肝豆靈對銅負(fù)荷肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡的影響

張 娟，謝道俊，韓 輝，沈 斌，鮑遠(yuǎn)程，童建兵，周 磊，楊 波，丁偉軍

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽合肥 230031；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢 430065）

肝豆靈對銅負(fù)荷肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡的影響

張 娟1，謝道俊1，韓 輝1，沈 斌2，鮑遠(yuǎn)程1，童建兵1，周 磊1，楊 波1，丁偉軍1

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽合肥 230031；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢 430065）

目的 觀察肝豆靈對銅負(fù)荷肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）凋亡的影響，探討肝豆靈防治Wilson病肝纖維化的作用機(jī)制。方法 將75只大鼠分成空白組、模型組、肝豆靈組、青霉胺組及肝豆靈＋青霉胺組，采用喂食硫酸銅飲食復(fù)制銅負(fù)荷大鼠模型，采用TUNEL法檢測HSC的凋亡。結(jié)果 模型組可見大量HSC增生；與模型組比較，各治療組HSC數(shù)量顯著降低（P＜0.01），HSC凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；肝豆靈＋青霉胺組AI顯著高于肝豆靈組和青霉胺組（P＜0.01）。討論 肝豆靈可促進(jìn)銅負(fù)荷大鼠HSC的凋亡，其與青霉胺聯(lián)合用藥的作用更顯著。

肝豆?fàn)詈俗冃?；肝纖維化；銅負(fù)荷；肝星狀細(xì)胞；肝豆靈；青霉胺

Wilson?。╓ilson's disease，WD）作為銅代謝障礙性疾病，其發(fā)生肝臟病變的根本原因是肝細(xì)胞中ATP7B酶功能缺陷，不能將多余的銅離子從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)出去，造成游離銅在肝組織內(nèi)緩慢蓄積。肝臟是銅代謝的中心器官，過度沉積的銅損害肝細(xì)胞，引起肝細(xì)胞變性壞死、炎性改變及肝纖維化，臨床表現(xiàn)為活動性壞死后肝硬化或代償性肝硬變。研究證實(shí)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活是肝纖維化發(fā)生的主要環(huán)節(jié)，激活的HSC大量增殖，發(fā)生表型改變、分泌過多的細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）沉積于肝臟是肝纖維化形成的關(guān)鍵［1］。WD肝纖維化引起的肝功能衰竭通常是WD患者死亡的主要原因。因此，重視對WD肝纖維化的早期干預(yù)，對于改善WD患者的肝功能及預(yù)后都具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)采用肝豆靈治療WD大鼠肝纖維化，旨在研究此方對HSC凋亡的影響，以探討其治療WD肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 實(shí)驗(yàn)用清潔級Wistar大鼠75只，雌雄各半，月齡均為3個月，平均體質(zhì)量（200±20）g，購于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2008－0004。動物房為普通級飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要儀器 切片機(jī)（Leica RM2135）：德國；切片漂烘儀（科力飛QP－B）：安徽合肥電子研究所；石蠟包埋機(jī)（亞光YB－7B）：湖北孝感；圖像采集及圖像分析系統(tǒng)：美國Bio－Rad生物儀器設(shè)備公司。

1.3 試劑和藥物 二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）：北京中山生物技術(shù)公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）－mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒：美國Roche公司；硫酸銅：天津巴斯夫化工公司；肝豆靈成藥（院藥制字Z20050071）：每片0.3g，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供；陽性藥物青霉胺（國藥準(zhǔn)字H31022286）：每片0.125g，上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 模型復(fù)制和分組 75只大鼠隨機(jī)分為5組，每組15只，分別為空白對照組、模型對照組、肝豆靈組、肝豆靈加青霉胺組、青霉胺組。從實(shí)驗(yàn)第1天開始，除空白對照組予以普通飼料，其余4組均參照文獻(xiàn)［2］復(fù)制銅負(fù)荷大鼠模型，即給予含硫酸銅1g／kg的飼料和0.185％硫酸銅的水，飼養(yǎng)12周。各組大鼠每天每只進(jìn)食相等，并自由飲水。從第7周第1天開始各治療組大鼠均予以相應(yīng)藥物灌胃。肝豆靈組大鼠按受肝豆靈0.486g／kg（相當(dāng)于成人臨床用量的6.3倍）灌胃，肝豆靈加青霉胺組大鼠接受肝豆靈0.486g／kg和青霉胺0.09g／kg（相當(dāng)于成人臨床用量的6.3倍）灌胃，青霉胺組大鼠僅接受青霉胺0.09g／kg灌胃，空白組和模型組大鼠接受等容量生理鹽水灌胃。均每日1次，共6周。在第13周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，共死亡大鼠26只，剩余49只，各組動物禁食12h，在2％戊巴比妥鈉腹腔麻醉下，分別留取血清、肝組織標(biāo)本。

2.2 指標(biāo)檢測 采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果判定：胞質(zhì)棕黃色的細(xì)胞為HSC，凋亡的HSC為胞質(zhì)、胞核均呈棕黃色的梭型細(xì)胞。隨機(jī)取5個

不同高倍視野觀察，計(jì)數(shù)胞質(zhì)為棕黃色的HSC的數(shù)量和胞質(zhì)、胞核均呈棕黃色的梭型凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比，取5個視野的平均數(shù)，得到凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。AI＝凋亡細(xì)胞數(shù)／HSC數(shù)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)型變量用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。采用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)比較多組間HSC中位數(shù)，采用Mann－Whitney檢驗(yàn)比較兩組間HSC中位數(shù)；采用單因素方差分析比較5組間AI均數(shù)，采用Dunnett's T3檢驗(yàn)比較兩組間AI均數(shù)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

空白組未見HSC表達(dá)，模型組可見大量HSC表達(dá)，各治療組可見棕黃色、梭形、凋亡的HSC，增生的HSC數(shù)量較模型組明顯減少。見圖1。

與空白組比較，模型組HSC數(shù)量及AI顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組HSC數(shù)量顯著降低（P＜0.01），AI顯著增高（P＜0.01）；其中肝豆靈＋青霉胺組AI顯著高于肝豆靈組和青霉胺組（P＜0.01）。見表1。

注：紅色箭頭示凋亡的HSC。圖1 各組HSC細(xì)胞凋亡情況比較

4 討論

肝臟是動物體內(nèi)儲存銅的重要器官，同時也是進(jìn)行銅代謝的重要場所，WD患者自出生后銅就開始不斷地在肝臟內(nèi)蓄積，所以即使是青少年WD患者，其肝臟銅的積蓄量也往往超過正常人的10倍以上［3］。研究認(rèn)為在WD的早期（無癥狀期），肝臟內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)線粒體明顯形態(tài)異常。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)銅過載能誘發(fā)多種動物肝損害，當(dāng)蓄積超過各種細(xì)胞器含銅蛋白質(zhì)負(fù)載能力時，就會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，引起脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽耗竭、線粒體損傷、溶酶體破裂，引起肝硬化。

表1 各組HSC數(shù)、AI比較（±s）

表1 各組HSC數(shù)、AI比較（±s）

注：a.中位數(shù)（四分位距）為101.50（29.72）；與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與肝豆靈＋青霉胺組比較，△△P＜0.01。

組 別n HSC細(xì)胞數(shù)AI空 白8 4.37±1.85 0.03±0.02模 型10 96.00±22.95＊＊a0.21±0.10＊＊肝豆靈＋青霉胺11 76.18±16.31＃＃0.56±0.04＃＃肝豆靈10 57.80±10.76＃?！鳌?.41±0.06＃?！鳌髑嗝拱?0 63.00±15.60＃＃0.43±0.05＃＃△△

蓄積的銅本身毒性很強(qiáng)，并且可作為氧化物前體促進(jìn)自由基和有害的脂質(zhì)及蛋白氧化物形成。銅通過氧自由基活化HSC，導(dǎo)致肝損傷修復(fù)時ECM的合成與降解不平衡，特別是后期ECM降解減少是導(dǎo)致WD發(fā)生肝纖維化或肝硬化的主要機(jī)制。HSC的激活和增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，因而采用不同途徑減少HSC的增殖并加速HSC的凋亡成為肝纖維化治療的切入點(diǎn)。

中醫(yī)學(xué)無肝纖維化病名，依據(jù)其肝硬化、腹水等表現(xiàn)，可屬于“癥瘕”“瘀血”“積聚”“臌脹”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為先天不足、肝脾腎虧虛是引起本病的根本原因，情志失調(diào)、飲食不節(jié)、勞倦內(nèi)傷等可誘發(fā)和加重本病。銅毒入里，臟腑功能失調(diào)致運(yùn)化失常，蓄積體內(nèi)，經(jīng)過量變到質(zhì)變，復(fù)感毒邪，外受內(nèi)化而使銅毒加重。發(fā)病以青少年多見，多起病緩慢，逐漸加重。早期以氣血虧虛、肝脾腎不足為主，臨床期多以濕熱蘊(yùn)結(jié)、痰瘀阻絡(luò)為主要表現(xiàn)。本病為本虛標(biāo)實(shí)證，早期多虛，中后期多實(shí)，虛實(shí)夾雜。毒邪為害，銅毒、濕熱、痰濁、瘀血為標(biāo)，而變生諸癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證實(shí)WD患者的銅中毒，主要是內(nèi)在遺傳缺陷，即先天稟賦不足，致機(jī)體陰陽失和，臟腑功能失調(diào)和氣血運(yùn)行不暢，導(dǎo)致膽汁不泌，銅毒不泄，蘊(yùn)積體內(nèi)而化生銅毒。WD肝纖維化因銅濁毒邪蓄積于肝，致肝之疏泄失常，膽汁排泄不暢，濕熱銅毒內(nèi)聚，外溢肌膚而為病，痰濁阻礙氣機(jī)，血行不暢，痰濁與瘀血相結(jié)，則成“積聚”，毒邪日久不去，留著體內(nèi)，則可損傷絡(luò)脈。故WD肝纖維化的主要病機(jī)為銅毒內(nèi)蘊(yùn)、痰瘀阻絡(luò)。

通腑利濕、化瘀散結(jié)的中藥專方肝豆靈是針對以上病機(jī)研制的，該方由大黃、丹參、金錢草、黃連、姜黃、莪術(shù)等藥物組成。肝豆靈注重標(biāo)本同治，不僅以通腑利濕之法促進(jìn)銅毒的排出，同時佐以化瘀散

結(jié)法以治“積聚”“癥瘕”。前期研究［4］發(fā)現(xiàn)肝豆靈可干預(yù)銅負(fù)荷大鼠肝纖維化的作用。

研究表明，大黃素通過多種途徑發(fā)揮抗肝纖維化作用。體外實(shí)驗(yàn)顯示大黃素可通過抑制蛋白酪氨酸激酶活性而發(fā)揮抑制HSC增殖的作用［5］。大黃素能濃度依賴地抑制細(xì)胞內(nèi)膠原合成，降低膠原mRNA表達(dá)，促使ECM降解［6］。黃連具有抗氧化的作用，同時抑制膠原生成，促進(jìn)病理沉積膠原的降解。黃連通過以上途徑而發(fā)揮抑制HSC增殖和誘導(dǎo)HSC凋亡的作用。李欣等［7］研究發(fā)現(xiàn)，丹參素能明顯抑制HSC的增殖活性和膠原表達(dá)，改善實(shí)驗(yàn)動物肝臟纖維化程度。賴文芳等［8］研究結(jié)果提示，丹參具有改善肝臟血液循環(huán)，抑制膠原生成，促進(jìn)膠原降解，干預(yù)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，抑制HSC活化的作用。丹參酸B能夠通過抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化，抑制HSC的增殖及活化。鄭元義等［9］研究結(jié)果提示，丹參素通過明顯抑制HSC增殖而防治大鼠免疫性肝纖維化，抑制轉(zhuǎn)化生長因子β、過氧化氫等誘導(dǎo)的HSC增殖，促其調(diào)亡。欒希英等［10］研究結(jié)果提示，三棱、莪術(shù)可降低肝纖維化大鼠白介素－1、白介素－6、腫瘤壞死因子－α的產(chǎn)生，抑制HSC的激活。李娟等［11］研究結(jié)果提示，三棱、莪術(shù)聯(lián)用可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl－2表達(dá)，而起到抗肝纖維化作用。何雅軍等［12］研究結(jié)果提示，姜黃素可降低活化的HSC數(shù)量，增加HSC凋亡。

本研究表明，具有通腑利濕、化瘀散結(jié)作用的肝豆靈可促進(jìn)HSC的凋亡，且以肝豆靈和青霉胺聯(lián)合用藥的效果為優(yōu)，這可能是肝豆靈防治WD肝纖維化的作用機(jī)制之一。

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Effect of Gandouling on Apoptosis of Hepatic Stellate Cells in Copper－Overloaded Rats with Hepatic Fibrosis

ZHANG Juan1，XIE Dao－jun1，HAN Hui1，SHEN Bin2，BAO Yuan－cheng1，TONG Jian－bing1，ZHOU Lei1，YANG Bo1，DING Wei－jun1
（1.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China；2.Hubei University of Chinese Medicine，Hubei Wuhan 430065，China）

Objective To observe the effect of Gandouling on the apoptosis of hepatic stellate cells（HSCs）in copper－overloaded rats with hepatic fibrosis and to investigate the action mechanism of Gandouling in the prevention and treatment of hepatic fibrosis in Wilson's disease.Methods Seventy－five rats were divided into blank group，model group，Gandouling group，penicillamine group，and Gandouling plus penicillamine group.All rats except those in blank group were given copper sulfate－containing feed to induce a copper－overloaded

Wilson's disease；hepatic fibrosis；copper overload；hepatic stellate cell；Gandouling；penicillamine

R575.2＋4

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.023

2013－07－07）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202692）；安徽高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2012Z223）

張娟（1975－），女，博士，主治醫(yī)師

rat model.The apoptosis of HSCs was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nick end labeling.Results The model group had extensive proliferation of HSCs.Compared with the model group，all treatment groups had significantly reduced numbers of HSCs（P＜0.01）and significantly increased apoptotic indices（AIs）（P＜0.01）；the Gandouling plus penicillamine group had a significantly higher AI than the Gandouling group and penicillamine group（P＜0.01）.Conclusion Gandouling can promote the apoptosis of HSCs in copper－overloaded rats，and it has better efficacy when used in combination with penicillamine.