝3）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，＊P＜0.05。

組別SOD／（U／mg）LDH／（U／L）凋亡率／％細(xì)胞周期／％ G1期S期G2期正常45.57±1.57 67.93±4.60 10.71±1.23 72.46±1.14 20.12±0.91 7.42±1.10模型33.09±1.01△168.47±3.15△41.58±2.45△89.11±0.91△8.32±0.22△2.57±0.82△1 39.87±1.51＊86.80±4.01＊30.33±0.86＊88.55±1.01 8.33±1.08 3.12±1.12 2 42.63±1.16＊166.87±2.50 23.62±1.76＊83.82±1.20＊10.46±1.19＊5.72±0.99＊3 39.29±2.19＊161.23±3.62＊42.60±2.41 75.61±0.93＊17.23±0.98＊7.16±0.34＊4 38.94±1.85＊111.26±4.07＊27.52±0.93＊75.19±0.84＊19.12±0.36＊5.69±0.76＊5 31.16±1.87 151.87±3.88＊29.44±1.44＊79.56±1.23＊14.46±1.19＊5.98±1.25＊6 38.21±1.13＊171.27±3.73 38.64±0.64＊80.49±0.94＊17.58±1.47＊1.93±1.30 7 32.59±1.35 92.58±2.95＊32.38±0.87＊87.80±1.03 8.48±0.79 3.72±0.89 8 40.45±1.34＊158.33±3.43＊42.78±2.70 77.17±0.96＊16.57±1.25＊6.26±0.98＊9 38.98±1.79＊87.34±3.16＊26.53±1.51＊77.52±1.02＊14.51±1.28＊7.97±1.40＊10 34.49±0.77 131.50±2.84＊23.90±1.18＊86.75±1.09＊9.08±0.27 4.17±1.03 11 35.29±1.31 169.27±2.64 38.64±0.64＊88.34±0.74 8.28±0.37 3.38±0.89 12 32.81±1.53 97.40±3.17＊41.98±1.53 89.43±1.33 8.17±0.35 2.40±1.29 13 44.87±1.81＊131.83±3.27＊27.63±0.86＊88.16±0.84 9.63±0.86 2.21±0.67 14 37.24±1.12＊171.07±3.65 33.61±1.99＊81.57±1.48＊11.89±0.51＊6.54±1.67＊15 34.65±1.24 101.00±2.91＊40.37±1.42 83.34±1.09＊10.30±0.32 6.36±1.39＊16 34.51±1.49 102.70±2.91＊41.46±1.50 88.81±1.07 8.81±1.17 2.38±1.35 17 33.03±1.25 168.00±2.39 37.54±1.68＊89.14±1.02 8.50±1.13 2.36±1.37 18 32.55±1.42 162.20±3.25＊40.39±1.49 89.64±1.15 8.30±0.99 2.06±0.31

3.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.6.1 正交方差分析：方差分析表明，因素E對(duì)SOD有顯著影響（P＜0.05），其強(qiáng)弱順序?yàn)镋＞A＞D＞B＞C；因素B、C、D對(duì)LDH有顯著影響（P＜0.05），其強(qiáng)弱順序?yàn)锽＞C＞D＞A＞E；因素A、B、C、D、E對(duì)早期凋亡都有顯著影響（P＜0.05），其強(qiáng)弱順序?yàn)镋＞B＞D＞C＞A；因素A、C、D對(duì)G1期有顯著影響（P＜0.05），其強(qiáng)弱順序?yàn)镃＞A＞D＞B＞E；因素A、C對(duì)S期有顯著影響（P＜0.05），其強(qiáng)弱順序?yàn)锳＞C＞B＞D＞E。結(jié)果見表4。

表4 正交設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

3.6.2 正交直觀分析：由表5可知，在SOD指標(biāo)中，A2B1C3D2E1為SOD的較優(yōu)組合；依次類推，A3B1C1D2E3為LDH的較優(yōu)組合；A2B1C2D3E2為早期凋亡的較優(yōu)組合；A2B3C3D3E2為G1期的較優(yōu)組合；A2B3C3D2E2為S期的較優(yōu)組合。

3.6.3 多指標(biāo)較優(yōu)組合分析：綜合表4、表5分析，在較優(yōu)組合中，因素A中水平2出現(xiàn)4次，水平3出現(xiàn)1次，出現(xiàn)水平3的在LDH指標(biāo)中，而因素A對(duì)LDH無顯著影響，故在最優(yōu)組合選擇中選A2；因素B中水平3對(duì)G1期、S期無顯著影響，故選B1；因素C中水平3對(duì)SOD無顯著影響，在早期凋亡中，水平1與水平2無顯著差異，在G1期、S期中，水平1與水平3均無顯著差異，故選C1；因素D中水平2對(duì)SOD、S期無顯著影響，因指標(biāo)凋亡比指標(biāo)LDH重要，故選D3；因素E中水平1對(duì)SOD無顯著影響，且因素E對(duì)LDH無顯著影響，故選E2；綜上所述，最終較優(yōu)組合應(yīng)為A2B1C1D3E2。

表5 正交設(shè)計(jì)直觀分析結(jié)果（±s，n＝3）

表5 正交設(shè)計(jì)直觀分析結(jié)果（±s，n＝3）

注：與水平1比較，△P＜0.05；與水平2比較，＃P＜0.05。

因素水平SOD／（U／mg）LDH／（U／L）凋亡率／％細(xì)胞周期／％ G1期S期A 1 37.40 135.57 33.51 85.42 10.26 2 37.51 139.72 32.87 81.39△13.83△3 35.35 128.52 36.85△＃85.01＃10.86＃B 1 37.55 109.44 30.54 85.88 10.57 2 36.63 164.18△34.27△83.27 11.69 3 36.08 130.18△＃82.67△12.68 C 1 36.79 120.67 33.49 83.68 11.51 2 36.10 133.79 32.58 86.40 9.92 3 37.36 149.35△＃38.42△＃81.73＃13.53＃D 1 35.96 142.19 35.67 86.07 10.48 2 37.33 123.04△36.29 82.96 12.24 3 36.97 138.57＃31.27△＃37.17△＃82.79△12.23 E 1 38.21 135.66 36.48 85.49 11.46 2 37.47 138.37 29.26△82.42△12.23 3 34.58△83.91 11.26＃129.77 37.48＃

4 討論

近年來，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）在各種心腦血管病中的作用日益受到重視，它是血腦屏障的重要組成部分，在維持血腦屏障的完整、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和保持正常腦血流中發(fā)揮重要作用［7］。

缺氧能促使BMECs產(chǎn)生大量的活性氧，而自由基、活性氧、脂質(zhì)過氧化物等均可引起B(yǎng)MECs損傷［8］。LDH是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志之一，當(dāng)細(xì)胞缺血缺氧時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)有氧代謝減少、無氧代謝增加，使胞內(nèi)LDH產(chǎn)生增加，其漏出也相應(yīng)增加。缺氧使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的升高，進(jìn)而活化Ca2＋、Mg2＋依賴性核酸內(nèi)切酶，使核染色質(zhì)DNA降解成單個(gè)或寡核苷酸小體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］，而內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞凋亡是維持血管完整和新生血管重建的關(guān)鍵［1］。

參芎有效成分配伍能提高SOD的活性，降低LDH的量，減少細(xì)胞早期凋亡，抑制缺氧誘導(dǎo)的rBMECs發(fā)生G1／S期阻滯從而發(fā)揮保護(hù)作用。筆者也發(fā)現(xiàn)并不是每一組配伍對(duì)這些指標(biāo)的影響都是一致的，往往同一個(gè)組對(duì)這個(gè)指標(biāo)有明顯保護(hù)作用，而對(duì)另一指標(biāo)作用不明顯，這可能因?yàn)楦鱾€(gè)藥物作用的靶點(diǎn)不同，也可能因?yàn)樗幬镩g存在拮抗作用，這就要求研究者要進(jìn)行合理的配伍以使藥物的功效發(fā)揮最大化，這就得考慮每個(gè)藥物的劑量和各個(gè)藥物的配伍比例問題，要有中醫(yī)“君臣佐使”的思想。經(jīng)過多指標(biāo)的綜合分析，筆者找到一個(gè)較優(yōu)配伍組合A2B1C1D3E2，即0.010mg／ml丹參素鈉、0.000 5 mg／ml丹參酮Ⅱa、0.015mg／ml鹽酸川芎嗪、0.010mg／ml藁本內(nèi)酯、0.005mg／ml阿魏酸的配伍最優(yōu)。該組合與第4組類似，只是藁本內(nèi)酯由水平2變成了水平3，而第4組對(duì)每一個(gè)指標(biāo)的作用

都是積極的，與模型組比較都有顯著差異（P＜0.05），這也間接反映這個(gè)較優(yōu)組合的可靠性，但還應(yīng)做進(jìn)一步驗(yàn)證。筆者認(rèn)為在做這種組分配伍的實(shí)驗(yàn)研究中，結(jié)合中醫(yī)的相關(guān)理論，也許會(huì)少走彎路，希望這種實(shí)驗(yàn)思路和方法對(duì)中藥的標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化及配伍規(guī)律提供有益借鑒。

［1］吉瑞瑞，李付英，張雪靜，等.淫羊藿苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（6）：525－530.

［2］羅玉敏，秦震.內(nèi)皮細(xì)胞與腦缺血［J］.國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊(cè)，1998，6（5）：271－273.

［3］劉娟，劉穎.丹參藥理活性成分研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（7）：15－17.

［4］舒冰，周重建，馬迎輝，等.中藥川芎中有效成分的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（9）：1043－1047.

［5］黃勇，齊曉嵐，官志忠，等.燈盞細(xì)辛組分對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用的譜效關(guān)系研究［J］.中國中藥雜志，2010，35（8）：1038－1041.

［6］吳秀芹，梅曉云，吳顥昕，等.大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（3）：187－189.

［7］胡京紅，司銀楚，洪慶濤，等.天麻素對(duì)體外模擬腦缺血損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（2）：124－126.

［8］林蓉，劉俊田，甘偉杰，等.川芎嗪對(duì)缺氧缺糖狀態(tài)下培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV－304的影響［J］.中國中藥雜志，2004，29（5）：462－464.

［9］周鵬，周蕙芬，何昱，等.丹紅注射液對(duì)乳鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用［J］.中草藥，2013，44（19）：2727－2731.

Effects of Different Doses of Active Ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong on Rat Brain Microvascular Endothelial Cells during Hypoxic Injury

GUAN Min－guo1，ZHANG Yu－yan2，WAN Hai－tong2，ZHOU Peng2，YANG Zhen1，YANG Jie－h(huán)ong2
（1.School of Basic Medical Sciences，Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Hangzhou 310053，China；2.Institute of Cardio－Cerebrovascular Disease，Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Hangzhou 310053，China）

Objective To investigate the effects of different doses of active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong on rat brain microvascular endothelial cells（rBMECs）during hypoxic injury and to determine the preferred dose combinations.Methods rBMECs were cultured in vitro and were identified with rabbit－anti－rat factorⅧantibody.The rBMECs were divided into normal group，model group，and test groups.An in vitro cell model of hypoxia was induced in the model group and test groups.The test groups were treated with different doses of tanshinol（A），tanshinoneⅡA（B），ligustrazine（C），ligustilide（D），and ferulic acid（E）.An orthogonal test was performed to investigate the effects of these active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong（each at three dose levels）on superoxide dismutase（SOD）activity in cells，lactate dehydrogenase（LDH）content in cell supernatant，cell apoptosis rate，and cell cycle.Orthogonal analysis of variance and direct comprehensive analysis were used to optimize the dose combination for these indices.Results Compared with the model group，the test groups had increased SOD activity，decreased LDH content，reduced early apoptosis，and inhibited G1／S arrest induced by hypoxia.The orthogonal analysis of variance showed that A2B1C3D2E1was the preferred dose combination for SOD，A3B1C1D2E3was the preferred dose combination for LDH，A2B1C2D3E2was the preferred dose combination for early apoptosis，A2B3C3D3E2was the preferred dose combination for G1phase，and A2B3C3D2E2was the preferred dose combination for S phase.The comprehensive analysis showed that A2B1C1D3E2was the preferred dose for multiple indices.Conclusion Different doses of active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong can reduce the hypoxic injury of rBMECs，and their action mechanism varies in different dose combinations.

ischemic cerebrovascular disease；Salvia miltiorrhiza；Rhizoma Ligustici Chuanxiong；orthogonal test

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.026

2013－12－19）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81274176，81202636，81173647）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LR12H27001）；浙江省中醫(yī)藥（中西醫(yī)結(jié)合）重點(diǎn)學(xué)科（2012－XK－A06）

管敏國（1985－），男，碩士研究生

楊潔紅，yjhong＠zxmu.edu.cn