干細胞向膽管上皮細胞誘導分化的研究進展

顏 譚，祝旭龍，李建輝(綜述)，呂 毅(審校)

(1.延安大學醫(yī)學院，陜西 延安716000； 2.陜西省人民醫(yī)院腫瘤外科，西安 710068；3.西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061)

干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生為各種組織細胞的潛能。目前，雖然人們對干細胞誘導分化的研究日趨成熟，但在體外誘導干細胞向膽管上皮細胞分化方面還存在一些不足，其研究大都停留在細胞轉(zhuǎn)化層面，并未能深入到基因調(diào)控水平，且分化機制還不完全明確，有待于更進一步的研究。現(xiàn)就誘導干細胞向膽管細胞及肝細胞誘導分化的研究進展予以綜述。

1 干細胞向膽管細胞分化潛能

干細胞種類繁多，其既能自我更新，又能被誘導分化[1]。不同種類的干細胞經(jīng)誘導刺激可向膽管上皮細胞分化[2]。肝前體細胞，如肝原細胞、肝卵原細胞可誘導分化為膽管上皮細胞，卵圓細胞被認為是肝干細胞，這是因為它具有向肝細胞和膽管上皮細胞分化的雙潛能性，并在移植后能夠重建肝臟。李鑄等[3]發(fā)現(xiàn)，肝原細胞既可以向肝細胞分化又可以向膽管細胞分化，其分化方向主要取決于細胞的外在刺激因素。Chen等[4]從鼠肝中提取了成纖維樣肝前體細胞；而Malh?o等[5]發(fā)現(xiàn)，肝前體細胞具有向膽管上皮細胞分化的潛能。另外，Dollé等[6]根據(jù)肝內(nèi)細胞乙醛脫氫酶活性的高低分離肝原細胞，經(jīng)過誘導可以表達肝細胞及膽管上皮細胞標志物。不同組織器官來源的間充質(zhì)干細胞可誘導分化為膽管上皮細胞。Manohar等[7]發(fā)現(xiàn)，在成年鼠膽囊提取到的間充質(zhì)干細胞，經(jīng)誘導分化后可表達膽管細胞的表面標志物，并出現(xiàn)膽管樣結(jié)構及囊性結(jié)構。人工誘導的多能干細胞在適當?shù)臈l件下可表達相應的膽管上皮細胞標志物。

2 干細胞向膽管上皮細胞誘導分化的條件

目前，在體外誘導干細胞向膽管上皮細胞分化的方案比較少。誘導干細胞向肝細胞分化時，可表現(xiàn)出膽管的一些標志物，如角化蛋白19(cytokeratin-19，CK19)、γ谷酰胺轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)等；誘導干細胞向肝或膽管上皮細胞分化多采用化學藥物刺激、與組織或細胞共培養(yǎng)、條件培養(yǎng)液刺激等方式，現(xiàn)多采用條件培養(yǎng)液刺激[8]。不同種屬的干細胞誘導分化濃度可不同，向肝細胞轉(zhuǎn)化主要依靠肝細胞生長因子(hepatocyte growth factors，HGF)、成纖維生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GF)、抑瘤素等[9]，向膽管轉(zhuǎn)化時多采用HGF、表皮生長因子(epidermal growth factors，EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)等[10]，刺激21 d左右即可完成轉(zhuǎn)化。

2.1誘導分化刺激因子 目前所采用的刺激因子主要有HGF、TGF、FGF、EGF、角化生長因子，干細胞生長因子等；另外還可添加丙戊酸鈉、辛二酰苯胺異羥肟酸、曲古抑菌素、丁酸鈉等組蛋白去乙?；敢种苿蜻M行表觀修飾，在基因?qū)用嬲{(diào)控干細胞向肝或膽管細胞的誘導分化；添加抑瘤素、地塞米松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸等可促進肝或膽管細胞成熟。如采用丙戊酸鈉與酸性成纖維細胞生長因子聯(lián)合刺激胚胎干細胞方案[11]，亞油酸、地塞米松、維生素C、EGF、基膜、HGF、FGF4聯(lián)合刺激人、小鼠及大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞方案，EGF、HGF、FGF2、尼克酰胺、抑瘤素聯(lián)合刺激人脂肪組織間充質(zhì)干細胞方案等[12]。

2.2誘導分化刺激因子的水平 不同種屬的干細胞誘導方案不同。國內(nèi)最新發(fā)現(xiàn)，采用10 g/L HGF、10 g/L EGF可將SD大鼠的骨髓間充質(zhì)細胞誘導分化為膽管上皮樣細胞，其是目前采用的刺激因子誘導分化方案中濃度最大的[13]。Zhou等[14]分四步將小鼠胚胎干細胞誘導分化成肝細胞或膽管細胞，肝祖細胞誘導分化成膽管樣細胞時，采用的是100 μg/L HGF、50 μg/L EGF，誘導分化2 d即可發(fā)現(xiàn)膽管樣結(jié)構，并可持續(xù)存在5 d。Dong等[15]采用1 mmol/L的丙戊酸鈉及10 μg/L HGF將少數(shù)的胚胎干細胞誘導分化成肝祖細胞后，再采用10 μg/L HGF、10 μmol/L地塞米松誘導分化30 d即可見到膽管樣結(jié)構，這可能是誘導干細胞向膽管細胞分化所采用的誘導因子濃度最小的一種刺激方案。

2.3誘導分化刺激因子步驟 干細胞向肝膽管細胞誘導分化的過程一般分為3個步驟：抑制干細胞增殖并誘導其轉(zhuǎn)向內(nèi)胚層、向肝原細胞及肝膽管細胞轉(zhuǎn)化，或按照胚胎發(fā)育過程，添加誘導因子誘導干細胞逐步分化成肝細胞或膽管上皮細胞。Nakamura等[16]采用人多能干細胞經(jīng)向內(nèi)胚層誘導、肝原始細胞形成及分化成熟肝細胞或膽管細胞3個階段誘導分化，而后檢測到肝或膽管細胞表達的特異性標志物，如α胎蛋白、白蛋白及細胞色素P450等；另外，在第二個階段如采用向膽管誘導分化方案，可以檢測到膽管標志物。Roelandt等[17]將胚胎干細胞按胚胎細胞發(fā)育過程逐步添加激活素A、Wnt3α(經(jīng)Nodal/Crip通路和β聯(lián)蛋白通路促使干細胞向原條、內(nèi)胚層方向分化)、FGF(主要是由橫膈或心臟間充質(zhì)細胞分泌，促使原條、內(nèi)胚層向肝芽方向生長)、HGF及卵泡抑素(促使肝芽向成熟細胞生長)，而后檢測到成熟細胞的標志物。Zhou等[11]先采用丁酸鈉抑制組蛋白去乙酰化酶干擾干細胞DNA與組蛋白結(jié)合，促進基因轉(zhuǎn)錄，然后與FGF聯(lián)合刺激胚胎干細胞直接向肝樣細胞分化，并使其成熟，該過程僅需10 d左右即可檢測到成熟的肝細胞標志物。

3 干細胞向膽管上皮細胞誘導分化的機制

膽管細胞的誘導分化機制還尚不明朗，通過對胚胎發(fā)育過程的研究發(fā)現(xiàn)，膽管細胞的分化過程主要與Wnt/β聯(lián)蛋白、Notch及TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路有關[18]。Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路在肝臟胚胎發(fā)育和控制肝母細胞分化方面起著關鍵作用。Notch信號通路參與調(diào)控膽管形態(tài)的發(fā)生和(或)膽管細胞存活，其也是膽汁網(wǎng)絡形態(tài)發(fā)生和增殖擴張所需的。TGF-β通路是最早發(fā)現(xiàn)的膽管細胞信號通路，其能促進膽管細胞分化和管狀結(jié)構形成，在該分化過程中抑制TGF-β的細胞因子表達，可阻止干細胞向膽管細胞分化。

4 膽管細胞的鑒定

細胞的鑒定主要是通過細胞的形態(tài)和細胞表面標志物，膽管上皮細胞的標志物有：Y染色體性別決定區(qū)域9，骨橋蛋白、肝細胞核因子1β、整合素β4、CK7、CK19、GGT、神經(jīng)細胞黏附因子、人體上皮細胞抗原、糖蛋白34、小分子RNA等。其中，CK19及神經(jīng)細胞黏附分子的表達提示該細胞具有向膽管細胞分化的潛能，在細胞成熟前表達量達最高水平。Raynaud等[18]研究發(fā)現(xiàn)，一些微RNA(micro RNA，miRNA)如miRNA-38、miRNA-30a以及 miRNA-30c在膽管細胞中特異表達，可用于膽管上皮細胞的檢測；同時還發(fā)現(xiàn)抑制膽管形成的標志：轉(zhuǎn)錄因子3、叉頭轉(zhuǎn)錄因子A1(forkhead box，F(xiàn)oxA1)、FoxA2、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBPα)等，其中，轉(zhuǎn)錄因子3抑制膽管上皮細胞分化、促進肝細胞分化，F(xiàn)oxA1、FoxA2抑制膽管細胞增殖，C/EBPα通過抑制肝細胞核因子6和肝細胞核因子1的表達而抑制膽管分化，而且肝細胞核因子6與C/EBP間可能在調(diào)節(jié)膽管細胞分化方面存在上下調(diào)控或階段依賴性關系。

5 誘導分化的意義及問題

干細胞誘導分化成膽管細胞可用于慢性、退行性、炎性及自身免疫性膽管病的治療及研究[19]。危及生命的急性或慢性移植物抗宿主肝膽管疾病應用常規(guī)治療無效時，應用骨髓間充質(zhì)干細胞卻能得到很好的治療效果，而且采用分化的干細胞在治療膽管疾病時會更穩(wěn)定、更安全。目前，干細胞向肝膽管細胞誘導轉(zhuǎn)化方式逐漸增多，且過程簡單化，已深入到基因調(diào)控層面，分化的條件、機制、通道逐步明確，轉(zhuǎn)化有效性和一致性不斷提高。但目前干細胞在向膽管上皮細胞誘導分化方面還存在一些技術性難題，需要做進一步的研究[20]。

6 小 結(jié)

干細胞來源豐富、取材方便，且容易被分離純化，更能被誘導分化。研究發(fā)現(xiàn)，多種干細胞可按照抑制細胞增殖并誘導其轉(zhuǎn)向內(nèi)胚層、再向肝原細胞及肝膽管細胞轉(zhuǎn)化的步驟或按照胚胎發(fā)育過程逐步添加一定種類及適當劑量的刺激因子，誘導其向膽管樣細胞分化并逐步表達膽管細胞的表面標志物[14]。目前，分化的條件、過程不斷簡化，機制逐步明朗，而且在疾病的治療方面也取得了顯著的進展。

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